CN104371935A - 一种博伊丁假丝酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种博伊丁假丝酵母,它的保藏编号为CGMCC9446,完整命名为博伊丁假丝酵母T1。本发明还进一步提供该博伊丁假丝酵母T1在催化合成阿托伐他汀中间体中的应用,具体为以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯为底物、催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯,该博伊丁假丝酵母可以表达高立体选择性的羰基还原酶,使6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯的转化率达到99%,产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的d.e.值达到100%。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用技术领域,具体涉及一种博伊丁假丝酵母,以及该博伊丁假丝酵母在催化合成阿托伐他汀中间体中的应用。
背景技术
阿托伐他汀是立普妥的活性成分,具有抑制低密度胆固醇(所谓的“坏胆固醇”)的产生、降低血液中低密度胆固醇含量的作用,在临床上对动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症和高胆固醇血症等心血管疾病的预防和治疗都具有重要意义,已成为世界上目前最畅销的调血脂类心血管疾病药物。
6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(简称ATS-7)是合成阿托伐他汀钙的关键手性中间体,传统的ATS-7化学合成法不仅使用硼烷类试剂和正丁基锂等昂贵的催化剂和有毒有害试剂,而且要在低于-60℃的条件下进行反应,再加上反应立体选择性低、副反应多,使得传统的ATS-7化学合成收率低、难度大,因此生产效率低、成本高。
生物催化不对称合成方法是要解决ATS-7生产问题的主要方法。生物催化不对称合成即利用提纯后的商品酶或微生物中的酶进行不对称还原,其中酶催化的不对称还原反应需要添加昂贵的辅酶;微生物催化的不对称还原反应是通过微生物全细胞中酶的立体选择性来实现,同时辅酶的循环由细胞自动完成,进行不对称还原反应时只需加入少量廉价的碳源(葡萄糖或者乙醇)作为辅助底物即可。生物催化因立体选择性强、获得产物的纯度较高、成本低廉、反应条件温和、操作安全、对环境的压力较小,在合成手性化合物中具有非常大的优势。但是筛选到具有高立体选择性的优良微生物菌株比较困难。
Codexis公司发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)羰基还原酶能够不对称还原(5R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯,得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-双羟基己酸叔丁酯(美国,公告号:US 0195465 A1,公告日2011年8月11日)。浙江工业大学发现,卡里比克毕赤酵母(Pichia caribbic ZJB-09225)能够细胞催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯,产物对映体过量值达99.5%以上(具有差向选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选和鉴定)。他们还发现,季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii X25)静息细胞可以不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。最佳催化条件为35℃、pH值7.0,在低底物转化率时,能够制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(具有非对映选择性还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选与鉴定)。
由于野生型微生物细胞含有多种醛/羰基还原酶,利用一些野生型微生物进行转化时很难获得单一光学纯的转化产物,因此限制了其在生产上的应用。目前已经有很多人通过构建工程菌来获得较高对映体过量值的产物。国外研究利用酿酒酵母(S.cerevisiae)的羰基还原酶基因ydl(Genbank ID:NP010159)构建了大肠杆菌基因工程菌,进行AST-7的生物制备研究,产物d.e.值大于99%(美国,公告号:WO 2008/042876 A2,公告日2008年4月10日)。国内研究人员分别利用季也蒙毕赤酵母(P.guilliermondii)的羰基还原酶基因cr3和葡萄糖脱氢酶基因gdh4成功构建了两种基因的工程菌,然后同时用两种菌进行AST-7的转化研究,转化率100%,产物d.e.值大于99.5%(羰基还原酶不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯)。研究者又利用羰基还原酶基因cr3和葡萄糖脱氢酶基因gdh4同时转入大肠杆菌中,构建了共表达菌株进行AST-7的制备研究,底物转化率可达99.0%,产物d.e.值大于99.5%(生物催化法合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯)。国内公司利用含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌制备重组酮还原酶,用于AST-7的制备研究,初步简化了生物转化工艺(中国,公告号:CN 102978249A,公告日2013年3月20日)。然而,使用表达外源蛋白的工程菌进行生物催化存在菌体的稳定性差、反应转化率有时不理想等问题,同时存在食品安全方面的隐患。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种博伊丁假丝酵母,该博伊丁假丝酵母可以表达高立体选择性的羰基还原酶,利用该菌株进行6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(ATS-6)的全细胞催化时,产物中6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)的对映体过量值(d.e.值)能达到100%。
本发明所采用的技术方案为:
一种博伊丁假丝酵母,其分类命名为博伊丁假丝酵母(Candida boidinii),完整命名为博伊丁假丝酵母T1,此菌株已于2014年7月11日保存在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为:CGMCC 9446。本发明博伊丁假丝酵母属半知菌亚门、不完全菌纲、苁梗孢目、隐球酵母科、假丝酵母属,在沙保培养基上,该博伊丁假丝酵母呈乳白色,柔软、光滑、湿润。
