CN104359885A

CN104359885A - 利用槲皮素作为荧光探针在测定Cu2+中的应用及其测定方法

Info

Publication number: CN104359885A
Application number: CN201410674056.5A
Authority: CN
Inventors: 徐莉; 杨世龙; 曹福亮; 印彬
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-02-18

Abstract

本发明涉及一种利用槲皮素作为荧光探针测定Cu²⁺的应用及一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，属光分析检测技术领域。本发明主要是利用槲皮素荧光探针与待测物Cu²⁺发生作用后荧光强度发生变化，通过荧光光谱分析对铜离子进行灵敏的定量分析测定。本发明的步骤是其步骤如下：(1)制作标准曲线：将槲皮素加入到含有不同浓度Cu²⁺的甲醇-磷酸缓冲盐溶液中，确定荧光强度与Cu²⁺的浓度的定量关系；(2)将槲皮素加入到含有Cu²⁺的待测甲醇-磷酸缓冲盐溶液中，配置成与步骤(1)槲皮素浓度相同的溶液，记录溶液的荧光强度；(3)根据定量关系确定待测溶液Cu²⁺的浓度。本发明的测定过程具有简单、灵敏、准确等特点。

Description

利用槲皮素作为荧光探针在测定Cu2+中的应用及其测定方法

技术领域

本发明涉及的是利用槲皮素作为荧光探针在测定Cu²⁺中的应用及其一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，属光分析检测技术领域。

背景技术

槲皮素广泛存在于植物中，其来源广泛，制备工艺简单，市场价格便宜。目前对槲皮素及其配合物的抗氧化、抗菌等生物活性研究较多，对其荧光探针的性质研究甚少。槲皮素具有完整的大π键共轭体系、强的配位氧原子及合适的空间构型，能与金属发生配位。这些相互作用会引起槲皮素光谱性质的变化，因此可以利用检测光谱性质的变化来实现对金属离子的识别。

Cu²⁺是人体中不可缺少的元素，对人体的生长发育有重要作用，但是人体内铜含量过高也会引起中毒，例如可引起坏死性肝炎、溶血性贫血等疾病。随着工业化的发展，环境污染日益严重，尤其是重金属污染给人类带来许多疾病和灾难，因此，监测环境中Cu²⁺的含量是一项具有重大意义的工作。目前，检测Cu²⁺的方法有很多种，例如：火焰原子吸收法、离子色谱法、电化学法等都是较为常见的Cu²⁺检测方法，但是这些方法中都要用到许多精密仪器，且对样品前处理要求严格，因此检测成本高、效率较低。为克服以上缺点，本发明采用广泛存在于植物体内的槲皮素作为荧光探针来检测环境中的Cu²⁺离子，具有灵敏度高、识别能力强、简单等特点。

发明内容

本发明目的是提供一种利用槲皮素作为荧光探针在测定Cu²⁺中的应用。

本发明还提供了一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法。该测定方法具有灵敏度高、识别能力强、简单等特点。

一种利用槲皮素作为荧光探针在测定Cu²⁺中的应用。

一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，其步骤如下：

(1)制作标准曲线：将槲皮素加入到含有不同浓度Cu²⁺的缓冲溶液中，配成槲皮素浓度相同的溶液，记录各溶液的荧光强度，确定荧光强度与Cu²⁺的浓度的定量关系；

(2)将槲皮素加入到含有Cu²⁺的待测缓冲溶液中，配置成与步骤(1)槲皮素浓度相同的溶液，记录溶液的荧光强度；

(3)根据定量关系确定待测溶液Cu²⁺的浓度。

所述的缓冲溶液为pH为7.40的甲醇-磷酸缓冲盐溶液(CH₃OH-PBS)，甲醇与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1:99。

所述的荧光强度测定条件是激发狭缝为5nm，发射狭缝为15nm，扫描范围为450-700nm，在激发波长为390nm，发射波长为540nm处，预先测定槲皮素荧光探针的荧光强度随Cu²⁺的浓度变化的定量关系。

所述的Cu²⁺的浓度在1～7μM范围，槲皮素的浓度为1×10^-5mol·L^-1。

有益效果：

本发明利用廉价易得的槲皮素作为荧光探针来检测水溶液中的Cu²⁺，利用槲皮素与Cu²⁺配位后荧光强度的变化规律，绘制荧光强度F对Cu²⁺浓度c(Cu²⁺)的标准曲线，根据标准曲线求出未知样品中Cu²⁺的浓度。操作简单，分析，对Cu²⁺识别能力强，受其它离子干扰小，灵敏度高，且在pH＝7.40的甲醇-磷酸缓冲盐溶液中对Cu²⁺进行检测，有望应用在细胞中，通过细胞成像等技术检测细胞中Cu²⁺含量。

