CN104334174A

CN104334174A - 作为脊髓性肌萎缩治疗剂的4-氨基吡啶

Info

Publication number: CN104334174A
Application number: CN201380027537.0A
Authority: CN
Inventors: B·麦凯布
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2015-02-04
Also published as: JP2015512409A; WO2013148740A1; EP2830620A4; EP2830620A1

Abstract

已发现K+通道的药物抑制(使用FDA批准的广谱K+通道拮抗剂4-AP)积极地有益于smn突变体表型，结果与为SMN消耗的关键性后果的运动回路通过它们的中间神经元或感觉神经元输入产生的缺陷型兴奋性相一致。基于这些发现，本发明的特定实施方案涉及给药治疗有效量的一种以上的钾通道拮抗剂的SMA治疗方法，所述钾通道拮抗剂包括4-氨基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶、4-(甲基氨基)吡啶和4-(氨基甲基)吡啶。其它实施方案涉及包括两种以上的钾通道拮抗剂的新药物制剂。

Description

作为脊髓性肌萎缩治疗剂的4-氨基吡啶

相关申请的交叉参考

根据美国专利法第119(e)条，本申请要求2008年3月15日提交的美国临时申请61/615,466号和2012年3月26日提交的美国临时申请61/057,190号的优先权，如在此完整阐述一样地将其全部内容引入于此以作参考。

政府权益的声明

本发明根据国防部资助合同No.W81XWH-08-1-0009在政府支持下完成。

背景技术

脊髓性肌萎缩(Spinal muscular atrophy,SMA)为致命的人类疾病，其特征在于由于遍在运动神经元存活(Survival Motor Neuron,SMN)蛋白耗竭造成的运动神经元功能障碍和肌肉退化。SMA为常染色体隐性疾病，其特征在于在脊髓前角中的运动神经元的退化，导致肌肉麻痹和萎缩。根据年龄和严重程度SMA常规上分为三类：婴儿期SMA-1型或韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann disease)(一般0-6个月)为最严重的形式，并在生命的第一年显现，导致永远不能维持独立的坐姿。中期SMA-2型(一般7-18个月)形容从来不能够站立和行走，但在生命中能够维持坐姿至少一段时间的那些儿童。无力症的发病通常在6至18个月之间的某个时期。青少年期SMA-3型或库格柏-伟兰德症(Kugelberg-Welander disease)(一般大于18个月)形容在某一时间能行走的那些人。成人SMA-4型涉及通常开始于青春晚期舌头、手或脚无力，然后进展至身体其它区域。病程较缓慢且对预期寿命具有很小或没有影响。另外，对于SMA的非常严重症状的产前发病和早期新生儿死亡结果，将SMA分类为0型(Eur J Paediatr Neurol 1999；3:49-51；Lancet 1995；346:1162；Neuromuscul Disord 1992；2:423-428)。6000-10000个活胎(live births)大约1个发生SMA，并且SMA具有1/50的携带频率(carrier frequency)。这是人类第二大常见的常染色体隐性遗传病和最常见的婴儿死亡遗传原因(Semin Neurol1998；18:19-26)。

连锁图谱将运动神经元存活(SMN)基因鉴定为SMA基因座(Lefebvre等,Cell 80,1-5)。在人类中，两个几乎相同的SMN基因(SMN1和SMN2)存在于染色体5q13上。SMN1而不是SMN2基因内的缺失或突变引起所有形式的近侧SMA(Lefebvre等,Cell 80,1-5)。SMN1编码遍在表达的38kDa的SMN蛋白，这对于snRNP组装是必须的，该组装是细胞存活必不可少的过程(Wan,L.,等2005.Mol.Cell.Biol.25:5543-5551)。该基因几乎相同的拷贝，SMN2，无法弥补SMN1的缺失，这是因为外显子7跳跃，产生不稳定的截短蛋白SMN.DELTA.7(Lorson,C.L.等,1998.Nat.Genet.19:63-66；Lefebvre等,1995；Burghes和Beattie,2009)。

SMN1和SMN2的差别在于外显子7的6位上关键性的C-T置换(SMN2的转录本中为C6U)(Lorson,C.L，，等1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:6307-6311；Monani,U.R.,等1999.Hum.Mol.Genet.8:1177-1183)。C6U不改变编码序列，但足以引起SMN1中外显子7跳跃。因此，与完全缺失SMN1相对地，SMA由低水平SMN1引起(Burghes和Beattie,2009)。SMN为多功能蛋白，已涉及与RNA代谢相关的各种细胞进程(Pellizzoni,2007)。

没有有效的SMA药物治疗，因此十分需要这样的治疗。

发明内容

本发明的某些实施方案涉及下述方法，所述方法包括鉴定患有脊髓性肌萎缩的受试者，并向该受试者给药治疗有效量的K+通道拮抗剂(包括广谱类K+通道拮抗剂)，和选自包括4-氨基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶、4-(甲基氨基)吡啶和4-(氨基甲基)吡啶的组的拮抗剂。对于本发明的方法来说，其它K+通道拮抗剂包括多非利特(dofetilide)、索他洛尔(sotalol)、依布利特(ibutilide))、阿奇利特(Azimilide)、溴苄胺(Bretylium)、氯非铵(Clofilium)、E-4031、尼非卡兰(Nifekalant)、替地沙米(Tedisamil)和司美利特(Sematilide)。在实施方案中，治疗有效量为每次给药约0.5mg至100mg范围内的量，且拮抗剂每天给药一至三次。

其它实施方案涉及药物制剂，所述药物制剂包括4-AP和一种以上的列举的治疗剂，优选配制为穿过血脑屏障递送或配制为直接给药至硬膜外静脉丛、脑、脊柱或脑脊液。本方法可用于治疗任何形式的SMA：1型、2型或3型。

