CN104364375A - 结合流感病毒的核酸分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供可应用于流感病毒检测的核酸分子。根据本发明的核酸分子是结合流感病毒的核酸分子,包括选自以下多核苷酸(a)-(d)组成的组的至少一个多核苷酸:(a)具有SEQ ID NO:1-30的任一碱基序列的多核苷酸;(b)具有通过多核苷酸(a)的任一碱基序列中一个或多个碱基的删除、置换、插入和/或添加获得的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;(c)具有与多核苷酸(a)的任一碱基序列具有至少80%的同一性的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;和(d)具有与在严格条件下与多核苷酸(a)的任一碱基序列杂交的多核苷酸互补的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及结合流感病毒的核酸分子及其用途。
背景技术
季节性流感病毒和新型流感病毒感染的扩散已在近年中观察到,因而流感病毒检测变得越来越重要。
在流感病毒检测中,已经采用了例如利用基因扩增的方法或使用抗体的方法。前者是其中样品中的核酸进行PCR等以扩增流感病毒独有的碱基序列的方法且流感病毒感染的存在或不存在根据扩增是否发生而确定。但是,为了完成基因扩增,有必要例如预处理从人体收集的样品,这是费时和费力的。而且,还存在由于类似序列的扩增等导致的假阳性误差的问题。
另一方面,抗体具有例如其制备本身是非常复杂的操作和需要高成本的问题。抗体也具有涉及检测精度的问题,因为存在与靶抗原之外的抗原非特异性结合的可能性。考虑到这些问题,在近年中,特异性结合抗原的核酸分子作为抗体的替代物受到关注(非专利文献1和2)。但是,先前报告的与流感病毒结合的核酸分子具有不足的结合能力。因此,新型核酸分子是需要的。
引文列表
非专利文献
[非专利文献1]Jeon等,J.Biol Chem.2004279(46),48410-48419
[非专利文献2]Cheng等,Biochem Biophys Res Commun.2008366(3),670-674
发明简述
本发明解决的问题
考虑到前述问题,本发明的目的是提供一种可用于流感病毒的检测等的核酸分子。
解决问题的方式
本发明提供一种结合流感病毒的核酸分子,包括选自以下多核苷酸(a)-(d)组成的组的至少一个多核苷酸:
(a)具有SEQ ID NO:1-30的任一碱基序列的多核苷酸;
(b)具有通过多核苷酸(a)的任一碱基序列中一个或多个碱基的删除、置换、插入和/或添加获得的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;
(c)与多核苷酸(a)的任一碱基序列具有至少80%的同一性的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;和
(d)具有与在严格条件下与多核苷酸(a)的任一碱基序列杂交的多核苷酸互补的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸。
本发明还提供结合流感病毒的结合剂,其包含根据本发明的核酸分子。
本发明的效果
根据本发明的核酸分子可以结合流感病毒,且因此可以例如检测流感病毒。因此,根据本发明的核酸分子可以是例如用于在临床实践、畜牧学等领域中检测流感病毒的非常有用的工具。
附图简要说明
[图1]图1是显示本发明多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图2]图2是显示本发明中的其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图3]图3是显示本发明中的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图4]图4是显示本发明的实施例A1中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图5]图5是显示本发明的实施例A1中核酸分子与抗体的结合能力的图表。
[图6]图6是显示本发明的实施例A4中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图7]图7是显示本发明的实施例A4中核酸分子与抗体的结合能力的图表。
[图8]图8是显示本发明的实施例A6中各核酸分子、各HA和各抗体的结合能力的图表。
[图9]图9是显示本发明的实施例B1中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图10]图10是显示本发明的实施例B2中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图11]图11是显示本发明的实施例B3中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图12]图12是显示本发明的实施例B4中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的曲线图。
[图13]图13是显示本发明的实施例B5中核酸分子与一种靶蛋白质的结合能力的图表。
[图14]图14是显示本发明的实施例B5中核酸分子与多种靶蛋白质的结合能力的图表。
[图15]图15是显示本发明的实施例B6中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的曲线图。
[图16]图16是显示本发明的实施例B7中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图17]图17是显示本发明的实施例C1中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图18]图18是显示本发明的实施例C2中核酸分子与靶蛋白质的结合能力的图表。
[图19]图19是显示本发明的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图20]图20是显示本发明的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图21]图21是显示本发明的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图22]图22是显示本发明的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图23]图23是显示本发明的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图24]图24是显示本发明的再其它多核苷酸的预测的二级结构的示意图。
[图25]图25是显示本发明的实施例D1中核酸分子与流感病毒的结合能力的曲线图。
[图26]图26是显示本发明的实施例D1中核酸分子与流感病毒的结合能力的图表。
[图27]图27是显示本发明的实施例D2中核酸分子与流感病毒的结合能力的图表。
实施本发明的方式
如上所述,本发明的核酸分子是结合流感病毒的核酸分子,包括选自以下多核苷酸(a)-(d)组成的组的至少一个多核苷酸:
(a)具有SEQ ID NO:1-30的任一碱基序列的多核苷酸;
(b)具有通过多核苷酸(a)的任一碱基序列中一个或多个碱基的删除、置换、插入和/或添加获得的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;
(c)与多核苷酸(a)的任一碱基序列具有至少80%的同一性的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;和
(d)具有与在严格条件下与多核苷酸(a)的任一碱基序列杂交的多核苷酸互补的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸。
在本发明中,“结合流感病毒(及其语法变型)”也称作,例如,“具有与流感病毒的结合能力”或“具有与流感病毒的结合活性”。本发明的核酸分子与流感病毒之间的结合可以通过例如表面等离子体共振(SPR)分析等测定。该分析可以使用例如ProteON(商标名,BioRad)完成。
本发明适用的流感病毒的类型没有任何限制。流感病毒的实例包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。甲型流感病毒具有由16个类型的血细胞凝集素(HA)(H1至H16)和9个类型的神经氨酸酶(NA)(N1至N9)的组合产生的144种亚型,且对于本发明适用的亚型没有特别的限制。特别地,它可以是例如H5N1、H1N1或H3N2。更具体地,H5N1的实例包括A/Anhui/1/2005和A/goose_Guiyang/337/2006、A/Japanese white eye/Hong Kong/1038/2006;H1N1的实例包括A/California/04/2009、A/Brisbane/59/2007和A/Georgia/20/2006;且H3N2的实例包括A/Aichi/2/1968、A/Wisconsin/67/2005、A/Brisbane/59/2007和A/Moscow/10/1999。在乙型流感病毒中,仅存在1个HA类型和1个NA类型的组合。乙型流感病毒的实例包括B/Florida/4/2006和B/Malaysia/2506/2004。
本发明的核酸分子可以结合例如流感病毒来源的血细胞凝集素(HA)。更具体地,本发明的核酸分子可以结合例如HA、作为HA的亚基的HA1及HA1和H2的复合物。在本发明中,“结合流感病毒来源的HA(及其语法变型)”也称作例如“具有与HA的结合能力”或“具有与HA的结合活性”。本发明的核酸分子和HA之间的结合可以通过与如上所述相同的分析测定。HA所来源的流感病毒没有特别限制,且其实例包括上述的流感病毒。在本发明中,“结合流感病毒(及其语法变型)”在下文中应解释为可与例如“结合流感病毒来源的HA”互换。
在本发明的核酸分子中,多核苷酸(a)-(b)的结构单元是例如核苷酸残基,其实例包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。例如,多核苷酸是由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA或包括核糖核苷酸残基的DNA,这两者可以进一步包括例如如以下所述的非核苷酸残基。根据本发明的核酸以下也称作例如“DNA适体”。
根据本发明的核酸分子可以例如由多核苷酸(a)-(d)中任一个组成或可以包括多核苷酸(a)-(d)中的任一个。在后一情况中,本发明的核酸分子可以包括例如选自多核苷酸(a)-(d)的两个或更多个多核苷酸,如下所述。所述的两个或更多个多核苷酸可以具有相同的序列或不同的序列。而且,在后一情况中,本发明的核酸分子可以进一步包括例如接头和/或另外的序列。
多核苷酸(a)具有SEQ ID NO:1-30的任一碱基序列。
