CN104357455A - 一个水稻抗旱相关基因OsDT11及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高水稻对抗干旱能力的OsDT11基因以及该基因在水稻抗旱遗传改良中的应用，所述的OsDT11基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本发明通过在水稻中超量表达OsDT11基因，可以提高转基因水稻对抗干旱性状的能力，本发明证实了该基因的功能及应用途径。为植物抗旱研究及干旱育种提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高水稻对抗干旱能力的OsDT11基因以及该基因在水稻抗旱遗传改良中的应用。
背景技术
水稻是最主要的三大粮食作物之一，其播种面积占粮食播种面积的1/5，全世界二分之一以上的人口以水稻为主食，同时也是我国最主要的栽培作物之一。
各种生物和非生物胁迫是影响水稻生长和产量的重要因素，发觉能够改善水稻抵抗逆境胁迫能力的基因将为基因工程改良水稻新品种打下基础。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫。基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来体高植物的抗逆性，它是在基因水平上进行的，具有精确性和稳定性，提高了育种的高效性，极大地加快了育种速度，对于我们了解抗逆植物复杂的性状以及相关机制也是非常必要的。随着分子生物学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的抗性已经收到越来越广泛的关注和重视。
干旱一直是限制作物生长和产量的重要因素，并随着全球环境恶化、气候异常等变化将日益危害着我国的粮食生产安全。通过超量表达逆境应答过程中的重要基因可以显著提高作物的抗逆性。
植物抗旱性属多基因控制的数量性状,通过常规育种方法改良作物抗旱性的效果往往不理想。借助基因工程手段改良作物，利用植物抗旱相关基因是提高植物抗旱性的有效途径。目前越来越多的抗旱相关基因已经被克隆和用来提高植物抗旱性。按照抗旱基因的功能,可以把植物抗旱相关基因分为两大类:第一类属于功能基因，其编码在植物抗性中直接起保护作用的蛋白质。如参与渗透调节的脯氨酸合成基因，其编码的脯氨酸能聚集与渗透调节有关的蛋白,避免或减少因细胞脱水引起的蛋白质变性。第二类属于调节基因，其编码在信号传导和逆激基因表达过程中起调节作用的蛋白质因子。如DREB、MYC/MYB、bZIP、WRKY和NAC类转录因子，其在转录水平上调控的一系列抗旱相关基因的表达，可以有效地提高植物的耐旱性，如碱性亮氨酸拉链结构域的bZIP类转录因子ABF/AREBs能够激活含有ABRE元件的基因表达,普遍存在于受ABA、生长素、茉莉酸、水杨酸诱导的基因中,例如在水稻中组成型超量表达OsbZIP23基因，对ABA敏感性增加，但可以显著提高水稻在苗期和孕穗期对干旱的抗性(Xiang等，Characterization of OsbZIP23as a key player of the basic leucinezipper transcription factor family for conferring abscisic acid sensitivity andsalinity and drought tolerance in rice.Plant Physiol.2008.148(4)：1938-1952)。
因为水稻是重要的粮食作物和模式植物，在极端气候条件频发的今天，培育抗逆性增强的水稻具有重要的意义。因此，从水稻中分离OsDT11基因，并鉴定它在提高水稻抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的发明人针对现有针对水稻抗旱基因的研究现状，提供了一个从水稻中分离和克隆的OsDT11基因，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中所示，发明人发现该基因表达量显著提高的遗传转化水稻对干旱的抗性明显增强，表达量显著降低的遗传转化水稻对干旱的抵抗能力明显减弱，证明OsDT11基因在水稻抗旱中发挥着重要作用，因此证实了超量表达OsDT11基因可以赋予植物对由干旱所引起的性状产生抗性，获得抗旱植株。
发明人首先提供了一个从水稻中花11中分离克隆出的的OsDT11基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中所示。
具体的方法如下：
发明人首先获得了水稻中花11基因，之后通过特殊设计的引物扩增水稻中花11基因获得目标基因，其中所述的引物包括引物1，5′-AGGCAATGGCGAGCACTA-3′其序列如序列表SEQID NO.3所示，引物2，5′-ACGCAGGACGTGAAGAGC-3′其序列如序列表SEQ ID NO.4所示；
为了验证其功能，发明人利用强启动子驱动和基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsDT11基因的超量表达载体和RNAi载体转入水稻品种中花11，超量及抑制水稻中OsDT11基因的表达，结果表明OsDT11基因表达量显著提高的遗传转化水稻对干旱的抗性明显增强，表达量显著降低的遗传转化水稻对干旱的抵抗能力明显减弱，证明OsDT11基因在水稻抗旱中发挥着重要作用。
采用上述的方法，主要是可以将克隆的抗旱相关基因转入抗性弱的植物，有助于产生新的抗旱植物。特别是可以用遗传转化技术在植物中累加多个抗旱基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。
综上所述，本发明的发明人首次提供了一个从水稻中分离克隆出的抗旱相关基因完整编码区段的DNA片段，并命名为OsDT11，并验证了该基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后可以赋予植物对由干旱所引起的性状产生抗性，获得抗旱植株。
附图说明
图1为用定量RT-PCR技术检测PEG8000处理水稻中花11后OsDT11基因的表达模式结果示意图；
图中黑色柱形图表示水处理后基因的表达，白色的柱形图表示的是PEG8000处理后基因的表达，可以看到在处理0、3、6、24h后取样的检测结果，以水处理为对照，可见在PEG8000处理6小时的时候，OsDT11基因表达量与对照相比有明显的提高；