附图说明

在下图中，本发明借助实例说明，并且不受此限制。

图1.smn突变体具有减小的肌肉大小、降低的运动、有缺陷的运动节律性和异常的神经肌接点(NMJ)神经递质释放。A-B.第三幼虫龄期用TRITC鬼笔环肽(phallodin)标记来自对照(A)和SMNX7突变体(B)的片段A3的肌肉的样品图，显示肌肉表面积的减少(C)，通过由Da-Gal4启动的UAS-flag-SMN的遍在表达来完全解救(基因型：Da-Gal4/UAS::flagSMN；SMNX7/SMNX7)。D-F.10个样品叠加60秒幼虫移动路径追踪，来自对照(D)和SMNX7突变体(E)。smn突变体幼虫与通过转基因SMN的遍在表达所校正的对照相比已减少速度(reduced velocity)(F)。G-I.来自半完整的幼虫制备物(其中脑、腹神经索和运动神经元是完整的)的片段A1中的肌肉6的记录。对照幼虫产生规则的运动节律性，具有对应于周期性肌肉收缩的周期性突发活动(G)。相反，smn突变体幼虫具有不规则的运动模式，具有短且不协调的突发(H)，以峰电位间隔(inter-spike interval)(I)增加示出，其由SMN的遍在表达所解救。J-L.代表性迹线，来自对照(J)和SMNX7突变体(K)幼虫的片段A3的肌肉6的记录。SMNX7突变体比对照(K)增加诱发的兴奋性突触后电位(eEPSP)幅度。该增加被遍在表达的SMN所校正(L)。误差线表示平均值的标准差。**＝p<0.01，***＝p<0.001，相对于对照计算显著性。附图SI示出SMNX7突变体具有与对照相比小于6％的SMN蛋白水平。

图2.神经元中需要SMN表达来解救smn突变体，而在肌肉中不需要。A-D.来自(A)对照、(B)SMNX7突变体、(C)具有仅在肌肉中表达的转基因SMN*n的SMNX7突变体(G14-Gal4/UAS::flagSMN；SMNX7/SMNX7)或(D)神经元(nsyb-Gal4/UAS::flagSMN；SMNX7/SMNX7)的片段A3的肌肉的样品图像。SMN表达在肌肉中的恢复对肌肉大小没有作用，然而在神经元中的恢复完全解救了肌肉表面积。E-H.与对照标准化的肌肉表面积(E)、移动(F)、运动节律性(G)和NMJ eEPSP幅度(H)的定量。转基因SMN在神经元中的表达解救所有的smn突变表型，而在肌肉中的表达没有解救。误差线表示平均值的标准差。**＝p<0.01，***＝p<0.001，除了在附图中标出以外，相对于对照计算显著性。

图3.SMN表达在胆碱能神经元中需要而在运动神经元中不需要。A-D.对照(A)、SMNX7突变体(B)、转基因SMN在smn突变体(OK371-Gal4/UAS::SMN；SMNX7/SMNX7)的运动神经元中的表达(C)、转基因SMN在smn突变体(Cha-Gal4/UAS::SMN；SMNX7/SMNX7)的胆碱能神经元中的表达(D)的代表性迹线。转基因SMN在运动神经元中的表达不恢复smn突变体中正常的神经递质释放，然而SMN在胆碱能神经元中的表达恢复了正常eEPSP幅度。E-F.相对于对照标准化的肌肉表面积(E)、移动(F)、运动节律性(G)和NMJ eEPSP幅度(H)的定量。转基因SMN在具有OK371-Gal4的smn突变体的运动神经元中或在具有GAD1-Gal4的氨基丁酸能神经元(GABAergic neurons)中的表达不解救任何表型。相反，具有Cha-Gal4的转基因SMN胆碱能神经元的表达完全恢复了肌肉大小、移动速度和中枢运动节律性并恢复了NMJ处的正常eEPSP幅度(D)。**＝p<0.01,***＝p<0.001，相对于对照计算显著性。

图4.SMN在本体感受和中枢胆碱能神经元中需要。A.模式胆碱能神经元Gal4系(带斑点的)的表达。Cha-Gal4在中枢和感觉胆碱能神经元中表达。Clh201-Gal4仅在md和es感觉神经元中表达。1003.3-Gal4、ppk-Gal4和ppk-Gal4在md、es或ch感觉神经元的亚群中表达。斜影线(Diagonal hatchlines)表示解救smn突变表型的能力。B、C.在野生型(B)或SMNX7突变体(C)的腹神经索中UAS::CD8-GFP标记的具有NP2225-Gal4的bd和I型md感觉神经元的轴突。感觉轴突通常凸出到smn突变体的CNS中。D-G.相对于对照(基因型：Gal4/UAS::flagSMN；SMNX7/SMNX7)标准化的肌肉表面积(D)、移动(E)、运动节律性(F)和NMJ eEPSP幅度(G)的定量。转基因SMN在具有Cha-Gal4的smn突变体中的中枢和感觉胆碱能神经元中的表达完全解救所有表型。SMN所有感觉神经元的恢复增加了肌肉大小并完全解救了运动节律性和NMJ处的神经递质释放但不解救运动，这与恢复具有NP2225-Gal4的SMN本体感受I型md神经元和bd神经元类似。SMN在具有1003.3-Gal4或ppk-Gal4的II、III或IV型md神经元，es神经元或ch神经元中的恢复不解救任何smn突变表型。比例尺＝10μm。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，除了另有表示以外相对于对照计算显著性。