RHA0023(SEQ ID NO:1)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACCTTGGGGTCTTTGGGTGGGGTTGGTGTGGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0030(SEQ ID NO:2)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACGGTCTCGGCTCGGTTCTTTCGGAAATGTTGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0013(SEQ ID NO:3)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACGGGTTTCGACTTGATCGGACTTAAGCACCGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0009(SEQ ID NO:4)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACGGGTGGTTGGGGGGGCCTTTTCTGGTTTTGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0058(SEQ ID NO:5)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCTCGGCTTGGTTCGTCTGCGAAATGTTACTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0099(SEQ ID NO:6)
CCTGCACCCAGTGTCCCACACGTGTATGGGTTTTTTATGGTTAGGTAGGGGCGGCTTGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0110(SEQ ID NO:7)
CCTGCACCCAGTGTCCCCGGCGTTTGGTTGGCGTGAACCATTTTTAAGTTCTGCGTGTGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0098(SEQ ID NO:8)
CCTGCACCCAGTGTCCCGTCGTTGGTGTTTTTTTGGCTTTTAGGGTAGGTGTGGCTTGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0144(SEQ ID NO:9)
CCTGCACCCAGTGTCCCTCGCTTCTTTTTTTGGGTTGGGGTGGGCGGGTTCCTGTCGGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0133(SEQ ID NO:10)
CCTGCACCCAGTGTCCCCCTCTGTGTCGGGCGGGCCGTTCAGGGTTTTGGGTGGGGGTGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0020(SEQ ID NO:11)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACCTGTGTTGGGGGTGGGAGGGTTTTTGGGGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0002(SEQ ID NO:12)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGGGTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0002_s16(SEQ ID NO:13)
GGTTTGGTCTGGTTGG
RHA0002_s20(SEQ ID NO:14)
GTGGTTTGGTCTGGTTGGAC
RHA0002_s26(SEQ ID NO:15)
CGTTTGGTTTGGTCTGGTTGGCAACG
RHA0002_s28(SEQ ID NO:16)
CGTTATGGTTTGGTCTGGTTGGCTAACG
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
RHA0006(SEQ ID NO:18)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGTGTGTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0006_s19(SEQ ID NO:19)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA1634(SEQ ID NO:20)
ATATATATGCCCACCCTCTCGCTGTACGGTTGATGCGCGTTTCTTTCTCTTTATATTGCTGGGTGCCGCCTCCAAGGTCAAAAAAAA
RHA1634_s60(SEQ ID NO:21)
GGGCACCCTCTCGCTGTACGGTTGATGCACGTTTCTTTCTCTTTATATTGCTGGGTGCCC
RHA1635(SEQ ID NO:22)
ATATATATGCCCACCCTCTCGCTGGCGGCTCTGTTCTGTTCTCGTCTCCTTGATTTCTGTGGGCAGCCGCCTCCAAGGTCAAAAAAAA
RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)
GGGGCCCACCCTCTCGCTGGCGGCTCTGTTCTGTTCTCGTCTCCTTGATTTCTGTGGGCCCC
RHA0385(SEQ ID NO:24)
ATATATATCCTGCACCCAGTGTCCCGTGTGCAATTCAGTTGGGGTTATTTTGGGAGGGCGGGGGTTGACGGAGAGGAGGACGGAAAAAAAA
RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)
TTGGGGTTATTTTGGGAGGGCGGGGGTT
RHA0471(SEQ ID NO:26)
CTGCACCCAGTGTCCCTTTCCTCGTTGGGGGTGGTGGTGGGTTTCGGTTCATGGGTGGGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0471_s51(SEQ ID NO:27)
TCCTCGTTGGGGGTGGTGGTGGGTTTCGGTTCATGGGTGGGACGGAGAGGA
RHA0111(SEQ ID NO:28)
CCTGCACCCAGTGTCCCGTGCTCCGGGGGTTGGGCGTGGTGGGTCTGTCGGGTTTCGGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0127(SEQ ID NO:29)
CCTGCACCCAGTGTCCCTGGGTCGGCTAATTTGGCATTTGGGGTGGTTTGGGGGGGGGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0124(SEQ ID NO:30)
CCTGCACCCAGTGTCCCTGTGTGCTGGTGTGGGGTGGTTTGGGGGGGGGACGGAGAGGAGGACGG
关于多核苷酸(b),术语“一个或多个”没有限制,只要例如它属于其中多核苷酸(b)结合流感病毒或HA的范围。多核苷酸(a)的任一碱基序列中的“一个或多个”碱基是例如1-60个碱基,优选1-30个碱基,更优选1-15个碱基,还更优选1-5个碱基,且特别优选1或2个碱基。
关于多核苷酸(c),“同一性”没有限制,只要例如它属于其中多核苷酸(c)结合流感病毒或HA的范围。同一性是例如至少80%或至少85%,优选至少90%,更优选至少95%,至少96%或至少97%,还更优选至少98%,且特别优选至少99%。同一性可以例如用分析软件如BLAST或FASTA采用默认参数来计算(这也应用于下文)。
关于多核苷酸(d),“与…杂交的多核苷酸”是例如与多核苷酸(a)完全或部分互补的多核苷酸。杂交可以例如通过各种不同杂交分析检测。杂交分析没有特别限制,且例如可以采用在Sambrook等编辑的“Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.”(Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))等中描述的方法。
关于多核苷酸(d),“严格条件”可以是例如低严格条件、中等严格条件和高严格条件中的任何一种。“低严格条件”是例如5×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,50%甲酰胺和32℃。“中等严格条件”是例如5×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,50%甲酰胺和42℃。“高严格条件”是例如5×SSC,5×Denhardt’s溶液,0.5%SDS,及50%甲酰胺和50℃。本领域技术人员可以通过例如适当地设置如温度、盐浓度、探针的浓度和长度、离子强度、时间等的条件来设定严格性程度。作为“严格条件”,可以采用例如Sambrook等编辑的“MolecularCloning:A Laboratory Manual 2nd Ed.”(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))中描述的条件或以上描述的类似条件。
多核苷酸(b)-(d)没有特别的限制。当多核苷酸(a)具有SEQ ID NO:12(RHA0002)的碱基序列时,多核苷酸(b)-(d)可以是例如具有SEQ ID NO:13-17的碱基序列的多核苷酸。当多核苷酸(a)具有SEQ ID NO:17(RHA0002_s33)的碱基序列时,多核苷酸(b)-(d)可以是例如具有SEQ IDNO:13-16的碱基序列的多核苷酸。
RHA0002_s16(SEQ ID NO:13)
GGTTTGGTCTGGTTGG
RHA0002_s20(SEQ ID NO:14)
GTGGTTTGGTCTGGTTGGAC
RHA0002_s26(SEQ ID NO:15)
CGTTTGGTTTGGTCTGGTTGGCAACG
RHA0002_s28(SEQ ID NO:16)
CGTTATGGTTTGGTCTGGTTGGCTAACG
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
根据本发明的核酸分子可以包括例如选自多核苷酸(a)-(d)的一个序列或选自多核苷酸(a)-(d)的多个序列。在后一情况中,所述多个多核苷酸序列优选彼此连接以形成单链多核苷酸。多个多核苷酸序列可以直接地彼此连接,或可以例如利用存在于各对相邻多核苷酸序列之间的接头间接地彼此连接。多核苷酸序列优选在其末端直接或间接地彼此连接。多个多核苷酸序列例如可以彼此相同或不同。优选地,多个多核苷酸序列例如是相同的。当本发明的核酸分子包括多个多核苷酸序列时,序列的数目没有特别限制,且是例如2个或更多,优选2-20个,更优选2-10个,且还更优选2个或3个。
接头没有特别限制。接头的长度没有特别限制,且是例如1-200聚体,优选1-20聚体,更优选3-12聚体,且还更优选5-9聚体。接头的结构单元是例如核苷酸残基,其实例包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。接头没有特别限制,且其实例包括多核苷酸如由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA和包括核糖核苷酸残基的DNA。接头的特定实例包括聚脱氧胸苷(聚(dT))、聚脱氧腺苷(聚(dA))及具有由A和T构成的重复序列的聚(dA-dT)。优选地,接头是聚(dT)或聚(dA-dT)。