本发明还进一步提供上述博伊丁假丝酵母(保藏编号CGMCC 9446)在催化合成阿托伐他汀中间体中的应用,具体为在催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。利用该博伊丁假丝酵母可以不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯,生成高光学纯度的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
利用本发明博伊丁假丝酵母催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,包括以下步骤:
(1)菌体扩大培养:将博伊丁假丝酵母T1菌株接种于扩大培养基中进行扩大培养,接种比例为装液量的10%(体积分数),培养条件为30℃培养温度、200rpm转速、培养时间24h。
(2)催化反应:离心收集扩大培养后的菌体,重新悬浮于缓冲液中形成菌液,加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行反应。
(3)反应后分离产物:采用乙酸乙酯进行萃取,并对萃取液依次进行微滤膜过滤和旋蒸处理,收集得到无色油状液体,即为目的产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
所述步骤(2)中底物的浓度和菌液的浓度影响底物转化的速率,所述底物的浓度优选为5~10g/L,所述菌体的浓度最优选为25g/L;反应温度和反应时间同样影响产物的得率和反应速率,温度主要是影响菌体中酶的催化效率,优选为25~40℃,进一步优选为25~35℃,反应时间优选为1h~48h,进一步优选为10~30小时。
所述步骤(1)中扩大培养采用的培养基为液体扩大培养基,具体配方为:葡萄糖20.0g,酵母膏20.0g,NaCl0.5g,KH2PO42.5g,(NH4)2HPO42.5g,MgSO40.03g,6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯0.2%(体积分数),配制成1L溶液,pH值7.0。
所述步骤(2)中缓冲液为含10.0g/L葡萄糖的磷酸缓冲液(pH6.5,0.2M)。
与现有技术相比,本发明具有以下显著优点和有益效果:
本发明筛选获得的博伊丁假丝酵母T1菌株可以表达高立体选择性的羰基还原酶,利用本发明博伊丁假丝酵母菌在进行上述催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的不对称还原反应中,可以获得高光学纯度的产物,且底物的转化率高,解决传统野生菌株无法还原得到单一光学纯化合物、光学纯度较低等问题。
本发明博伊丁假丝酵母可以不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生成高光学纯度的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯,6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的转化率能达到99%,催化产物中6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的d.e.值能达到100%。
附图说明
图1所示为本发明实施例1中筛选得到的博伊丁假丝酵母T1菌株的18sRNA测序图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出,以下具体说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明,本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例所用的具体培养基配方如下:
富集培养基(g/L):葡萄糖50.0g、黄豆芽100.0g(称取100.0g黄豆芽,加水煮沸30min后纱布过滤)、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯22.8g,配制成1L溶液。
斜面培养基(g/L):葡萄糖50.0g、黄豆芽100.0g(称取100.0g黄豆芽,加水煮沸30min后纱布过滤)、琼脂20.0g,配制成1L溶液。
扩大培养基(g/L):葡萄糖20.0g、酵母膏20.0g、NaCl0.5g、KH2PO42.5g、(NH4)2HPO42.5g、MgSO40.03g、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯0.2%(体积分数),配制成1L溶液,pH值7.0。
实施例1:博伊丁假丝酵母菌株的获得
1、菌株的筛选
博伊丁假丝酵母(C.boidinii)野生菌株分离于(宁波天童国家森林公园)森林土,筛选方法为:称取1.0g土样(水样2mL),分散到10.0mL0.85%(质量浓度)生理盐水中,移取2.0mL土壤悬浮液接种至盛有28.0mL富集培养基的250mL摇瓶中,在28℃、150r/min的摇箱中振荡培养至培养基浑浊。移取2.0mL培养液接种至28.0mL无菌富集培养基中,在上述条件下培养至培养基浑浊。连续富集2次后稀释涂斜面培养基平板,30℃培养至长出清晰的单菌落,挑取单菌落接种至斜面培养基,30℃培养36h后于4℃冰箱中保存。
2、菌株的诱变选育
从新鲜的斜面培养基上挑取一环菌株接种液体种子培养基(葡萄糖20.0g、酵母膏20.0g、NaCl0.5g、KH2PO42.5g、(NH4)2HPO42.5g、MgSO40.03g,配制成1L溶液,pH值7.0。),在30℃摇床培养16h后制备菌悬液,然后采用紫外照射菌丝体悬液,紫外灯功率为15W,距离15cm,时间1min。照射后的菌体涂布含0.1~1.0%的6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的选择性培养基平板(培养基配方:葡萄糖20.0g、酵母膏20.0g、NaCl0.5g、KH2PO42.5g、(NH4)2HPO42.5g、MgSO40.03g、琼脂20.0g,配制成1L溶液,pH值7.0。),在30℃培养1~3天,挑取能在筛选平板上形成菌落的菌株进行培养和催化性能测定(即筛选可以还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为单一光学纯化合物的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯),挑取具有最优催化选择性的菌株T1作为目的菌种。
取筛选到的上述T1菌株培养液送于上海生工生物工程有限公司对菌株的保守序列18sRNA进行测序,测序结果如图1所示,显示筛选的菌株为假丝酵母属的博伊丁假丝酵母。菌株属半知菌亚门、不完全菌纲、苁梗孢目、隐球酵母科、假丝酵母属,在沙保培养基上,博伊丁假丝酵母呈乳白色,柔软、不透明、中间凸起、光滑、湿润的圆形菌落。