图5.SMN在胚胎形成后的恢复解救smn突变体。A.神经系统中转基因SMN诱导的示意图。RU486是转基因诱导被基因开关(geneswitch)Gal4激活所必须的。Elav::geneswitch/UAS::flagSMN；SMNX7/SMNX7幼虫转移至载体介质或包含介质的RU486在孵化后即刻、在孵化后48小时或孵化后96小时。B.由在孵化后0、48或96小时在载体培养基或RU486培养基上培养的smn突变体记录的代表性迹线。在各时点的每一个处的SMN的诱导完全解救了标准eEPSP幅度。C-F.相对于对照标准化的肌肉表面积(C)、移动(D)、运动节律性(E)和NMJ eEPSP幅度(F)的定量。如果转基因SMN在孵化后即刻被诱导，肌肉大小、移动和运动节律性完全被解救，但如果SMN诱导推迟，解救不完整。相反，SMN仅48小时的诱导足以完全恢复NMJ处的标准神经递质释放。误差线表示平均值的标准差。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，除了另有表示以外相对于对照计算显著性。

图6.抑制胆碱能神经元活动模拟smn突变表型。A.由在具有Cha-Gal4的胆碱能神经元中表达的对照NMJ或者UAS-人Kir2.1或UASPLTXII记录的代表性迹线。用Kir2.1抑制胆碱能神经元兴奋性或用PLTXII抑制神经递质释放提高了神经递质从运动神经元中的释放。B.Kir2.1或PLTX在胆碱能神经元中的表达破坏节律性运动活动。C-F.相对于对照标准化的肌肉表面积(C)、移动(D)、运动节律性(E)和NMJ eEPSP幅度(F)的定量。Kir2.1或PLTXII在胆碱能神经元中的表达不改变肌肉大小但的确减少移动速度、破坏运动节律性并提高诱发神经递质从运动神经元释放的幅度。*＝p<0.05，***＝p<0.001，除了另有表示以外相对于对照计算显著性。

图7.K+通道的基因或药理学抑制改善smn突变表型。A-C.来自(A)对照、(B)smn突变体和(C)在具有Cha-Gal4的胆碱能神经元中表达UAS显性失活(dominant negative)振荡筛K+通道(UAS-SDN)的smn突变体的运动路径追踪。表达SDN增加smn突变体运动的解救。D-G.相对于对照标准化的肌肉表面积(D)、移动(E)、运动节律性(F)和NMJ eEPSP幅度(G)的定量。SDN在具有Cha-Gal4的胆碱能神经元中的表达将smn突变体的肌肉大小(D)、移动(E)、运动节律性(F)和NMJ处的神经递质释放(G)恢复至对照水平。在幼虫发育过程中将2mM的4-氨基吡啶(4-AP)添加至培养基不改变对照动物的肌肉大小但增加smn突变体的肌肉大小(D)。4-AP的给药抑制对照动物的移动、运动节律性和神经递质释放。4-AP向smn突变体的给药校正移动(E)和NMJ处的神经递质释放(G)至没有显著区别于对照4-AP处理的动物的水平，并且基本上校正了运动节律性(F)的缺陷。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，除了另有表示以外相对于对照计算显著性。

图8示出SMNX7突变体与对照相比具有<6％的SMN蛋白水平。

图9A.smnX7突变体的NMJ mEPSP幅度与野生型(WT)对照类似。B.NMJ mEPSP频率在smnX7突变体中与对照相比增加。C.NMJ量子含量(quantal content)在smnX7突变体中与对照相比增加。D.smnX7杂合突变体具有与对照类似的NMJ eEPSP幅度。smnX7与smn73Ao或smnE33的反式等位(Transallelic)组合具有与smnX7纯合突变体类似的增加的NMJ eEPSP幅度。E.第三龄smnX7杂合和smnX7纯合突变体幼虫的片段A3的肌肉4的NMJ突触末端的代表性图片，用抗-CSP(绿色)染色以标记突触前和用抗-hrp(红色)染色以标记神经元膜。比例尺＝20μm。F.结数(bouton number)的定量。杂合vs.纯合smn突变体中结数无变化。误差线表示平均值的标准差。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001，相对于对照计算显著性。

具体实施方式

本发明基于如下发现：SMN必须在本体感受神经元和胆碱能中间神经元二者中恢复从而解救smn突变表型。进一步发现，在SMA动物模型中增加中枢胆碱能神经元的兴奋性增强运动网络活动并改变smn突变表型。实验显示，K+通道的药理学抑制(使用FDA-批准的广谱K+通道拮抗剂4-AP)积极地有助于smn突变表型，结果与作为SMN消耗的关键后果的通过中间神经元或感觉神经元输入产生的缺陷性兴奋性相一致。基于这些观察，本发明的特定实施方案涉及通过给药治疗有效量的一种以上的钾通道拮抗剂、特别是4-氨基吡啶(下文中为4-AP)、4-(二甲基氨基)吡啶、4-(甲基氨基)吡啶和4-(氨基甲基)吡啶(在此统称为"治疗剂")治疗SMA的方法。其它实施方案涉及包括两种以上的钾通道拮抗剂的新药物制剂。

综述

运动依赖于神经元网络的协调活动。已假设神经元回路的慢性功能障碍可最终导致网络内神经元的退化，既恶化损伤也掩蔽紊乱的主要原因(Palop和Mucke,2010)。SMA为婴儿死亡最常见的遗传原因(Pearn,1978)，并且其既是隐性的也是单基因的。SMA的特征在于运动神经元功能改变和退化。

在小鼠模型中另一种神经退行性疾病ALS的近期研究已鉴定其它脊髓细胞如星形胶质细胞对疾病病理的作用，暗示运动神经元与其它合作细胞之间的相互作用可能是运动神经元疾病的重要的影响因素(Ilieva等,2009)。