包括选自多核苷酸(a)-(d)的两个序列的单链多核苷酸的实例包括含有经由接头彼此连接的SEQ ID NO:19(RHA0006_s19)或SEQ ID NO:17(RHA0002_s33)的两个碱基序列的多核苷酸。该单链多核苷酸的序列的实例在以下显示为SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:45。在以下序列中,下划线的部分各自对应于SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:33的序列,且存在于该序列之间的序列-(N)n-对应于接头。N指示核苷酸残基。核苷酸残基N没有特别限制。核苷酸残基N是例如核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基,且优选是脱氧核糖核苷酸残基。核苷酸残基中的碱基没有特别限制,且是例如A、G、C、T和/或U。在以下序列中,n是表示核苷酸残基中碱基数目的整数。优选地,n是正整数,且是例如1-200个碱基,优选5-20个碱基。
RHA0006_s19_d(SEQ ID NO:31)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGG-(N)n-GGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0002_s33_d(SEQ ID NO:45)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC-(N)n-GTGTTT GATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
SEQ ID NO:31的特定实例包括以下序列,其中例如n=5,n=9和n=20。
RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGT TGGG
RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0006_s19_d9_AT(SEQ ID NO:46)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGATATATATAGGGTTTGGGTTGGGT TGGG
RHA0006_s19_d_R20(SEQ ID NO:47)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGGATTGGAATTAAGGCGTGTGGGG TTTGGGTTGGGTTGGG
SEQ ID NO:45的特定实例包括以下序列,其中例如n=9和n=5。
RHA0002_s33_d9(SEQ ID NO:48)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACTTTTTTTTTGT GTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
RHA0002_s33_d5(SEQ ID NO:49)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACTTTTTGTGTTT GATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
包括选自多核苷酸(a)-(d)的三个序列的单链多核苷酸的实例包括含有经由接头彼此连接的SEQ ID NO:19(RHA0006_s19)的三个碱基序列的多核苷酸。该单链多核苷酸的序列的实例以下显示为SEQ ID NO:50。在以下序列中,加下划线的部分各自对应于SEQ ID NO:19的序列,且该序列之间的序列-(N)n-各自对应于接头。N和n如上所述。在以下序列中,两个接头的序列可以例如彼此相同或不同。
RHA0006_s19_t(SEQ ID NO:50)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGG-(N)n-GGGTTTGGGTTGGGTTGGG-(N)n-GGGTTTGGGTTGGGTTGGG
SEQ ID NO:50的特定实例包括以下序列,其中例如n=9。
RHA0006_s19_t9(SEQ ID NO:51)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGT TGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGG
在本发明的核酸分子中,多核苷酸优选是单链多核苷酸。优选的是单链多核苷酸可以例如通过自身退火形成茎结构和环结构。优选的是多核苷酸可以例如形成茎-环结构、内环结构和/或凸出结构。
本发明的核酸分子可以例如是双链。当核酸分子是双链时,例如,单链多核苷酸之一包括多核苷酸(a)-(d)中任一个且另一单链多核苷酸没有限制。该另一单链多核苷酸可以例如是包括与多核苷酸(a)-(d)中任一个互补的碱基序列的多核苷酸。当本发明的核酸分子是双链时,优选的是例如在使用前通过变性等使双链解离成单链多核苷酸。而且,优选的是包括多核苷酸(a)-(d)中任一个的解离的单链多核苷酸例如形成如上所述的茎结构和环结构。
在本发明中,表述“可以形成茎结构和环结构(及其语法变型)”包括例如实际形成茎结构和环结构,以及即使未形成茎结构和环结构,它们可以根据不同情况形成。表述“可以形成茎结构和环结构(及其语法变型)”包括例如其中其形成已经通过试验确认的情况和其中其形成使用计算机等通过模拟预测的情况。
预测的多核苷酸二级结构显示于图1-3和图19-24中。但是,需要注意的是本发明不限于此。图1显示RHA0002(SEQ ID NO:12)、RHA0002_s16(SEQ ID NO:13)、RHA0002_s20(SEQ ID NO:14)、RHA0002_s26(SEQ ID NO:15)、RHA0002_s28(SEQ ID NO:16)和RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)的预测的二级结构。图2显示RHA0006(SEQ ID NO:18)、RHA0006_s19(SEQ ID NO:19)和RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)的预测的二级结构,其中接头是由9个碱基组成的聚(dT)。图3显示RHA0020(SEQ ID NO:11)、RHA0111(SEQ ID NO:28)、RHA0127(SEQ ID NO:29)和RHA0124(SEQ ID NO:30)的预测的二级结构。
图19显示RHA0023(SEQ ID NO:1)、RHA0030(SEQ ID NO:2)、RHA0013(SEQ ID NO:3)和RHA0009(SEQ ID NO:4)的预测的二级结构。图20显示RHA0058(SEQ ID NO:5)、RHA0099(SEQ ID NO:6)、RHA0110(SEQ ID NO:7)和RHA0098(SEQ ID NO:8)的预测的二级结构。图21显示RHA0144(SEQ ID NO:9)、RHA0133(SEQ ID NO:10)、RHA0002_s33_d9(SEQ ID NO:48)和RHA0006_s19_d9_AT(SEQ ID NO:46)的预测的二级结构。图22显示RHA0006_s19_d_R20(SEQ ID NO:47)、RHA0006_s19_t9(SEQ ID NO:51)、RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)和RHA1634(SEQ ID NO:20)的预测的二级结构。图23显示RHA1634_s60(SEQ ID NO:21)、RHA1635(SEQ ID NO:22)、RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)和RHA0385(SEQ ID NO:24)的预测的二级结构。图24显示RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)、RHA0471(SEQ IDNO:26)和RHA0471_s51(SEQ ID NO:27)的预测的二级结构。
本发明核酸分子的结构单元是例如核苷酸残基。核苷酸残基的实例包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。本发明核酸分子的实例包括仅由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA和包括一个或多个核糖核苷酸残基的DNA。在后一情况中,“一个或多个”没有特别限制。例如,多核苷酸中核糖核苷酸残基的数目是例如1-91,优选1-30,更优选1-15,还更优选1-7,特别优选1-3,且最优选1或2。
本发明的核酸分子可以包括例如一个或多个修饰的核苷酸残基。术语“一个或多个”没有特别限制。例如,多核苷酸中修饰的核苷酸残基的数目是例如1-91,优选1-30,更优选1-15,还更优选1-7,特别优选1-3,且最优选1或2。
修饰的核苷酸残基的实例包括修饰的脱氧核糖核苷酸残基和修饰的核糖核苷酸残基。修饰的核苷酸残基可以是例如具有修饰的糖残基的上述核苷酸残基。所述糖残基的实例包括核糖残基和脱氧核糖残基。核苷酸残基中的修饰位点没有特别限制,且可以是例如糖残基中的2’-位和/或4’-位。修饰的实例包括甲基化、氟化、胺化和硫杂化。修饰的核苷酸残基可以是例如通过具有嘧啶碱基(嘧啶核心)作为碱基的核苷酸残基的修饰获得的核苷酸残基或通过具有嘌呤碱基(嘌呤核心)作为碱基的核苷酸残基的修饰获得的核苷酸残基。其中,前者是优选的。在下文中,具有嘧啶碱基的核苷酸残基称为“嘧啶核苷酸残基”;经过修饰的嘧啶核苷酸残基称为“修饰的嘧啶核苷酸残基”;具有嘌呤碱基的核苷酸残基称为“嘌呤核苷酸残基”;且经过修饰的嘌呤核苷酸残基称为“修饰的嘌呤核苷酸残基”。嘧啶核苷酸残基的实例包括:具有尿嘧啶的尿嘧啶核苷酸残基;具有胞嘧啶的胞嘧啶核苷酸残基;和具有胸腺嘧啶的胸腺嘧啶核苷酸残基。在其中修饰的核苷酸残基中的碱基是嘧啶碱基的情况中,例如,优选的是糖残基中的2’-位和/或4’-位的碳被修饰。修饰的核苷酸残基的特定实例包括核糖残基中的2’-位被修饰的修饰核苷酸残基,如2’-甲基化的尿嘧啶核苷酸残基、2’-甲基化的胞嘧啶核苷酸残基、2’-氟化的尿嘧啶核苷酸残基、2’-氟化的胞嘧啶核苷酸残基、2’-胺化的尿嘧啶核苷酸残基、2’-胺化的胞嘧啶核苷酸残基、2’-硫杂化的尿嘧啶核苷酸残基和2’-硫杂化的胞嘧啶核苷酸残基。
核苷酸残基中的碱基可以是例如天然碱基(非人工碱基)如腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u),或者是非天然碱基(人工碱基)。人工碱基的实例包括修饰的碱基和改变的碱基,这两者优选具有与天然碱基(a、c、g、t或u)相似的功能。具有相似功能的人工碱基的实例包括:作为鸟嘌呤(g)的替代可以结合胞嘧啶(c)的人工碱基、作为胞嘧啶(c)的替代可以结合鸟嘌呤(g)的人工碱基、作为腺嘌呤(a)的替代可以结合胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)的人工碱基、作为胸腺嘧啶(t)的替代可以结合腺嘌呤(a)的人工碱基和作为尿嘧啶(u)的替代可以结合腺嘌呤(a)的人工碱基。修饰的碱基的实例包括甲基化的碱基、氟化的碱基、胺化的碱基和硫杂化的碱基。修饰的碱基的特定实例包括2’-甲基尿嘧啶、2’-甲基胞嘧啶、2’-氟尿嘧啶、2’-氟胞嘧啶、2’-氨基尿嘧啶、2’-氨基胞嘧啶、2’-硫尿嘧啶和2’-硫胞嘧啶。在本发明中,例如,a、g、c、t和u代表的碱基不仅包括天然碱基,而且包括具有与天然碱基相似的功能的人工碱基。
本发明的核酸分子可以包括例如一个或多个人工核酸单体残基。术语“一个或多个”没有特别限制。例如,多核苷酸中人工核酸单体残基的数目是例如1-91,优选1-30,更优选1-15,还更优选1-7,特别优选1-3,且最优选1或2。人工核酸单体残基的实例包括PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)和ENA(2’-O,4’-C-亚乙基桥接的核酸)。核酸中的单体残基例如如上所述。