图2为遗传转化载体pU1301的结构示意图；
图3为遗传转化载体ds1301RNAi机制示意图；
图4荧光定量RT-PCR检测超量表达和抑制表达转基因T2代植株中OsDT11基因的表达量结果示意图；
图中纵坐标为OsDT11基因在每份水稻材料中的相对表达量(对照材料的表达量定为1)
图5为超量表达和抑制表达OsDT11基因的T2代遗传转化水稻植株受干旱胁迫表型彩图；
图中，超量表达T2代遗传转化植株(CD11ZH-1、CD11ZH-2、CD11ZH-3)在受到干旱胁迫17天后的表型，可以看到其叶片仍能保持绿色，只发生了卷曲，而野生型中花11植株的叶片已经失绿枯黄，萎蔫卷曲，抑制表达株系(CD12ZH-1、CD12ZH-2、CD12ZH-3)表现的比野生型更加敏感。并且在恢复浇水7天后，超量表达的株系基本恢复到正常植株的表型，而对照和抑制株系基本上已枯死。说明在水稻中超量表达OsDT11基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力。
图6为超量表达和抑制表达OsDT11基因的T2代遗传转化水稻植株失水率统计的示意图；可以看到超量表达OsDT11基因的植株失水率比野生型的明显低，而抑制表达OsDT11基因的植株失水率明显比野生型高。
具体实施方式
以下实施例中定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有OsDT11基因完整编码区段的DNA片段，以及验证OsDT11基因功能的方法。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；
实施例1：OsDT11基因超量表达载体和抑制表达载体的构建以及遗传转化
1.超量表达载体的构建
超量表达载体的构建方法如下：首先根据核苷酸数据库GenBank AK059202得到OsDT11基因序列，发现该基因全长为714bp，没有内含子，编码88个氨基酸，以此为参考设计引物，用来扩增OsDT11基因；
提取水稻品种中花11的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，用正向引物-引物3(5′-ATGGGTACCAGGCAATGGCGAGCACTA-3′，带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.5所示)和反向引物-引物6(5′-ATGGGATCCACGCAGGACGTGAAGAGC-3′，带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.6所示)；
反应程序如下：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃45s(1kb/min速度)，反应35个循环，后延伸72℃7min，结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切PCR产物及载体pU1301(如图2所示)，酶切完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，利用乙醇沉淀纯化回收，并用T4DNA连接酶将纯化回收的产物和纯化回收pU1301载体连接。转化大肠杆菌E.coli DH5ɑ感受态细胞，挑选单克隆提质粒，并用相同的酶进行酶切检测，电泳检测酶切结果正确，测序由华大基因完成，测序结果表明载体构建成功。命名为pU1301：：OsDT11，作为超量表达载体。
2.抑制表达载体的构建
抑制表达载体的构建方法如下：用水稻中花11的基因组为模板扩增，用引物5(5′-AAGACTAGTGGTACCTGGCGAGCACTAAGATGG-3′，带下划线碱基为限制性内切酶SpeI和KpnI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.7所示)和引物6(5′-AAGGAGCTCGGATCCTAGGGACCGAACGCAGAA-3′，带下划线碱基为限制性内切酶SacI和BamHI识别位点，其序列如序列表SEQ ID NO.8所示)扩增基因组；
PCR反应程序如下：预变性94℃3min，变性94℃30s，退火54℃30s，延伸72℃45s(1kb/min速度)，反应35个循环，后延伸72℃7min，结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段。
构建OsDT11基因片段第一重复链，用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切PCR产物及载体ds1301(如图3所示)，酶切完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，利用乙醇沉淀纯化回收，并用T4DNA连接酶将纯化回收的PCR产物和纯化回收的ds1301载体连接。转化大肠杆菌E.coliDH5ɑ感受态细胞，挑选单克隆提质粒，并用相同的酶进行酶切检测，电泳检测酶切结果正确，测序由华大基因完成，测序结果表明第一重复链载体构建成功。
构建OsDT11基因片段第二重复链，用SpeⅠ和SacⅠ双酶切PCR产物和上述构建成功的第一重复链载体，酶切完全后在75℃水浴10min灭活限制性内切酶，利用乙醇沉淀纯化回收，并用T4DNA连接酶将纯化回收的PCR产物和纯化回收的第一重复链载体连接。转化大肠杆菌E.coli DH5ɑ感受态细胞，挑选单克隆提质粒，并用相同的酶进行酶切检测，电泳检测酶切结果正确，测序由华大基因完成，测序结果表明第二重复链载体构建成功。命名为ds1301：：OsDT11，作为抑制表达载体。
3.农杆菌介导的遗传转化
将构建好的超量和抑制表达载体pU1301：：OsDT11和ds1301：：OsDT11电转化农杆菌感受态细胞EHA105，保存菌株用作农杆菌介导的水稻遗传转化。
采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，Optimising the tissue cultureconditions for high efficiency transformation of indica rice，2005，Plant Cell Rep.23：540-547)将超量和抑制表达载体导入水稻品种中花11中。获得的超量和抑制表达遗传转化植株分别被命名为CD11ZH和CD12ZH。本发明分别获得独立转化植株23株和40株，对转基因植株进行阳性鉴定后，得到13株超量植株，命名为CD11ZH1-13和26株抑制植株，命名为CD12ZH1-26。