在小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫和酵母中发现，SMN遍在表达且在直向同源(orthologs)的进化中高度保守(Schmid和DiDonato,2007)。在遗传模型中，完全去除所有的SMN蛋白质导致细胞活力的丧失。相反，在SMA患者中发现的SMN水平的降低似乎并不显著扰乱大部分器官系统(Crawford和Pardo,1996)。然而，SMA患者发展为运动问题和肌无力，近端肢体和躯干肌传统上受到最严重地影响，最终进展为呼吸机能不全和死亡(Swoboda等,2005)。尸检研究显示SMA患者具有病理上异常的运动神经元和运动神经元损失的迹象(Simic,2008)，然而，目前还不清楚是否这是运动系统功能障碍的主要来源或最终结果。

大多数对SMA的研究在小鼠中完成，使用其中存在在运动神经元损失发生之前运动行为良好的深度早期损伤的SMA小鼠模型SMN-Δ7(Le等,2005,Park等,2010a)。大部分神经肌接点(NMJ)的末端受神经支配，尽管某些具有结构异常(Kariya等,2008；Kong等,2009；Ling等,2011；McGovern等,2008)，并且NMJ神经传递在量子含量减少-50％的这些突变体中是异常的(Kariya等,2008；Kong等,2009)。尽管如此，这些NMJ末端仍产生正常的肌肉颤搐(Ling等,2010)。

近来，除了运动神经元缺陷，在SMN-Δ7小鼠中已描述了脊髓反射的明显早期缺失和本体感受突触输入至运动神经元的数量降低，尽管这些变化对SMA表型的功能贡献还不了解(Ling等,2010；Mentis等,2011)。

本研究使用果蝇属(Drosophila)SMN突变体模型来研究与SMA相关的通路中的中枢感觉神经元、周围感觉神经元和运动神经元的神经回路(neurocircuitry)和生理学。

果蝇属SMN突变体模型

将具有减少的肌肉大小和缺陷性运动、运动节律性和运动神经元神经传递的果蝇属smn突变体开发用于确定运动系统中必要的细胞位点和SMN的需要。在果蝇属中，运动神经元是专一性谷氨酸能的，而周围感觉神经元和大部分兴奋性中间神经元均为胆碱能的(Baines,2006；Salvaterra和Kitamoto,2001)。强大的果蝇属smn突变体的表型解救通过增加突触神经递质释放的幅度和持续时间的电压门控钾通道(Kv通道)的遗传抑制来产生。虽然果蝇属中运动神经元和周围感觉神经元具有与哺乳动物相比不同的神经递质，但钾通道活化剂的作用是相同的，即增加神经递质释放和由此产生的动作电位。

本体感受神经元提供向运动回路的必要输入(Hughes和Thomas,2007)，并且胆碱能中间神经元对于果蝇属CNS功能是至关重要的(Kitamoto等,2000)，包括突触输出至运动神经元(Baines等,2001)。在完成神经系统发育完成后SMN的恢复足以解救SMN-依赖性表型，认为这并非连通性而是被SMN消耗所破坏运动回路的功能。两条线索进一步支持该观点。首先，抑制胆碱能神经元的活动可模拟若干smn突变表型，包括对运动神经元的非自主性作用。其次，通过K+通道抑制来增加运动回路的兴奋性可解救smn突变体缺陷。本结果证明，在果蝇属中SMN的消耗引起运动回路中选择的神经元亚群的功能障碍，结果扰乱了运动系统中其它网络组分例如运动神经元和肌肉的活动。这些发现将SMA果蝇属模型建立为由神经回路功能障碍诱导的神经系统疾病的范例。

结果概述

使用前述功能缺失型smn突变体(Chan等,2003；Chang等,2008；Rajendra等,2007)，(1)证实了SMN在果蝇属中的消耗导致与SMA表型类似的降低的肌肉生长和有缺陷的运动，和(2)这伴随有异常节律性运动输出和神经肌接点神经传递。出乎意料的是，这些缺陷都没有能够通过在肌肉或运动神经元中转基因恢复SMN来解救果蝇属smn突变体。更确切地说，现在已发现，SMN必须在本体感受神经元和胆碱能中间神经元二者中恢复，从而解救smn突变表型。该发现显示出运动神经元和肌肉的破坏是感觉运动网络活动的主要功能障碍的二次结果，并且进一步地，遗传或药理操作感觉神经元以增加运动回路的兴奋能力令人满意地有益于smn突变表型。xx

实施例1中的结果证实了果蝇属模型并且还示出果蝇属smn突变体已增加了NMJ诱发的神经递质释放，伴随肌肉生长、运动和运动节律性的缺陷(图1和2)。

实施例3中的结果示出，与SMN的肌肉恢复形成对照，SMN的泛神经元(pan-neuronal)恢复将smn突变体的肌肉表面积完全解救至对照水平(图2B、D、E)，并且还彻底恢复它们的运动速度、节律性运动输出和NMJ eEPSP幅度(图2F-H)。这些结果示出，在smn突变体幼虫中的肌肉生长缺陷是由于神经系统中正常SMN水平的非自主性需求，而不是由于肌肉纤维本身。

实施例3中的结果示出，SMN在胆碱能神经元中需要，而在谷氨酸能运动神经元中不需要，且SMN在本体感受和中枢胆碱能神经元二者中都需要。中枢胆碱能神经元中转基因SMN的表达水平完全解救了smn突变体的肌肉生长、运动和节律性活动缺陷(图3E-G)。此外，SMN在胆碱能神经元中的表达还将smn突变体的NMJ末端的eEPSP幅度完全解救至对照水平(图3D、H)。因此，SMN仅在胆碱能神经元中的表达足以完全解救smn突变表型并可非自主地解救运动神经元和肌肉二者的SMN-依赖性缺陷。另外的实验还示出，胚胎形成后的恢复SMN表达可解救smn突变体，表明它们不具有持久的运动回路组装缺陷。存在对SMN恢复的时机的差异表型敏感度，例如NMJ神经递质甚至在末期也可完全通过升高SMN水平来纠正，而运动、运动节律性和肌肉生长需要较早且较长的持续时间暴露于增加的SMN水平。最后，胆碱能神经元活动的抑制复制了若干smn突变体的特征，包括对运动神经元的神经递质释放性质的非细胞自主作用，与smn突变体中具有降低的功能的运动回路中的胆碱能感觉神经元相一致。