优选的是本发明的核酸分子例如对于核酸酶是抗性的。为了使得核酸分子具有核酸酶抗性,优选的是本发明的核酸分子包括例如修饰的核苷酸残基和/或人工核酸单体残基。而且,为了使得核酸分子具有核酸酶抗性,本发明的核酸分子可以具有结合到例如其5’末端或3’末端的数十kDa的PEG(聚乙二醇)、脱氧胸苷等。
本发明的核酸分子可以进一步包括例如附加的序列。优选地,附加的序列结合到例如核酸分子的5’末端和3’末端的至少一个,更优选结合到核酸分子的3’末端。附加的序列没有特别的限制。附加的序列的长度没有特别的限制,且是例如1-200聚体、优选1-50聚体、更优选1-25聚体和还更优选18-24聚体。附加序列的结构单元是例如核苷酸残基,其实例包括脱氧核糖核苷酸残基和核糖核苷酸残基。附加的序列没有特别限制,且其实例包括多核苷酸如由脱氧核糖核苷酸残基组成的DNA和包括核糖核苷酸残基的DNA。附加序列的特定实例包括聚(dT)和聚(dA),且附加的序列优选是聚(dT)或聚(dA)。
本发明的核酸分子可以例如以其固定在载体上的状态使用。优选例如固定本发明核酸分子的5’末端或3’末端,更优选3’末端。当本发明的核酸分子被固定时,核酸分子可以例如直接或间接固定在载体上。在后一情况中,优选例如通过附加的序列固定核酸分子。用于固定核酸分子的方法没有特别限制。例如,抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白结合于载体和核酸分子/附加的序列中的任一个,且生物素结合于另一个。通过利用前者和后者之间的结合,可以实现固定。载体没有特别限制,且可以是例如基底如板、片、膜、滤器、管或珠。
用于产生本发明的核酸分子的方法没有特别限制。例如,本发明的核酸分子可以通过已知方法合成,如利用化学合成的核酸合成方法等和利用遗传工程的方法。
本发明的核酸分子针对流感病毒或HA的解离常数是例如30nmol/L或更低,优选10nmol/L或更低,更优选1nmol/L或更低,还更优选0.1nmol/L或更低,且特别优选0.01nmol/L或更低。
本发明的核酸分子显示与流感病毒或流感病毒来源的HA的结合性能,如上所述。因此,本发明核酸分子的用途没有特别限制,只要它是利用与流感病毒和HA的结合性能的用途。本发明的核酸分子可以例如作为抗流感病毒和HA的抗体的替代用于各种方法中。
根据本发明的核酸分子,例如,有可能通过检测核酸分子和流感病毒之间的结合进行分析,例如针对流感病毒的定性或定量。即,根据本发明的用于分析流感病毒的方法特征在于其包括以下步骤:使本发明的核酸分子与样品接触;和检测核酸分子与流感病毒之间的结合。更具体地,例如,样品中流感病毒的存在或不存在可以通过在检测步骤中检测核酸分子与流感病毒之间的结合的存在或不存在进行分析,或者样品中流感病毒的量可以通过测量样品中核酸分子与流感病毒之间的结合的量进行分析。按照这一方法,例如,因为本发明的核酸分子可以结合流感病毒,样品中的流感病毒可以进行分析而无需对样品进行预处理以例如破坏病毒。
而且,按照本发明的核酸分子,有可能例如通过检测核酸分子与来源于流感病毒的HA之间的结合进行分析,例如针对HA或间接地针对流感病毒的定性或定量。即,根据本发明的用于分析流感病毒来源的HA的方法特征在于其包括以下步骤:使本发明的核酸分子与样品接触;和检测核酸分子与HA之间的结合。更具体地,在这一分析方法中,样品中HA的存在或不存在可以通过在检测步骤中检测核酸分子与HA之间的结合的存在或不存在进行分析,或者样品中HA的量可以通过测量样品中核酸分子与HA之间的结合的量进行分析。此外,也可能通过利用这一HA检测方法完成流感病毒的检测。根据本发明的流感病毒检测方法包括例如上述的HA分析方法,且其通过检测核酸分子与HA之间的结合分析样品中的流感病毒。更具体地,样品中流感病毒的存在或不存在可以通过在检测步骤中检测核酸分子与HA之间的结合的存在或不存在进行分析,或者样品中流感病毒的量可以通过测量样品中核酸分子与HA之间的结合的量进行分析。HA的量和流感病毒的量一般处于相关的关系。因此,例如,通过预先确定流感病毒的量与HA的量之间的相关关系,流感病毒的量可以基于如此确定的相关关系从HA的量进行分析。例如,相关关系可以用校准曲线等表示。在这一方法的情况中,例如,核酸分子可以在样品已经历破坏病毒的预处理后与样品接触,或者核酸分子可以与样品接触而不进行预处理。
本发明的核酸分子可以如上所述结合流感病毒。因此,本发明的核酸分子可以广泛地用于例如不仅上述流感病毒检测和HA检测,而且可以用于利用其结合的各种应用。这种应用的特定实例包括包含核酸分子的产品,如过滤器、面具、擦拭剂、含漱剂和锭剂。过滤器的实例包括空气过滤器和液体过滤器。过滤器中的核酸分子结合流感病毒。因此,过滤器可以例如从空气和液体除去流感病毒并可以防止流感病毒的扩散。面具可以防止流感病毒的感染,因为核酸分子结合流感病毒以抑制流感病毒侵入到身体中。例如,擦拭剂可以从使用该擦拭剂擦拭的物体除去流感病毒,因为核酸分子结合流感病毒。例如,含漱剂可以除去与附着于口腔和咽喉的流感病毒,因为核酸分子结合流感病毒。
<结合剂>
如上所述,根据本发明的结合剂是结合流感病毒的结合剂,其特征在于它包含本发明的核酸分子。仅必要的是根据本发明的结合剂包含根据本发明的核酸分子,且其它配置没有任何限制。通过使用本发明的结合剂,例如,如上所述,流感病毒的检测等是可能的。而且,如上所述,本发明的结合剂也可以称为例如结合流感病毒来源的HA的结合剂,且有可能例如通过检测HA来检测流感病毒。
实施例
接下来,将描述本发明的实施例。但是应注意到,本发明并不受以下实施例的限制。实施例中商购可得的试剂按照其方案使用,除非另有说明。
[实施例A1]
制备能够结合流感病毒的适体,且检验各适体与流感病毒来源的HA的结合能力。
(1)适体
作为本实施例的适体,合成了以下多核苷酸。
RHA0002(SEQ ID NO:12)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGGGTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0006(SEQ ID NO:18)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGTGTGTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0111(SEQ ID NO:28)
CCTGCACCCAGTGTCCCGTGCTCCGGGGGTTGGGCGTGGTGGGTCTGTCGGGTTTCGGACGGAGAGGAGGACGG
RHA0127(SEQ ID NO:29)
CCTGCACCCAGTGTCCCTGGGTCGGCTAATTTGGCATTTGGGGTGGTTTGGGGGGGGGACGGAGAGGAGGACGG
制备了包含多个DNA的DNA文库作为对比实施例N30,各DNA由SEQ ID NO:34表示的寡核苷酸(其包括30-聚体的随机序列(N)30)组成。而且,提供了包含多个DNA的DNA文库作为对比实施例N40,其中各DNA由SEQ ID NO:35表示的寡核苷酸(其包括40-聚体的随机序列(N)40)组成。在以下序列中,“N”代表脱氧核糖核苷酸残基,且其中包含的核苷酸是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和/或胸腺嘧啶。
N30(SEQ ID NO:34)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAAC-(N)30-CTTAACACACGGCGGCTGTAG
N40(SEQ ID NO:35)
ACCCAGTGTCCC-(N)40-GACGGAGAGGAGGACGG
作为按照对比实施例的适体A10,合成了非专利文献2(BBRC)中描述的具有以下序列的多核苷酸。
适体A10(SEQ ID NO:52)
GAATTCAGTCGGACAGCGGGGTTCCCATGCGGATGTTATAAAGCAGTCGCTTATAAGGGATGGACGAATATCGTCTCCC
向各上述适体的3’末端添加24-聚体的聚脱氧腺苷(聚(dA))。如此获得的添加聚(dA)的适体用于如下所述的SPR中。
(2)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用以下蛋白质。A/Anhui/1/2005来源的HA1和A/goose_Guiyang/337/2006来源的HA1由437个氨基酸残基构成,且437个氨基酸残基中的24个氨基酸残基彼此不同(5.49%)。在SEQ ID NO:36和37中,不同的氨基酸加下划线。在A/Anhui/1/2005来源的HA的SEQID NO:38中,不同于A/goose_Guiyang/337/2006来源的HA中的氨基酸的那些氨基酸加下划线。
BSA
牛血清白蛋白
Nippon Gene Co.,Ltd.
His-MIF
具有添加的组氨酸标签的MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)
ATGen Co.,Ltd.Gyeonggi-do
HA1Anhui
A/Anhui/1/2005来源的HA1
Sino Biological Inc.(#11048-V08H2)
SEQ ID NO:36
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSP
HA1Guiyang
A/goose_Guiyang/337/2006来源的HA1
Sino Biological Inc.(#11690-V08H1)
SEQ ID NO:37
MEKIVLLLAIISLVKSDQICIGYHANNSTVQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCSLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKASPANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWPNHEASLGVSSACPYQGESSFFRNVVWLIKKNSSYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQIKLYQNPNTYISVGTSTLNQRLVPTIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNTL
HAAnhui
A/Anhui/1/2005来源的HA
Sino Biological Inc.(#11048-V08H1)
SEQ ID NO:38
MEKIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTPSFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLATGLRNSPRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQ
(3)通过SPR的结合能力分析
结合能力的分析使用ProteON XPR36(BioRad)按照其使用说明进行。