附图说明

图1为在CH₃OH-PBS(1:99，V/V，PH＝7.40)缓冲溶液中，浓度为1×10^-5mol·L^-1的槲皮素与Cu²⁺(0～10μM)荧光滴定谱图；

图2为槲皮素与Cu²⁺的荧光滴定曲线；

图3为其它金属离子对槲皮素-Cu配合物体系荧光光谱的影响。

具体实施方式

实施例1

1、标准曲线的绘制

(1)准确称取0.0151g槲皮素(中国药品生物制品鉴定所，100081-200907)，用甲醇定容至50mL容量瓶中，从中取10mL用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到100mL容量瓶中，配成1×10^-4mol·L^-1待用；准确称取0.0200g Cu(AC)₂·H₂O用水定容至10mL容量瓶中，从中取1mL用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL容量瓶中，配成1×10^-3mol·L^-1待用。(2)准备11只10mL干燥洁净的容量瓶，分别加入1mL1×10^-4mol·L^-1的槲皮素溶液，和不同体积的1×10^-3mol·L^-1Cu(AC)₂·H₂O溶液，并用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL，配成槲皮素浓度均为1×10^-5mol·L^-1，Cu²⁺浓度分别为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM的溶液。

(3)设置荧光光谱仪激发波长为390nm，激发和发射狭缝宽度分别为5nm和15nm,扫描范围设置为450nm至700nm；并对上述溶液进行测试，分别记录上述溶液在发射波长为540nm处的荧光强度，如图1所示。

(4)绘制荧光强度F对Cu²⁺浓度c(Cu²⁺)的标准曲线，F＝-19.999x+209.49，线性相关系数为R²＝0.9941，线性范围为1-7μM，可以完成对Cu²⁺的微量检测，如图2所示。

2、样品的测定

(1)准备1只10mL干燥洁净的容量瓶，加入1mL1×10^-4mol·L^-1的槲皮素溶液，和25μL的1×10^-3mol·L^-1Cu(AC)₂·H₂O溶液，并用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL，配成槲皮素浓度为1×10^-5mol·L^-1，Cu²⁺浓度为2.5μM的溶液。

(2)设置荧光光谱仪激发波长为390nm，激发和发射狭缝宽度分别为5nm和15nm,扫描范围设置为450nm至700nm；并对上述溶液进行测试，记录上述溶液在发射波长为540nm处的荧光强度，重复测三次，分别为：159.7127，159.6323和159.5725。

(3)根据荧光强度F对Cu²⁺浓度c(Cu²⁺)的标准曲线：F＝-19.999x+209.49，计算得到Cu²⁺的浓度为：2.489，2.493和2.496μM，均值为：2.493μM，相对误差为：-0.28％。

实施例2

1、标准曲线的绘制

(1)准确称取0.0151g槲皮素(中国药品生物制品鉴定所，100081-200907)，用甲醇定容至50mL容量瓶中，从中取10mL用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到100mL容量瓶中，配成1×10^-4mol·L^-1待用；准确称取0.0200g Cu(AC)₂·H₂O用水定容至10mL容量瓶中，从中取1mL用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL容量瓶中，配成1×10^-3mol·L^-1待用。

(2)准备11只10mL干燥洁净的容量瓶，分别加入1mL1×10^-4mol·L^-1的槲皮素溶液，和不同体积的1×10^-3mol·L^-1Cu(AC)₂·H₂O溶液，并用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL，配成槲皮素浓度均为1×10^-5mol·L^-1，Cu²⁺浓度分别为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM的溶液。

2、样品的测定

(1)准备1只10mL干燥洁净的容量瓶，加入1mL1×10^-4mol·L^-1的槲皮素溶液，和45μL的1×10^-3mol·L^-1Cu(AC)₂·H₂O溶液，并用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL，配成槲皮素浓度为1×10^-5mol·L^-1，Cu²⁺浓度为4.5μM的溶液。

(2)设置荧光光谱仪激发波长为390nm，激发和发射狭缝宽度分别为5nm和15nm,扫描范围设置为450nm至700nm；并对上述溶液进行测试，记录上述溶液在发射波长为540nm处的荧光强度，重复测三次，分别为：119.9342，119.7946和119.7544。