实施例4建立在smn突变体中运动回路具有功能缺陷的假设之上，设计实验来试验是否增加这些动物中的中枢胆碱能神经元的兴奋性能够增加运动网络活动和改变smn突变表型。各种实验的结果示出，K+通道的药理学抑制(使用FDA-批准的广谱K+通道拮抗剂4-AP)令人满意地有益于smn突变表型，结果与为SMN消耗的重要结果的运动回路通过它们的中间神经元或感觉神经元输入产生的缺陷型兴奋性相一致。

结果讨论

示于此处的结果显示，至少两组运动回路神经元(bd和I型md感觉神经元)中SMN的恢复导致完全解救幼虫表型。bd和I型md感觉神经元是果蝇属幼虫的协调收缩运动所必须的本体感受感觉反馈回路的重要组分(Hughes和Thomas,2007)。感觉神经元的bd和I型md亚群均表达本体感受所必须的机制敏感性(mechanosensitive)NompC mechanosensitive NompC TRP通道(Cheng等,2010)。感觉反馈似乎并不是果蝇属幼虫中枢图形发生器组装或基础的胚胎和幼虫运动所必须的(Crisp等,2008)，然而在没有感觉输入下，节律性运动回路活动(Fox等,2006)和协调的运动行为均严重破坏(Hughes和Thomas,2007；Song等,2007)。SMN在bd和I型md感觉神经元中的解救恢复了smn突变体的节律性运动输出，与调节该活动时感觉输入的重要作用相一致(Fox等,2006)。然而，SMN在单独本体感受神经元中的恢复并不足以纠正smn突变体的运动速度，表明其它神经元需要野生型SMN水平来恢复完全的运动性。

发现所有胆碱能中枢感觉神经元中的SMN表达完全解救了包括运动在内的所有smn突变体幼虫表型。这些结果因此涉及在一组或多组中枢胆碱能神经元中SMN的其它细胞自主性需求。在不受理论约束下，很可能这些神经元能够降低来自脑(Cattaert和Birman,2001)或促进有效运动所必须的协调的部分中枢图形发生器之间的其它连接的输入。然而，在解救分析阐明单独的运动回路组分可对某些smn突变表型作出重大贡献的同时，其它表型如肌肉生长附加地需要在中枢和周围胆碱能神经元二者中正常水平的SMN表达。

奇怪的是，仅胆碱能运动回路神经元选择性地对SMN消耗敏感。鉴定了在(Lotti,Imlach等)SMN-依赖性缺陷中胆碱能神经元功能所需的基因的剪接，并且其示出，如SMN的，其必须特别地在胆碱能神经元中恢复来解救smn突变表型。加上此处所示的结果，可见SMN消耗破坏了基因亚群的表达，其中某些基因是胆碱能运动回路神经元非常需要的。这些结果确立了将SMN在RNA剪接中的作用与运动回路功能的易损性机械连接至SMN的减少。

运动回路的基本要素-本体感受神经元、中间神经元和运动神经元在果蝇属和人类之间是保守的，尽管在各系统中采用的神经递质不同(Marder和Rehm,2005)。例如，人类和小鼠的运动神经元是胆碱能的，而本体感受神经元是谷氨酸能的，果蝇属运动回路中采用的神经递质相反。然而，尽管如此，果蝇属模型与人类SMA治疗相关，因为通过使中枢感觉神经元与钾离子通道活化剂接触而延长神经递质释放不是神经递质-特异的；药物非特异性地延长动作电位，从而增加神经递质释放。在不受理论约束下，很可能胆碱能神经元具有对SMN降低水平特定且保守的敏感性。

SMN在果蝇属smn突变体的本体感受神经元中的恢复足以恢复运动神经元中正常NMJ神经递质释放性质。这表明即使在没有直接的突触接触下，增加这些神经元中的SMN也可影响运动神经元的电生理性质，大概是通过中间的中间神经元连接。因此，很可能的是，虽然运动回路连接的具体细节在果蝇属和脊椎动物之间不同，但运动网络的基本关系和功能是保守的且对SMN消耗选择性敏感。

用小分子K+通道拮抗剂4-AP以及4-(二甲基氨基)吡啶(数据未示出)处理恢复了果蝇属smn突变表型。在野生型动物中，4-AP处理不影响肌肉大小但的确减少运动并如可能预期的，通过系统抑制在整个神经系统和肌肉中存在的K+通道抑制NMJ神经递质释放(Wicher等,2001)。尽管如此，4-AP的给药显著增加了smn突变体的肌肉面积和运动二者并完全纠正了节律性运动输出和NMJ神经传递中的缺陷。

用4-AP的处理已与患有脊髓损伤、重症肌无力和兰-伊氏综合征(Lambert-Eaton syndrome)的患者的功能改善相关联(Hayes,2007)，并能够改善犬遗传性运动神经元疾病中的肌肉颤搐张力(Pinter等,1997)。4-AP缓释制剂近来已被FDA批准用于多发性硬化症的人类临床用途(Chwieduk和Keating,2010)。然而人，直至本发现，还未知任何水平下涉及中枢感觉神经元的SMA。

数据显示，4-AP在果蝇属smn突变体模型中的效力可能经由其对感觉-运动回路中的胆碱能神经传递时的活动。将该发现外推至人类，可在脊髓内起作用增加神经递质从感觉神经元释放从而增加运动中枢网络的兴奋性的其它化合物如4-AP，并且这些还可用作治疗剂来缓解脊髓性肌萎缩的症状。