首先,作为特别设计用于ProteON的传感器芯片,链霉亲和素固定的芯片(商品名:ProteOn NLC Sensor Chip,BioRad)设置在ProteONXPR36中。5000nmol/L的配体使用超纯水(DDW)注射到传感器芯片的流动池中,且允许结合进行直到信号强度(RU:共振单位)达到约1000RU。作为配体,使用通过使24-聚体脱氧胸苷的5’末端生物素化获得的生物素化聚(dT)。然后,400nmol/L的添加聚(dA)的适体使用SPR缓冲液以25μL/min的流率注射到芯片的流动池中80秒,且允许结合进行直到信号强度约700RU。随后,500nmol/L的靶蛋白使用SPR缓冲液以50μL/min的流率注射120秒,之后通过在相同条件下使SPR缓冲液流动进行洗涤。信号强度测量与靶蛋白质的注射和SPR缓冲液的洗涤同时进行。
选择缓冲液具有以下组成:50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、0.01%5mmol/L K+和1mmol/L Mg2+。选择缓冲液的pH是7.4。SPR缓冲液具有以下组成:50mmol/L Tris、0.1mol/L NaCl、0.01%和10mmol/L K+。SPR缓冲液的pH是7.4。
其结果显示于图4中。图4是显示各适体对各靶蛋白质的结合能力的图表。在图4的图表中,垂直轴表示使用ProteXRP36测量的信号强度(RU)的相对值。该相对值通过用靶蛋白质注射开始前(添加有聚(dA)的适体注射结束时)的信号强度除洗涤开始时(在靶蛋白质注射结束时)的信号强度进行计算来确定。在图4中,“0-合并”指示对于N30获得的结果。
如可从图4看到的,对比实施例的两个适体不显示对HA1Anhui、HA1Guiyang和HAAnhui的结合能力。相反,本实施例的适体都显示对HA1Anhui、HA1Guiyang和HAAnhui的结合能力,而它们不结合BSA或His-MIF。
(4)交叉反应
接下来,检验各适体与抗体的交叉反应。SPR以上述项目(3)中相同的方式进行,除了HA1Anhui和以下抗体用作靶蛋白质。
兔IgG
兔免疫球蛋白
Beckman Coulter,Inc.(#731642)
小鼠IgG
小鼠免疫球蛋白
Beckman Coulter,Inc.(#731620)
大鼠IgG
大鼠免疫球蛋白
Beckman Coulter,Inc.(#731628)
山羊IgG
山羊免疫球蛋白
Beckman Coulter,Inc.(#731635)
鸡IgG
鸡免疫球蛋白
Immunology Consultants Laboratory(ICL),Inc.(#CGHL-10A)其结果显示于图5中。图5是显示各适体对各抗体的结合能力的图表。在图5的图表中,垂直轴表示如图4中的信号强度(RU)的相对值。该相对值通过以上项目(3)中相同的方式确定。在图5中,“0-合并”指示对于N30获得的结果。
如可从图5看到的,本实施例的适体显示对HA1Anhui的强结合能力,而它们不显示对任何抗体的结合能力。这些结果证明,例如,在使用本发明的适体检测流感病毒或HA时,抗体也可以结合使用。
[实施例A2]
本实施例检验通过截短RHA0002(SEQ ID NO:12)获得的适体与HA的结合能力。
(1)适体
合成以下显示的RHA0002(SEQ ID NO:12)及其截短的适体。
RHA0002(SEQ ID NO:12)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGGGTGTTTGATGGTTTGG TCTGGTTGGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
(2)通过SPR的结合能力分析
除了使用以上适体外,以实施例A1中的相同方式分析与靶蛋白质的结合能力。其结果显示于以下表1中。在表1中,相对值以实施例A1的项目(3)中的相同方式确定。
[表1]
如可从表1看到的,截短的适体显示出对各靶蛋白质的结合能力。特别地,RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)显示出通过截短改善的结合能力。
[实施例A3]
本实施例检验RHA0006(SEQ ID NO:18)、通过截短RHA0006获得的截短的适体和包括截短适体的两个截短的序列的适体与HA的结合能力。
(1)适体
RHA0006(SEQ ID NO:18)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGTGTGTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0006_s19(SEQ ID NO:19)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGT TGGG
(2)通过SPR的结合能力分析
除了使用以上适体外,以实施例A1中的相同方式分析与靶蛋白质的结合能力。其结果显示于以下表2中。在表2中,相对值以实施例A1的项目(3)中的相同方式确定。
[表2]
如可从表2看到的,截短的适体和具有两个截短的序列的适体各自显示出对相应靶蛋白质的结合能力。特别地,RHA0006_s19_d9(SEQ IDNO:32)(其是具有两个截短的序列的适体)显示出进一步改善的结合能力。
[实施例A4]
本实施例检验各适体与HA的结合能力。
(1)适体
作为本实施例的适体,合成了以下多核苷酸。
RHA0002(SEQ ID NO:12)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGGGTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
RHA0006(SEQ ID NO:18)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGTGTGTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGGTCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0006_s19(SEQ ID NO:19)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGG
作为对比实施例的适体,使用在实施例A1中用作对比实施例的适体的适体A10和如非专利文献2(BBRC)中描述的具有以下序列的适体A05。
对比实施例A05(SEQ ID NO:53)
GAATTCAGTCGGACAGCGGGGGGGAATTCTAGCAGTACACCTCGAGAATTATAGCCAGGATGGACGAATATCGTCTCCC
(2)通过SPR的结合能力分析
除了使用以上适体外,以实施例A1中的相同方式分析与靶蛋白质的结合能力。其结果显示于图6中。图6是显示各适体对各靶蛋白质的结合能力的图表。在图6的图表中,垂直轴表示使用XRP36测量的信号强度(RU)的相对值。相对值通过实施例A1的项目(3)中相同的方式确定。在图6中,“0-合并”指示对于N30获得的结果。
如可从图6看到的,本实施例的适体全部显示对HA1Anhui、HA1Guiyang和HAAnhui的结合能力,而它们不结合BSA或His-MIF。特别地,RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)和RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)显示高结合能力。
(3)交叉反应
以上适体的交叉反应以实施例A1中的相同方式检验。其结果显示于图7中。图7是显示各适体对各抗体的结合能力的图表。在图7的图表中,垂直轴如图6中一样表示信号强度(RU)的相对值。
如可从图7看到的,本实施例的适体显示对HA1Anhui的结合能力,而它们不显示对任何抗体的结合能力。这些结果证明,例如,在使用本发明的适体检测HA时,抗体也可以结合使用。
[实施例A5]
本实施例检验各适体RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)和RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)与HA的解离常数。
SPR以实施例A1中的相同方式进行,除了生物素化聚T的浓度设定为100nmol/L及HA1Anhui、HA1Guiyang和HAAnhui各自的浓度设定为预定值(15.6、31.3、62.5、125或250nmol/L)。然后,从SPR的结果计算各适体的解离常数。其结果显示于以下表3中。
[表3]
RHA0002_s33
RHA0006_s19_d9
如可从表3看到的,RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)和RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)各自显示非常低的与各靶蛋白质的解离常数,这意味着它们对于各靶蛋白质具有非常高的结合能力。
[实施例A6]
本发明的适体、HA1或HA及抗体以这一时间顺序进行结合反应,并通过SPR分析其结合能力。
用于本实施例中的适体是RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)和RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)。HA1Anhui用作HA1,且HAAnhui用作HA。用于本实施例中的抗体是对照Ab(兔免疫球蛋白,Beckman Coulter,Inc.,#731642)(作为对照抗体)和抗HA Ab(兔抗-HA抗体,SinoBiological Inc.,#11048-RP02)。
SPR以实施例A1的项目(3)中的相同方式进行,除了SPR的条件设定如下。首先,5000nmol/L的配体使用超纯水(DDW)注射到传感器芯片的流动池中,且允许结合进行直到信息强度(RU:共振单位)达到约1000RU。作为配体,使用通过24聚体脱氧胸苷的5’末端生物素化获得的生物素化聚(dT)。然后,使用SPR缓冲液将400nmol/L的附加有聚(dA)的适体以25μL/min的流率注射到芯片的流动池中80秒,且使结合进行直到信号强度达到约700RU。接着,使用SPR缓冲液,500nmol/L的靶蛋白质以25μL/min的流率注射80秒且1μmol/L的检测抗体随后以50μL/min的流率注射120秒。最后,通过使SPR缓冲液流动进行洗涤。
其结果显示于图8中。图8是显示各适体、各靶蛋白质和各抗体之间的结合能力的图表。在图8的图表中,垂直轴表示使用XRP36测量的信号强度(RU)的相对值。相对值通过实施例A1的项目(3)中相同的方式确定。
如可从图8看到的,当使用任一适体时,未观察到适体、HA或HA1与对照抗体之间的结合,而观察到适体、HA或HA1与抗-HA抗体之间的结合。这些结果表明本发明的适体可以与抗体结合使用。
[实施例B1]
本实施例通过SPR检验各适体对HA的结合能力。
(1)适体
作为本实施例的适体,合成以下多核苷酸。
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA1634_s60(SEQ ID NO:21)
GGGCACCCTCTCGCTGTACGGTTGATGCACGTTTCTTTCTCTTTATATTGCTGGGTGCCC
RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)
GGGGCCCACCCTCTCGCTGGCGGCTCTGTTCTGTTCTCGTCTCCTTGATTTCTGTGGGCCCC
RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)
TTGGGGTTATTTTGGGAGGGCGGGGGTT
RHA0471_s51(SEQ ID NO:27)
TCCTCGTTGGGGGTGGTGGTGGGTTTCGGTTCATGGGTGGGACGGAGAGGA
合成了不显示对HA的结合性能的对照核酸分子(非专利文献1的适体A22)(其已报告为不显示对HA的结合性能)及非专利文献2的上述适体A05。