(3)根据荧光强度F对Cu²⁺浓度c(Cu²⁺)的标准曲线：F＝-19.999x+209.49，计算得到Cu²⁺的浓度为：4.478，4.485和4.487μM，均值为：4.483μM，相对误差为：-0.38％。

实施例3

1、标准曲线的绘制

2、样品的测定

(1)准备1只10mL干燥洁净的容量瓶，加入1mL1×10^-4mol·L^-1的槲皮素溶液，和65μL的1×10^-3mol·L^-1Cu(AC)₂·H₂O溶液，并用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL，配成槲皮素浓度为1×10^-5mol·L^-1，Cu²⁺浓度为6.5μM的溶液。

(2)设置荧光光谱仪激发波长为390nm，激发和发射狭缝宽度分别为5nm和15nm,扫描范围设置为450nm至700nm；并对上述溶液进行测试，记录上述溶液在发射波长为540nm处的荧光强度，重复测三次，分别为：80.0568，79.7765和79.6761。

(3)根据荧光强度F对Cu²⁺浓度c(Cu²⁺)的标准曲线：F＝-19.999x+209.49，计算得到Cu²⁺的浓度为：6.472，6.486和6.491μM，均值为：6.483μM，相对误差为：-0.26％。

实施例4

1、标准曲线的绘制

2、未知样品的测定

(1)取南京林业大学二村池塘河水，经0.22μm微孔滤头过滤，得到澄清未知待测液，并定容至10mL容量瓶中。

(2)准备1只10mL干燥洁净的容量瓶，加入1mL1×10^-4mol·L^-1的槲皮素溶液，和1mL(1)中待测溶液，并用PBS缓冲溶液(pH＝7.40)定容到10mL，配成槲皮素浓度为1×10^-5mol·L^-1，采用ICP-MS检测到Cu²⁺的浓度为4.002μM。

(3)设置荧光光谱仪激发波长为390nm，激发和发射狭缝宽度分别为5nm和15nm,扫描范围设置为450nm至700nm；并对上述溶液进行测试，记录上述溶液在发射波长为540nm处的荧光强度，重复测三次，取平均值，并根据荧光强度F对Cu²⁺浓度c(Cu²⁺)的标准曲线：F＝-19.999x+209.49，计算得到Cu²⁺的浓度为：3.889μM。

槲皮素荧光探针测量结果与ICP-MS测量结果比较接近，能满足一般的分析要求，而且使用更加方便，成本更低。

此外，本发明还考查了不同金属离子对槲皮素-Cu配合物体系荧光光谱的影响。在含槲皮素1×10^-5mol·L^-1，Cu(AC)₂为4μM的溶液中，分别加入含Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、La³⁺、Eu³⁺、Gd³⁺、Ce³⁺、Dy³⁺的醋酸盐，其中Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺浓度为Cu²⁺浓度的250倍，Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、La³⁺、Eu³⁺、Gd³⁺、Ce³⁺、Dy³⁺浓度为Cu²⁺浓度的25倍，在相同的条件下测得的荧光强度如图3所示，由图可以看出，槲皮素对Cu²⁺的识别能力较强，Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、La³⁺、Eu³⁺、Gd³⁺、Ce³⁺、Dy³⁺对Cu²⁺的检测几乎没有影响。

Claims

1.一种利用槲皮素作为荧光探针在测定Cu²⁺中的应用。

2.一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，其步骤如下：

(1)制作标准曲线：将槲皮素加入到含有不同浓度Cu²⁺的甲醇-磷酸缓冲盐溶液中，配成槲皮素浓度相同的溶液，记录各溶液的荧光强度，确定荧光强度与Cu²⁺的浓度的定量关系；

(2)将槲皮素加入到含有Cu²⁺的待测甲醇-磷酸缓冲盐溶液中，配置成与步骤(1)槲皮素浓度相同的溶液，记录溶液的荧光强度；

(3)根据定量关系确定待测溶液Cu²⁺的浓度。

3.根据权利要求2所述一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为pH为7.40的甲醇-磷酸缓冲盐溶液(CH₃OH-PBS)，甲醇与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1:99。

4.根据权利要求2所述一种利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，其特征在于：所述的荧光强度测定条件是激发狭缝为5nm，发射狭缝为15nm，扫描范围为450-700nm，激发波长为390nm，发射波长为540nm。

5.根据权利要求2所述的利用槲皮素作为荧光探针对Cu²⁺的测定方法，其特征在于：所述的Cu²⁺的浓度在1～7μM范围，槲皮素的浓度为1×10^-5mol·L^-1。