本发明的实施方案

已发现SMA可通过给药治疗有效量的配制成穿过血脑屏障的4-AP(或其生物学活性衍生物或变体)来治疗。本发明中可使用其他钾离子通道拮抗剂，包括4-(二甲基氨基)吡啶、4-(甲基氨基)吡啶和4-(氨基甲基)吡啶，单独或相互组合来治疗SMA。治疗剂可以如下述"药物制剂"所讨论的在同一天或在不同的日子给药。

用于本发明的其它K+通道拮抗剂包括多非利特(Dofetilide)、索他洛尔(Sotalol)、依布利特(Ibutilide)(其由食品药品管理局批准用于急性房颤转窦性节律)、阿奇利特(Azimilide)、溴苄胺(Bretylium)、氯非铵(Clofilium)、E-4031、尼非卡兰(Nifekalant)、替地沙米(Tedisamil)和司美利特(Sematilide)。

某些其它实施方案涉及超过一种治疗剂的制剂，包括优化药物穿过BBB能力的制剂。

治疗性K通道拮抗剂和剂量

4-氨基吡啶也称作INN氨吡啶(fampridine)和达伐吡啶(dalfampridine)(Acorda Therapeutics,Inc.,New York,以名称销售)。4-AP为具有化学式C₅H₄N-NH₂的有机化合物。该分子为吡啶的三种同分异构胺之一。4-AP为电压激活钾+通道Kv1(Shaker,KCNA)家族成员的相对选择性阻断剂。在1mM的浓度下其选择性且可逆地抑制Shaker通道而没有对其它钠、钙和钾导电性的显著作用。虽然其长期以来一直用作区分钾通道的亚型的研究工具，但其已被FDA批准用于控制多发性硬化症的某些症状，并且显示患有该疾病的几种变体的成年人行走的症状改善，(Solari A,Uitdehaag B,Giuliani G,Pucci E,Taus C(2001).Solari,Alessandra.编辑"Aminopyridines for symptomatictreatment in multiple sclerosis".Cochrane Database Syst Rev(4)；Korenke AR,Rivey MP,Allington DR(2008年10月)."Sustained-release fampridine forsymptomatic treatment of multiple sclerosis",Ann Pharmacother 42(10):1458-65；New Drugs:Fampridine".Australian Prescriber(34):119-123,August2011)。该药物在美国具有罕见病用药(orphan drug)的地位，商品名为Neurelan。氨吡啶还以由Acorda Therapeutics在美国销售(FDA批准Ampyra改善患有多发性硬化症的成年人的行走。

氨吡啶(4-AP)还在临床上用于患有脊髓损伤、重症肌无力和兰-伊氏综合征的患者(Hayes,2007)，并且可改善犬遗传性运动神经元疾病中的肌肉颤搐张力(Pinter等,1997)。其为延长动作电位并因而增加神经递质从神经元释放的广谱类钾通道拮抗剂。该药物还显示在动物实验中逆转河豚毒素的毒性。用4-AP处理的MS患者显示29.5％至80％的反应率。长期研究(32个月)表明对4-AP最初响应的80-90％的患者显示长期受益。用4-AP处理已与患有脊髓损伤、重症肌无力和兰-伊氏综合征的患者的功能改善相关联(Hayes,2007)，并且可改善犬遗传性运动神经元疾病中的肌肉颤搐张力(Pinter等,1997)。

在17名温度敏感的MS患者中试验临床使用的4-AP的各种剂量，剂量范围是在1至5天中以3至4小时的间隔、以1至3次每日剂量为7.5至52.5mg的4-AP。与安慰剂(placebo)组相比给予4-AP的17名患者中13名(76％)显示临床上重要的运动和视觉改善。70％的每日4-AP改善持续7至10小时。与安慰剂的2.36小时(平均9.06小时治疗-观察期的26％)相比，4-AP两次连续剂量的改善持续平均7.07小时(平均8.53-小时治疗-观察期的83％)。没有严重的副作用发生。Stefoski D,等；Neurology.1991Sep；41(9):1344-8；4-Aminopyridine inmultiple sclerosis:prolonged administration。FDA批准剂量每天2次口服10mg。

治疗有效量将根据各种因素变化，包括：1.是否给药一种或超过一种试剂；2.该试剂单独或与其它试剂组合的效力；3.制剂的种类，例如缓释制剂，由于药物缓慢释放而可具有较高的量；4.患者的年龄，疾病的严重程度；5.给药频率；和6.个体受试者对试剂的耐受和响应。

药物制剂和给药

在特定实施方案中，多重治疗有效量的一种以上的治疗剂根据改善疾病的一种以上的症状的需要而一天或经数周或数月的疗程给药。治疗剂可单独给药(即仅用一种特定的试剂处理)，或超过一种试剂可单独或组合给药。该试剂可每日一次或超过一次给药。不同试剂的治疗有效量可根据特定试剂以及该试剂是否单独给药或与另一试剂一起给药而变化。治疗有效量还将基于特定制剂变化。

用于本方法的药物组合物包括治疗有效量的一种以上的治疗剂，即足以预防或治疗患者的本文所述疾病，将该治疗剂配制用于局部或全身给药。受试者优选人但也可为非人。适合的受试者可为怀疑患有所述疾病、已诊断为患有所述疾病、或处于发展所述疾病的风险的个体。

治疗性给药的活化剂优选低毒且穿过血脑屏障。该治疗的进程容易通过可用于调节剂量以实现期望疗效的常规技术和分析来监控。

治疗剂的组合物还可包括药物学可接受载体。如本文所述，词汇"药物学可接受载体"包括与药物学给药相容的溶剂、分散介质、包衣(coatings)、抗病毒剂、抗菌剂、抗真菌剂以及等渗和吸收延迟剂等。增补活性化合物也可并入组合物中。其它局部制剂记载于Sheele等,7,151,091中。