对照(SEQ ID NO:39)
CGGCGTTTGGTTGGCGTGAACCATTTTTAAGTT
对比实施例A22(SEQ ID NO:40)
AATTAACCCTCACTAAAGGGCTGAGTCTCAAAACCGCAATACACTGGTTGTATGGTCGAATAAGTTAA
对比实施例A05(SEQ ID NO:53)
GAATTCAGTCGGACAGCGGGGGGGAATTCTAGCAGTACACCTCGAGAATTATAGCCAGGATGGACGAATATCGTCTCCC
向上述适体各自的3’末端添加24-聚体的聚脱氧腺苷(聚(dA))。如此获得的添加聚(dA)的适体用于如下所述的SPR中。
(2)靶蛋白质
用于本实施例中的靶蛋白质是实施例A1中的A/Anhui/1/2005来源的HA1(HA1Anhui:SEQ ID NO:36)及A/California/04/2009来源的HA1,A/Brisbane/59/2007来源的HA1和A/Aichi/2/1968来源的HA1,其显示如下。
HA1California
A/California/04/2009来源的HA1
Sino Biological Inc.#1055-V08H4
SEQ ID NO:41
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADTYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSR
HA1Brisbane
A/Brisbane/59/2007来源的HA1
Sino Biological Inc.#11052-V08H1
SEQ ID NO:42
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGESSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQKALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSR
HA1Aichi
A/Aichi/2/1968来源的HA1
Sino Biological Inc.#11707-V08H1
SEQ ID NO:43
MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGIHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPIDTCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR
(3)通过SPR的结合能力分析
SPR以实施例A1的项目(3)中的相同方式进行,除了使用以上适体和靶蛋白质。其结果显示于图9中。图9是显示各适体对各靶蛋白质的结合能力的图表。在图9的图表中,垂直轴表示使用XRP36测量的信号强度(RU)的相对值。相对值通过实施例A1的项目(3)中相同的方式确定。
如可从图9看到的,与根据对比实施例的适体相比,本实施例的适体全部显示对各HA1的更高结合能力。
[实施例B2]
使用适体,通过ELAA(酶联适体分析)检测固定的HA。
(1)适体
用于本实施例中的适体是RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)、RHA1634_s60(SEQ ID NO:21)、RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)、RHA0385_28(SEQ ID NO:25)和RHA0471_s51(SEQ ID NO:27),其在实施例B1中合成。而且,使用如实施例B1中相同的对照核酸分子和对比实施例的适体。这些适体各自的3’末端是生物素化的,且如此获得的生物素化适体(检测适体)用于如下所述的ELAA中。
(2)靶蛋白质
用于本实施例中的靶蛋白质是A/Anhui/1/2005来源的HA(HA/H5N1)和A/California/04/2009来源的HA(HA/H1N1),其分别用于实施例A1和B1中。
(3)ELAA(直接方法)
靶固定于孔中,且使检测适体与固定的靶接触。通过检测与固定的靶结合的检测适体,固定的靶被检测。下面的这一方法称为ELAA的直接方法。
首先,HA用碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释,且100μL如此获得的10μg/mL HA添加到96孔板(商品名:Immuno 96Microwell Plates MaxiSorp:Nunc)的各孔。允许HA在4℃下吸附于孔过夜。孔然后用200μL的洗涤缓冲液(50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、5mmol/L KCl、1mmol/LMgCl2、0.01%20,pH 7.4)洗涤。之后,添加200μL的封闭缓冲液(无蛋白质(TBS)封闭缓冲液,#37570,PIERCE),且板在室温下孵育1小时。在孵育后,孔用200μL的洗涤缓冲液洗涤三次。因此,制备具有固定于其上的HA的板。
然后,使用反应溶液(50mmol/L Tris、100mmol/L NaCl、5mmol/LKCl、1mmol/L MgCl2、0.01%20、0.05%BSA,pH 7.4),将生物素化适体稀释到1μmol/L。之后,100μL稀释的生物素化适体添加到各孔,且板在室温下孵育1小时。随后,孔用洗涤溶液洗涤。之后,添加100μL的1000-倍稀释链酶亲和素-辣根过氧化物酶(SA-HRP:GE,#RPN1231_2ML),且允许反应在室温下进行30分钟。然后孔用洗涤溶液洗涤。之后,添加100μL的TMB-E底物(Moss Inc.),且允许反应(显色)在室温下进行20分钟。然后,100μL的0.5mol/L硫酸添加到孔中以终止反应。之后,使用读板仪测量450nm波长(参比波长:620nm)的吸光度。
作为空白,没有固定于其上的HA的96-孔板按以上相同的方式进行ELAA。
其结果显示于图10中。图10是显示与各适体结合的各HA的量的图表。在图10中,垂直轴表示450nm波长(参比波长:620nm)的吸光度,其表示结合能力。
如可从图10看到的,与根据对比实施例的适体相比,根据本实施例的适体全部显示对各HA1的更高结合能力。关于空白,吸光度低于检测极限。从这些结果,发现本实施例的适体未显示对板的结合性能但显示对固定的HA1的结合性能。根据这种方法,测量的吸光度指示与固定的HA结合的适体量,且因此HA的间接定性和定量是可能的。此外,因为HA的定性和定量是可能的,流感病毒的定性和定量也是可能的。
[实施例B3]
使用适体,通过ELAA(酶联适体分析)检测由固定的抗体捕获的HA。
(1)适体
用于本实施例中的适体是RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)、RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)、RHA1634_s60(SEQ ID NO:21)和RHA1635_s62(SEQ ID NO:23),其在实施例B1中合成。而且,使用如实施例B1中相同的对照核酸分子。这些适体各自的3’末端是生物素化的,且如此获得的生物素化适体用于如下所述的ELAA中。
(2)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用用于实施例B1中的A/Anhui/1/2005来源的HA(HA1/H5N1)。
(3)抗体
作为显示对HA/H5N1的结合性能的多克隆抗体,使用兔抗-血细胞凝集素(H5N1)pAb(Sino Biological Inc.,#11048-RP2)。
(4)ELAA
1μg的抗体添加到96孔板(商品名:Immuno 96Microwell PlatesMaxiSorp:Nunc)的各孔。板在4℃下孵育过夜以固定抗体。作为封闭缓冲液,使用无蛋白质(TBS)封闭缓冲液(商品名:#37570,PIERCE),且封闭处理在室温下进行1小时。然后,1μg的HA添加到板的各孔。板在室温下孵育2小时,从而引起HA结合于板上的固定抗体。随后,100μL的生物素化适体以1μmol/L添加到板的各孔,且板在室温下孵育1小时。之后,显色反应使用链酶亲和素-HRP(×1000)引起,并测量吸光度。除非另外说明,本实施例中的ELAA在与实施例B2中用于ELAA的相同条件下进行。
作为空白,吸光度测量也对于不包含HA的系统和其中抗体未被固定的系统进行。
其结果显示于图11中。图11是显示与各适体结合的HA的量的图表。在图11中,垂直轴表示450nm波长(参比波长:620nm)处的吸光度,其指示结合能力。
如可从图11看到的,关于各HA,根据本实施例的适体全部显示比对照核酸分子更高的吸光度。特别地,RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)显示非常高的吸光度。关于空白,在不包含HA的系统和其中抗体未被固定的系统的各系统中,吸光度低于检测极限。从这些结果,发现本实施例的适体未显示对抗体或板的结合性能但显示通过抗体对结合于板的HA的结合性能。根据这种方法(夹心ELAA),测量的吸光度指示与通过适体捕获的HA结合的抗体的量,且因此HA的间接定性和定量是可能的。
[实施例B4]
HA通过固定的适体捕获,且HA使用初级抗体和二级抗体检测。
(1)适体
使用实施例B1中合成的RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)。而且,使用如实施例B1中相同的对照核酸分子。向这些适体各自的3’末端引入氨基(-NH2)。使用如此获得的胺化适体。
(2)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用用于实施例B1中的A/Anhui/1/2005来源的HA(HA1/H5N1)。
(3)抗体
用于本实施例中的初级抗体是兔抗-血细胞凝集素(H5N1)pAb(SinoBiological Inc.,#11048-RP2),其是显示对HA/H5N1的结合性能的多克隆抗体。用于本实施例中的二级抗体是HRP-标记的抗-兔IgG抗体(α-兔IgG-HRP,#NA934-1ML,GE),其是能够结合初级抗体的多克隆抗体。
(4)ELAA
向96-孔板(商品名:固定的氨基板,#436006,Nunc)添加用碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释的胺化适体。板在4℃下孵育过夜以固定胺化适体。板的各孔中胺化适体的浓度设定为0、0.002、0.02、0.2或2μM。第一封闭处理在室温下使用1mol/L Tris(pH 7.4)进行1小时。第二封闭处理在室温下使用作为封闭缓冲液的无蛋白质(TBS)封闭缓冲液(商品名:#37570,PIERCE)进行1小时。然后,1μg的HA添加到板的各孔中。板在室温下孵育2小时,从而引起HA结合于板上的固定适体。随后,100μL的初级抗体以100nμM添加到板的各孔中,且板在室温下孵育1小时。之后,洗涤板。进一步向其中添加二级抗体(×5000),且板在室温下孵育30分钟。之后,显色反应使用TMB-E底物引起,并测量吸光度。除非另外说明,本实施例中的ELAA在与实施例B2中用于ELAA的相同条件下进行。
作为空白,吸光度测量也对于其中使用兔免疫球蛋白(BeckmanCoulter,Inc.,#731642)代替所述初级抗体作为对照抗体的系统进行。
其结果显示于图12中。图12是显示与适体结合的HA的量的图表。在图12中,垂直轴表示450nm波长(参比波长:620nm)的吸光度,其指示结合能力。