本实施例的具体农杆菌介导的遗传转化主要步骤和试剂如下：
(1)电转化：将构建好的超量和抑制表达载体pU1301：：OsDT11和ds1301：：OsDT11，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的常用的LA培养基上筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。
(2)愈伤诱导：将成熟的水稻种子中花11去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl2)种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将消毒过的种子放在诱导培养基上；置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。
(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。
(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。
(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次羧苄青霉素筛选浓度为400ppm，第二次及以后为250ppm，潮霉素浓度为250ppm)。
(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。
(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
(10)移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
上述试剂和溶液均为本领域常规技术，具体可参考“采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformationof indica rice，2005，Plant Cell Rep.23：540-547)”中记载的方案，在此不再赘述。
实施例2：OsDT11基因在水稻中的表达模式分析
为了证实OsDT11基因受干旱胁迫的诱导，参与抗旱反应。本发明采用荧光定量RT-PCR技术分析了OsDT11基因在PEG8000处理水稻品种中花11后的表达模式。采用15％(w/v)的PEG8000处理成株期的水稻，用水处理的作为对照组。分别在0、3、6、24小时时剪取水稻的根，并提取总RNA,参照Zhou(Zhou等，2002)的方法，使用oligo(dT)15寡聚引物和SuperScriptII反转录酶(Invitrogen)进行反转录。利用iQTM5定量PCR仪(Bio-Rad公司)、SYBR Green荧光嵌入染料做定量RT-PCR分析，水稻内源肌动蛋白基因Actin的表达量用于RNA样品的均一化评价，利用2-ΔΔCT相对定量的方法比较分析基因表达量(Qiu等，2007)，比较各时间点处理组和对照组中OsDT11基因的表达量变化；
OsDT11基因的定量RT-PCR反应引物是OsDT11F(5′-TGTGTGACGCCGTGCAAT-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.9所示)和OsDT11R(5′-CCAGGGCCGGAAGCTAGA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.10所示)；
水稻内源肌动蛋白基因Actin的定量RT-PCR反应引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′其序列如序列表SEQ ID NO.11所示)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示)；
分析结果显示与水处理对照组相比，在PEG8000处理6小时后，OsDT11基因就明显的受到诱导上调表达(如图1所示)，说明OsDT11基因参与抗旱反应的调控。
实施例3：OsDT11转基因植株分子鉴定和抗旱性鉴定
选用T2代转基因超量表达、抑制表达和野生型中花11的种子，催芽后播种于盛有育苗基质的盒子内，培养条件为光照/黑暗为16/8h，光照条件25℃，黑暗条件23℃，光强30000lx。利用荧光定量RT-PCR技术，检测转基因水稻中OsDT11基因的表达量(如图4所示)。从图中看出，超量表达转基因植株中OsDT11的表达量明显高于野生型中花11植株(如图4A所示)，抑制表达的转基因植株OsDT11基因的表达明显低于野生型中花11植株(如图4B所示)。
在水稻长至成株期时，分别选取3组来自不同转基因株系的超量和抑制表达植株，每组10棵，实验设3次重复。可以看到在干旱处理17天后，超量表达植株明显好于野生型和抑制表达植株，而抑制表达植株对干旱最敏感，表现为叶片全部枯黄，在恢复浇水7天后，可以看到只有超量表达植株能恢复到了正常的水稻植株表型(如图5所示)。
失水率的检测，分别选取野生型中化11、超量表达、抑制表达株系生长势相同的植株，在干旱胁迫处理前称重一次，重量为w1，干旱胁迫处理后称重一次，重量为w2，根据公式：失水率＝(w1-w2)/w1计算失水率，可以看到超量表达OsDT11基因的植株失水率比野生型的明显低，而抑制表达OsDT11基因的植株失水率明显比野生型高(如图6所示)。因此，与野生型植株相比，OsDT11超量表达的转基因植株最耐旱，而抑制表达的转基因植株对干旱敏感，水稻中超量表达OsDT11基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力，在水稻抗逆育种中具有重要价值。
Claims (2)
1.一个从水稻中分离和克隆的抗旱相关基因，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2中所示。
2.权利要求1所述的OsDT11基因在水稻抗旱遗传改良中的应用。
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