将上述筛选得到的博伊丁假丝酵母T1菌株送于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)进行生物保藏,保藏编号为CGMCC 9446,分类命名为博伊丁假丝酵母(Candida boidinii),完整命名为博伊丁假丝酵母T1,保藏日期为2014年7月11日。
实施例2:全细胞催化ATS-6制备ATS-7
1、催化过程和催化产物的收集
使用上述筛选得到的博伊丁假丝酵母T1菌株作为催化剂,催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(ATS-6)生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)。具体步骤如下:挑取一环诱变后保藏的博伊丁假丝酵母T1菌体接种至30mL液体扩大培养基,在温度为30℃、转速为200rpm的恒温振荡摇床上培养12h,然后按10%接种量接种至装液量为50mL的250mL摇瓶,在温度为30℃、转速为200rpm的恒温振荡摇床上培养24h。离心收集菌体并用无菌生理盐水洗涤2次。将供试菌株的湿菌体分散于10.0mL含10.0g/L葡萄糖的磷酸缓冲液(pH6.5,0.2M)中,加入6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(终质量浓度8g/L)。混匀后于28℃恒温摇箱中反应30h。转化液4000r/min离心6min,上清液过滤。取澄清滤液测定生成的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度和残余6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度。反应结束后,用等体积的萃取剂反萃取反应液两次,合并乙酸乙酯萃取液,经0.45μm微滤膜过滤收集有机相,在40℃进行减压旋蒸,回收乙酸乙酯,所得无色油状液体即为催化产物。
2、催化产物中ATS-7的含量和光学纯度测定
全细胞催化产物用乙醇溶解后采用HPLC检测来计算底物转化率和分析对映体过量值(d.e.值)。所用的高效液相色谱仪为Refractive index(RI)检测器,色谱柱为C-18HypersilBDS(250m x4.6mm x5fl)。检测条件为:柱温25℃,流动相0.25%(v/v)冰乙酸溶液(水:乙醇=80:20),流速1.0mL/min,进样量5μL。
结果表明,采用所述的全细胞催化方法,6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的转化率能达到99%,催化产物中6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的d.e.值能达到100%。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备,如无特别说明,均为符合微生物应用技术领域的市售产品。
以上所述,仅为本发明的优选实施例,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的核心技术的前提下,还可以做出改进和润饰,这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变,都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (10)
1.一种博伊丁假丝酵母,其特征在于:它的保藏编号为CGMCC9446,完整命名为博伊丁假丝酵母T1。
2.权利要求1所述的博伊丁假丝酵母T1在催化合成阿托伐他汀中间体中的应用。
3.根据权利要求2所述的博伊丁假丝酵母T1在催化合成阿托伐他汀中间体中的应用,其特征在于:具体为以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯为底物、催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
4.利用权利要求3所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将博伊丁假丝酵母T1菌株接种于扩大培养基中进行扩大培养;
(2)离心收集扩大培养后的菌体,重新悬浮于缓冲液中形成菌液,加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯进行反应,反应温度为25~40℃,反应时间为1~48h;
(3)反应结束后采用乙酸乙酯进行萃取,并对萃取液依次进行微滤膜过滤和旋蒸处理,收集得到无色油状液体,即为目的产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
5.根据权利要求4所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于:所述步骤(1)中扩大培养基的配方为葡萄糖20.0g、酵母膏20.0g、NaCl 0.5g、KH2PO4 2.5g、(NH4)2HPO4 2.5g、MgSO4 0.03g、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯0.2%体积分数,配制成1L溶液,pH值7.0。
6.根据权利要求4所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于:所述步骤(1)中博伊丁假丝酵母T1接种于扩大培养基的接种比例为体积分数10%,培养条件为培养温度30℃、转速200rpm、培养时间24h。
7.根据权利要求4所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于:所述步骤(2)中缓冲液为含10.0g/L葡萄糖的磷酸缓冲液。
8.根据权利要求4所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于:所述步骤(2)中菌体悬浮于缓冲液后形成的菌液的浓度为25g/L。
9.根据权利要求4所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于:所述步骤(2)中底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基已酸叔丁酯的浓度为5~10g/L。
10.根据权利要求4所述的博伊丁假丝酵母T1催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法,其特征在于:所述步骤(2)中反应温度为25~35℃,反应时间为10~30h。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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