如可从图12看到的,吸光度以依赖于固定在板上的固定RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)的浓度的方式增加。从这一结果,发现本实施例的适体可以浓度依赖性的方式捕获HA。根据这种方法(夹心ELAA),测量的吸光度指示与捕获的HA结合的抗体量,且因此HA的间接定性和定量是可能的。
[实施例B5]
HA通过固定的捕获适体捕获,且HA使用检测适体检测。
(1)适体
用于本实施例中的适体是RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)、RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)、RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)和RHA0471_s51(SEQ ID NO:27),其在实施例B1中合成。待固定于板上的捕获适体配置为使得氨基(-NH2)引入到其3’末端。检测适体配置为使得其3’末端生物素化。而且,使用实施例B1中相同的对照核酸分子。捕获适体和检测适体的组合显示如下。
[表4]
(2)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用用于实施例B1中的A/California/04/2009来源的HA(HA1/H1N1)。
(3)ELAA(夹心方法)
捕获适体固定于各孔上,且使靶与捕获适体接触。此外,检测适体与结合于捕获适体的靶接触,从而将靶夹置于捕获适体和检测适体之间。然后,靶通过检测这一复合体中的检测适体进行检测。这一方面在下面称为ELAA的夹心方法。
首先,100μL的捕获适体以0.2μmol/L添加到96-孔板(商品名:固定的氨基板,#436006,Nunc)的各孔。板然后在室温下孵育2小时以固定胺化适体。第一封闭处理在室温下使用1mol/L Tris(pH 7.4)进行1小时。第二封闭处理在室温下使用作为封闭缓冲液的无蛋白质(TBS)封闭缓冲液(商品名:#37570,PIERCE)进行1小时。然后,1μg的HA添加到板的各孔中。板在室温下孵育2小时,从而引起HA结合于板上的捕获适体。随后,100μL的检测适体以1μmol/L添加到板的各孔中,且板在室温下孵育1小时。之后,显色反应使用链酶亲和素-HRP(×1000)引起,并测量吸光度。除非另外说明,本实施例中的ELAA在与实施例B2中用于ELAA的相同条件下进行。
其结果显示于图13中。图13是显示与通过捕获适体捕获的HA结合检测适体所结合的HA的量。
如可从图13看到的,当本实施例的适体用作捕获适体和检测适体时,与其中使用对照的情况相比显示更高的吸光度。特别地,当捕获适体和检测适体的组合如下时显示非常高的吸光度:RHA0385_s28(SEQID NO:25)和RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)的组合;及RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)和RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)或RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)的组合。根据这种方法(夹心ELAA),测量的吸光度指示与通过捕获适体捕获的HA结合的检测适体的量,且因此HA的间接定性和定量是可能的。
ELLA以如上所述的相同方式进行,除了:在A/California/04/2009来源的HA(HACalifornia)之外也使用A/Anhui/1/2005来源的HA(HAAnhui)作为靶蛋白质;且RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)和RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)的组合用作捕获适体和检测适体的组合。其结果显示于图14中。图14是显示结合于与通过捕获适体捕获的HA结合的检测适体的HA的量。如可从图14看到的,高吸光度不仅在靶蛋白质是HACalifornia时观察到,而且在靶蛋白质是HAAnhui时观察到。从这些结果发现,通过使用捕获适体和检测适体,HA的间接定性和定量是可能的。
[实施例B6]
(1)适体
使用实施例B1中合成的RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)。24-聚体的聚脱氧腺苷(聚(dA))添加到适体的3’末端,且进一步聚(dA)的3’末端生物素化。使用如此获得的添加生物素化聚(dA)的适体。
(2)反义物和聚(dT)
合成了具有与适体互补的序列的反义物(SEQ ID NO:44),且其5’末端胺化。
反义物(SEQ ID NO:44)
CCCAAACCCAACCCAACCCAAAAACCCAAACCCAACCCAACCCTTTTT
(3)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用用于实施例B1中的A/California/04/2009来源的HA(HA/H5N1)。
(4)ELAA
100μL胺化的反义物以0.02μmol/L添加到96-孔板(商品名:固定的氨基板,#436006,Nunc)的各孔中。板然后在室温下孵育2小时以固定胺化反义物。第一封闭处理在室温下使用1mol/L Tris(pH 7.4)进行1小时。第二封闭处理在室温下使用作为封闭缓冲液的无蛋白质(TBS)封闭缓冲液(商品名:#37570,PIERCE)进行1小时。
另一方面,预定浓度(0、0.0002、0.002、0.02、0.2或2μmol/L)的HA与2nmol/L的添加生物素化聚(dA)的适体混合,且所得的混合物在4℃下孵育过夜,从而引起HA和适体之间的结合。然后,这一混合物添加到孔中以实现1nmol/L的浓度。板在室温下孵育1小时,然后洗涤。之后,显色反应通过链酶亲和素(SA)-HRP(×1000)引起,并测量吸光度。除非另外说明,本实施例中的ELAA在与实施例B2中用于ELAA的相同条件下进行。
作为对比实施例,吸光度测量以相同的方式进行,除了使用具有胺化的5’末端的24-聚体聚(dT)代替胺化的反义物。
其结果显示于图15中。图15是显示与固定的反义物结合的适体的量的曲线图。在图15中,垂直轴表示450nm波长(参比波长:620nm)处的吸光度,其指示结合能力。
如可从图15看到的,当反义物和适体组合使用时,吸光度与HA浓度的提高相关地降低。这一现象的原因如下。当HA不存在时,适体可以结合固定在板上的反义物。因此,捕获在板上的适体中包含的生物素通过反义物与SA-HRP结合以引起显色反应。但是,当HA存在时,适体结合HA且因此不能结合固定在板上的反义物。因此,适体未捕获在板上。因此,不发生通过SA-HRP引起的显色反应。因而,吸光度与HA浓度的提高相关地降低。另一方面,当使用聚(dT)时,聚(dT)可以结合于添加到适体的聚(dA)。因此,未观察到伴随HA增加的吸光度降低。根据这种方法(竞争ELAA),测量的吸光度指示被反义物捕获的而未与HA结合的适体的量,且因此HA的间接定性和定量是可能的。
[实施例B7]
本实施例检验适体与抗体的交叉反应。除非另外说明,该检验以实施例A1的项目(4)中的相同方式进行。
作为靶蛋白质,使用A/Anhui/1/2005来源的HA1(HA1Anhui)、BSA和His-MIF而不使用A/California/04/2009来源的HA1(HA1California)。用于本实施例中的抗体是实施例A1的项目(4)中描述的兔IgG、小鼠IgG、鸡IgG、大鼠IgG和山羊IgG。
其结果显示于图16中。图16是显示各适体对各抗体的结合能力的图表。在图16的图表中,垂直轴表示信号强度(RU)的相对值,如在图4中一样。对于各适体显示的九条棒从左开始指示对于BSA、兔IgG、小鼠IgG、鸡IgG、大鼠IgG、山羊IgG、His-MIF、HA1/H1N1和HA1/H5N1获得的结果。
如可从图16看到的,本实施例的适体显示对HA的强结合能力,而它们对任何抗体几乎不显示结合能力。这些结果证明例如在使用本发明的适体检测流感病毒或HA时,抗体也可以结合使用。
[实施例C1]
本实施例检验各以下适体对靶蛋白质的结合能力。除非另外说明,该检验以实施例A1的项目(3)中的相同方式进行。
(1)适体
RHA0002(SEQ ID NO:12)
GGTTAGCCCGTCCCGAGATAACTCGGGGTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACACGGCGGCTGTAG
RHA0002_s16(SEQ ID NO:13)
GGTTTGGTCTGGTTGG
RHA0002_s20(SEQ ID NO:14)
GTGGTTTGGTCTGGTTGGAC
RHA0002_s26(SEQ ID NO:15)
CGTTTGGTTTGGTCTGGTTGGCAACG
RHA0002_s28(SEQ ID NO:16)
CGTTATGGTTTGGTCTGGTTGGCTAACG
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
(2)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用HA1Anhui。
其结果显示于图17中。图17是显示各适体对各靶蛋白质的结合能力的图表。在图17的图表中,垂直轴表示信号强度(RU)的相对值。相对值以实施例A1的项目(3)中相同的方式确定。在图17中,“0-合并”指示对于N30获得的结果。如可从图17看到的,本实施例的适体全部显示对HA1Anhui的结合能力。
[实施例C2]
本实施例检验各以下适体对靶蛋白质和抗体的结合能力。除非另外的说明,该检验以实施例A1(4)中相同的方式进行。
(1)适体
RHA0002_s33(SEQ ID NO:17)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
RHA0002_s33_d9(SEQ ID NO:48)
GTGTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACACTTTTTTTTTGT GTTTGATGGTTTGGTCTGGTTGGCTTAACAC
RHA0006_s19(SEQ ID NO:19)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0006_s19_d9(SEQ ID NO:32)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGT TGGG
RHA0006_s19_d9_AT(SEQ ID NO:46)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGATATATATAGGGTTTGGGTTGGGT TGGG
RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0006_s19_d_R20(SEQ ID NO:47)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGGATTGGAATTAAGGCGTGTGGGG TTTGGGTTGGGTTGGG
RHA0006_s19_t9(SEQ ID NO:51)
GGGTTTGGGTTGGGTTGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGT TGGGTTTTTTTTTGGGTTTGGGTTGGGTTGGG
(2)靶蛋白质
作为靶蛋白质,使用HA1Anhui和HAAnhui。作为抗体,使用实施例A1(4)中描述的兔IgG。