治疗组合物可包含例如通常采用的作为粘结剂、填料、载体、防腐剂、稳定化剂、乳化剂、缓冲液和赋形剂的添加剂，例如制药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁等。这些组合物典型地包含l％-95％的活性成分，优选2％-70％的活性成分。

还可根据给药途径和标准药学实践治疗剂与相容的且生理可耐受的稀释剂或赋形剂混合。适合的稀释剂和赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖或甘油等，及其组合。另外，如果需要，该组合物可包含较小量的佐剂物质如湿润剂或乳化剂、稳定化剂或pH缓冲剂。

在某些实施方案中，本发明的治疗组合物制备为液体溶液或悬浮液，或以固体的形式，优选用于口服。制剂可包括通常采用的添加剂如粘结剂、填料、载体、防腐剂、稳定化剂、乳化剂、缓冲液和赋形剂，例如制药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁等。溶液、悬浮液或缓释制剂典型地包含l％-95％的活性成分，优选2％-70％。

对于特定的治疗指示，制剂还可在必要时包含超过一种的治疗剂，优选具有互补活性的不会相互不利影响的那些。此类分子适合以有效用于预期目的的量组合存在。

缓释制剂的适合的实例包括包含治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透型基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微囊体。缓释基质的实例包括，但不限于聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，非降解性乙烯-乙酸乙烯酯，降解性乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)组成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟丁酸。虽然聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶在较短的时间内释放蛋白质。

本发明的治疗剂可配制为用于通过任意适合的手段给药，只要它们穿过血脑屏障(BBB)即可。配制穿过BBB的治疗剂的策略是公知的且包括下述：

·增加BBB的渗透性(开放)

○血脑屏障的渗透性开放

○化学开放

○大脑血管舒张：蝶颚骨神经节的刺激、氧化氮吸入

○通过聚焦超声破坏血脑屏障

·促进穿过BBB运输的药理学策略

○修饰药物以增强其脂质溶解度

○使用运输/载体系统

○抑制阻碍药物递送的外流性转运蛋白

○特洛伊木马法(Trojan horse approach)

○嵌合肽

○单克隆抗体融合蛋白

○前体生物转化策略

○基于纳米颗粒的技术

○神经免疫亲和素(Neuroimmunophilins)

递送药物至脑的代替为直接向脑或脊髓给药，因而绕过BBB。这可例如通过注射入硬膜外静脉丛或直接将药物引入脑、脊柱或脑脊液(CSF)来完成。药物泵能够促进本发明方法中的治疗剂连续给药。

脂质体可用于递送小分子至脑。特别有用的脂质体可通过例如利用包括卵磷脂、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物的反相蒸发法来产生。脂质体通过规定孔径的滤器挤出，从而产生具有期望直径的脂质体。例如Werle等,Int.J.Pharm.370(1-2):26-32(2009)中所记载的，本发明的多肽可缀合至脂质体。

对于用于制备递送至脑或脊髓的药物的方法的综述，参见ReinhardGabathuler,Neurobiology of Disease 37(2010)48-57Approaches to transporttherapeutic drugs across the blood-brain barrier to treat brain diseases。还参见Journal of Drug Delivery Volume 2011,Article ID 469679,doi:10.1155/2011/469679。综述文章Carlos Spuch和Carmen Navarro,Liposomes forTargeted Delivery of Active Agents against Neurodegenerative Diseases(Alzheimer's Disease and Parkinson's Disease)。

对于体内给药，药物组合物优选口服或肠道外给药，即关节内、静脉、腹膜内、皮下或肌内给药。在特定的实施方案中，药物组合物通过推注(bolusinjection)静脉或腹膜内给药。Stadler,等,U.S.Pat.No.5,286,634。对于预防或治疗疾病，适当的剂量将依赖于疾病的严重程度、药物是否处于预防或治疗目的而给药，先前的治疗，患者的病史和对药物的响应，以及主治医师的酌情决定权。

所得药物制剂可通过常规、公知的灭菌技术来灭菌。水溶液可接着包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干制剂与无菌水溶液在给药前结合。该组合物可根据接近于生理条件的需要包含药物学可接受辅助物质，例如pH调节和缓冲剂和肌肉弹性调节剂(tonicity adjusting agents)等，如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。另外，脂质悬浮液可包括储存时保护脂质免受自由基和脂质过氧化损伤的脂质保护剂。亲脂性自由基淬灭剂如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂如铁草胺(ferrioxamine)是合适的。

本发明的药物组合物可为各种形式，可根据优选的给药模式来选择。这些包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮剂、栓剂以及可注射和难熔性(infusible)溶液。优选的形式依赖于期望的给药模式和治疗用途。

本发明的药物组合物可例如置于无菌、等渗的、有或没有刺激摄取或稳定性的辅因子的制剂中。制剂优选为液体，或可为冻干粉末。例如，本发明的组合物可用包括5.0mg/ml的一水柠檬酸、2.7mg/ml的柠檬酸三钠、41mg/ml的甘露醇、1mg/ml的甘氨酸和1mg/ml的聚山梨醇酯20的配制缓冲液稀释。该溶液可冻干、在冷冻下储存并在给药前用注射用无菌水(USP)复原。

适合的溶剂合物包括水合物。适合的盐包括由有机酸和无机酸或碱形成的那些。药物学可接受的碱式盐包括铵盐，碱金属盐如钠和钾的碱金属盐，碱土金属盐如钙和镁的碱土金属盐，以及与有机碱形成的盐例如二环己基胺和N-甲基-D-还原葡糖胺。

本发明中使用的适用于口服的制剂可表现为独立的单元如各自包含预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂(cachets)或片剂；表现为粉末剂或颗粒剂；表现为溶液或水性液体或非水性液体中的悬浮剂；或者表现为水包油型液体乳液或油包水型液体乳液。活性成分还可表现为大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)。