其结果显示于图18中。图18是显示各适体对相应靶蛋白质和抗体的结合能力的图表。在图18的图表中,垂直轴表示信号强度(RU)的相对值。相对值通过实施例A1的项目(3)中相同的方式确定。在图18中,“对照”指示对于N30获得的结果。
如可从图18看到的,本实施例的适体全部显示对HA1Anhui和HAAnhui的结合能力,而它们对抗体几乎不显示结合能力。而且,作为改变适体中接头的长度的结果,其中接头长度为5聚体的RHA0006_s19_d5(SEQID NO:33)显示优于其中接头长度为9聚体的RHA0006_s19_d9(SEQ IDNO:32)的结合能力。
[实施例D1]
使用适体通过ELAA检测固定的流感病毒。
(1)病毒
用于本实施例中的流感病毒在下面显示。作为对照病毒,使用以下非流感病毒。
(流感病毒)
H1N1
A/Brisbane/10/07
A/California/04/09
A/Georgia/20/06
H3N2
A/Wisconsin/67/05
A/Brisbane/59/07
A/Moscow/10/99
H5N1
A/Japanese white eye/Hong Kong/38/06
(非流感病毒)
辛德毕斯病毒
(2)病毒原液制备1
H1N1、H3N2和非流感病毒的病毒原液按以下方式制备。
从狗肾建立的MDCK(马-达二氏犬肾)细胞系(CCL-34(商标))用于提供用于病毒研究的细胞。生长培养基具有以下组成(最终浓度)。作为生长培养基成分之一的胎牛血清(FBS)是DFBS(商品名,Mediatech),且其余的成分是可从Invitrogen购得的产品。培养条件设定如下:37℃±2℃,具有湿度,5%CO2,过夜。培养板在使用前检验,且确认培养密度是80%。
(生长培养基)
1×最低基础培养基(MEM)
5%FBS
2mmol/L L-谷氨酰胺
3%NaHCO3
1×MEM维生素溶液
在烧瓶中汇合的MCDK细胞(约9.6×106细胞/mL)用各型病毒感染。细胞使用具有以下组成(最终浓度)的感染培养基培养。作为感染培养基的成分,使用可从Life Technologies购得的商品,除非另有说明。对于A/Brisbane/59/07和A/California/04/09,感染复数(MOI)设定为0.01PFU/细胞。对于A/Brisbane/10/07、A/Wisconsin/67/05、A/Moscow/10/99、A/Georgia/20/06和辛德毕斯(Sinbis),感染复数(MOI)设定为0.05PFU/细胞。PFU是空斑形成单位。
(感染培养基)
1×MEM
3%NaHCO3
1×MEM维生素溶液(Sigma)
1×L-谷氨酰胺
100U/mL青霉素
100μg/mL链霉素
50μg/mL庆大霉素
细胞用病毒感染1小时。之后,修饰的胰蛋白酶添加到烧瓶以获得2μg/mL的浓度。作为修饰的胰蛋白酶,使用以L-(甲苯磺酰胺-2-苯基)乙基氯甲酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(商品名,TPCK处理的胰蛋白酶,USB)。
然后,当细胞病变效应(CPE)达到约100%时,含病毒的培养上清液通过离心(200×G,10分钟,4℃)收集。保留的上清液使用超滤膜进行离心以除去100kDa或更低的蛋白质并浓缩病毒。作为超滤膜,使用Amicon Ultra离心过滤装置100,000NMWL(商品名,Millipore),且用于离心的条件是3000×G,4℃和30分钟。这一操作重复直到整个上清液浓缩。如此获得的浓缩液用作半纯化的病毒原液。收集病毒原液的部分。其中包含的病毒通过UV照射灭活,且病毒的浓度使用BCA分析(商品名,Pierce)测定。病毒原液储存在-65℃或以下。
(3)病毒原液制备2
H5N1(其为禽流感病毒)的病毒原液按以下方式制备。
减毒的rg A/Japanese White Eye/Hong Kong/38/06接种到无特定病原体(SPF)的鸡蛋中。鸡蛋孵育并用病毒感染。然后,在感染后48小时,收集包含病毒的绒毛膜尿囊液部分。收集的部分然后用稀释剂稀释。作为稀释剂,使用含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μg/mL庆大霉素的1×PBS(pH 7.4)。稀释的部分用作病毒原液而不如以上项目(2)中所述进行浓缩。病毒原液储存在-65℃或以下。
因为H5N1如上所述在鸡蛋中增殖,它包含大量鸡蛋来源的蛋白质。因此,不进行以上项目“(2)病毒原液制备1”中描述的使用柱的纯化步骤。由此,关于H5N1的病毒原液,其使用量表示为蛋白质浓度而不是病毒浓度。H5N1以其中其蛋白质浓度为H5N1以外病毒的病毒浓度(Vμg/孔)的100倍(100×Vμg/孔)的方式使用,以使固定的H5N1病毒颗粒的数目设置得与其它病毒的颗粒数目相当。
(4)ELAA(直接方法)
用于本实施例中的适体是:实施例A3中显示的RHA0006_s19(SEQID NO:19)及实施例B1中显示的RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)、RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)和RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)。然后,ELAA以实施例B2中相同的方式进行,除了固定病毒而不是靶蛋白质。此外,作为对照,使用如实施例B1中的相同对照核酸分子(SEQ IDNO:39)。
(5)与病毒的结合能力
检验了各适体与病毒的结合能力,且检验的结果显示如下。
(5-1)H5N1
关于RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)、RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)和RHA0385_s28(SEQ ID NO:25),检验了它们与作为H5N1的A/Japanese white eye/Hong Kong/38/06的结合能力。各适体的浓度设定为0.2μmol/L。其结果显示于图25中。图25是显示与病毒结合的各适体的量的曲线图。在图25中,垂直轴表示450nm波长下(参比波长:620nm)的吸光度,其指示结合能力,且水平轴表示与固定病毒的量对应的蛋白质量(μg/孔)。
如可从图25看到的,对照核酸分子几乎不显示对流感病毒H5N1的结合性能。相反,各适体显示出对流感病毒H5N1的高结合性能。
关于RHA0006_s19_d5,指示对H1N1(病毒:1μg/孔)的结合性能的吸光度(未显示)与图25中所示的指示对H5N1(蛋白质:100μg/孔)的结合性能的吸光度相当。在这一结果的基础上,在以下实验中,H5N1被固定以使得其蛋白质浓度为H5N1以外的病毒的病毒浓度(Vμg/孔)的100倍(100×Vμg/孔),如上所述。
(5-2)H1N1、H3N2和H5N1
检验了RHA1635_s62(SEQ ID NO:23)和RHA0006_s19_d5(SEQ IDNO:33)与流感病毒H1N1、H3N2和H5N1及与作为非流感病毒的辛德毕斯病毒的结合能力。各适体的浓度设定为0.2μmol/L。对于H5N1以外的病毒,固定病毒的量设定为1μg/孔。对于H5N1,代替固定病毒的量,与其对应的蛋白质的量设定为100μg/孔。其结果显示于图26中。图26是显示与各型病毒结合的各适体的量。在图26中,垂直轴表示450nm波长下(参比波长:620nm)的吸光度,其指示结合能力。
如可从图26看到的,对照核酸分子几乎不显示与非流感病毒和流感病毒两者的结合性能。相反,各适体对于非流感病毒没有显示出结合性能和仅对于流感病毒显示出高结合性能,从这些结果,发现本发明的适体也适用于流感病毒检测的直接方法中。
[实施例D2]
流感病毒通过固定的捕获适体捕获,且然后流感病毒通过检测适体检测。
(1)病毒
本实施例中使用的病毒是实施例D1中提供的以下病毒。
(流感病毒)
H1N1
A/California/04/09
A/Georgia/20/06
H3N2
A/Moscow/10/99
H5N1
A/Japanese white eye/Hong Kong/38/06
(非流感病毒)
辛德毕斯病毒
(2)ELAA(夹心方法)
作为捕获适体,使用RHA0385_s28(SEQ ID NO:25)和RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)。作为生物素化检测适体,使用RHA0006_s19_d5(SEQ ID NO:33)。ELAA以实施例B3中相同的方式进行,除了使用病毒而不是靶蛋白质;对于H5N1,蛋白质的量设定为1μg/孔;对于H5N1以外的病毒,病毒的量设定为1μg/孔;捕获适体的浓度设定为0.1μmol/L;且生物素化适体的浓度设定为0.1μmol/L。此外,作为空白,ELAA以以上相同方式对于包含缓冲剂而不是流感病毒的系统进行。而且,作为对照,ELAA以以上相同方式对于使用用于实施例B1中的对照核酸分子(SEQ ID NO:39)而不是适体的系统进行。
其结果显示于图27中。图27是显示结合于适体的各流感病毒的量的图表。在图27中,垂直轴表示450nm波长下(参比波长:620nm)的吸光度,其指示结合能力。
如可从图27看到的,对照核酸分子几乎不显示与非流感病毒和流感病毒两者的结合性能。相反,各适体对于非流感病毒没有显示出结合性能和仅对于流感病毒显示出高结合性能,从这些结果,发现本发明的适体也适用于流感病毒检测的夹心方法中。
尽管本发明已经在以上参照实施方式和实施例进行了描述,本发明不以任何方式局限于这些实施方式和实施例。可以在本发明的配置和细节中进行对于本领域技术人员可能明显的各种变化和改进而不脱离本发明的范围。
本申请要求2012年6月4日提交的日本专利申请No.2012-126861的优先权。这一日本专利申请的全部公开内容通过引用并入本文。
工业实用性
本发明的核酸分子可以结合流感病毒,且因此可以例如检测流感病毒。因此,本发明的核酸分子可以是例如在临床实践、畜牧业等领域中用于检测流感病毒的非常有用的工具。
[序列表]
TF12067WO序列表_ST25.txt
Claims (7)
1.一种结合流感病毒的核酸分子,所述核酸分子包含选自以下多核苷酸(a)-(d)组成的组的至少一个多核苷酸:
(a)具有SEQ ID NO:1-30的任一碱基序列的多核苷酸;
(b)具有通过多核苷酸(a)的任一碱基序列中一个或多个碱基的删除、置换、插入和/或添加获得的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;
(c)具有与多核苷酸(a)的任一碱基序列具有至少80%的同一性的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸;和
(d)具有与在严格条件下与多核苷酸(a)的任一碱基序列杂交的多核苷酸互补的碱基序列并结合流感病毒的多核苷酸。
2.根据权利要求1的核酸分子,包含选自所述多核苷酸(a)-(d)的两个或更多个多核苷酸。
3.根据权利要求2的核酸分子,其中所述两个或更多个多核苷酸经由接头彼此连接。
4.根据权利要求2或3的核酸分子,包含各具有SEQ ID NO:19的碱基序列的两个多核苷酸(RHA0006_s19)或各具有SEQ ID NO:17的碱基序列的两个多核苷酸(RHA0002_s33),该两个多核苷酸经由接头彼此连接。
5.根据权利要求4的核酸分子,其中所述经由接头彼此连接的两个多核苷酸整体具有SEQ ID NO:31或45的碱基序列。
6.根据权利要求1-5任一项的核酸分子,其中所述多核苷酸是DNA。
7.一种结合流感病毒的结合剂,所述结合剂包含根据权利要求1-6任一项的核酸分子。
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