肠胃外给药制剂包括水性和非水性无菌注射液，该无菌注射液可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和致使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，该无菌悬浮液可包括悬浮剂(suspending agents)和增稠剂。制剂可表现为单位剂量或多剂量容器，例如密封安瓿和小瓶，并可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前即刻添加无菌液体载体如盐水或注射用水即可。临时注射液和悬浮液可由前述种类的无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备。

本发明的治疗剂可同时给药，也就是给药药剂以使在受试者中同时存在单独的药剂。除了伴随而来的药剂(经相同或不同途径)给药以外，同时给药可包括在不同时间给药药剂(经相同或不同途径)。

定义

一般而言，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术以及与其关联使用的术语为本领域公知且常用的那些。本发明的方法和技术一般根据本领域公知的且如各种一般性和更具体的文献所记载的常规方法进行，除非另有说明，在本说明书中引用并讨论这些文献。参见，例如，Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989)；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992，2002年补充)；Harlow和Lane Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)；Principles of Neural Science，第四版，Eric R.Kandel,James H.Schwart,Thomas M.Jessell编辑，McGraw-Hill/Appleton & Lange:New York,N.Y.(2000)。除非另有规定，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普

通技术人员通常理解的含义。

术语"个体"、"受试者"和"患者"在本文可互换使用并指期望诊断、处理或治疗的任何哺乳动物受试者，特别是人。本文使用的"受试者"通常是指任何活的多细胞生物。受试者包括，但不限于动物(如牛、猪、马、羊、狗和猫)和植物，包括类人动物(hominoids)(如，人类、黑猩猩和猴)。该术语包括转基因和克隆物种。术语"患者"指人和兽医受试者。

"给药"应指以使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种来影响或进行的方式递送。给药可例如口服、或静脉注射、经植入、经粘膜、经皮、皮内、肌内、皮下或腹膜内进行。给药还可例如一次、多次和/或经一段或多段持续期地进行。

短语"治疗有效量"指足以产生治疗结果的量。通常治疗结果是通过诱导或增强生理过程、阻断或抑制生理过程或者概括而言进行辅助或有助于疾病或病况消除或减轻的生物学功能来实现的疾病或病况的客观或主观的改善。例如，消除或减少或缓和疾病或一种以上的症状集合的严重程度。完全的疗效不必通过一个剂量给药而产生，并且可仅在一系列剂量给药后产生。因此，治疗有效量可以一次以上的给药来施用。

"治疗"疾病指采取步骤获得益处或期望的结果，包括临床结果，例如缓和、缓解或改善疾病的一种以上的症状；削弱疾病程度；延缓或减缓疾病进程；改善和减轻或稳定疾病的度量(统计)。"治疗"指采取的步骤。

"缓和"指减少或改善疾病或疾病的症状。例如，缓和可通过在疾病的表型表现之前(即，在疾病症状出现之前)给药治疗剂来实现。缓和包括通过避免、包含、减少或除去疾病或疾病的症状而使疾病的作用较不严重。缓和本文所记载的所列举疾病在症状发生之前"治疗"所列举疾病的定义范围内。缓和疾病的治疗剂的量在此称作"治疗有效量"。

实施例

材料和方法

果蝇属原种(stocks).smnX7(Chang等,2008)是除去从转录起始位点上游93bp直至3'UTR的最后44bp的整个smn编码区的小的删除，而不破坏其它基因座。在常规培养条件下，存活至第三龄的纯合子smnX7突变体的数量很少，这与之前的报道一致(Chang等,2008)，然而，如果原种在低密度下培养，能够可靠地确定存活到该阶段的数量增加。为此，使亲本原种(parental stocks)和对照在增补有酵母膏(yeast paste)的葡萄汁琼脂板上静置过夜，然后将板移去并在25℃下培养直至动物达到第三幼虫龄期。smn73Ao是产生不稳定蛋白质的强功能缺失点突变等位基因。结果不同于基于SMN73Ao等位基因的之前的电生理学观察，该观察报道在这些动物的NMJ处诱发的神经递质释放降低(Chan等,2003)。该发现在一个SMN73Ao原种(B#4802)中得到重复，然而，该缺陷不能通过转基因SMN解救(数据未示出)。证实具有低SMN，已经历了与野生型背景的多次回交的一个不同的SMN73Ao原种(Greg Matera所赠,UNC)具有与纯合子中和在交叉杂合组合(transheterozygous combinations)中的smnX7和其他smn突变体等位基因类似的eEPSP幅度增加(附图2D)。结论是前述发现可能已由第二位点突变引起。类似地，smnX7突变体中观察到形态学突触结(synaptic boutons)没有变化，即使之前已报道了SMN73Ao等位基因的降低(Chan等,2003；Chang等,2008)。这些结果与也显示很少的或不显示NMJ形态变化的其它'强'smn等位基因的观察一致(Chang等,2008)。如之前的研究一样，转基因SMN的遍在表达可解救成虫的生存力、移动和肌肉大小(Chan等,2003；Chang等,2008；Rajendra等,2007)，然而，发现与之前报道的肌肉或神经元表达充分(Chan等,2003)相反，仅需要具有nsyb-Gal4或基因开关elav-Gal4的神经元的仅SMN表达来解救SMN突变体中的移动。该矛盾的一个可能解释是用于这些研究的中胚层how24B-Gal4的驱动子(driver)(Brand和Perrimon,1993)除了强肌肉表达以外具有显著的神经元表达。UAS::Flag-Smn–具有在染色体II插入的氨基-端Flag序列的全长Smn蛋白质(Chang等,2008)。使用抗-Flag免疫组织化学法证实靶标的表达(数据未示出)。UAS-PLTXII从N至C端组装的作为分泌信号序列的膜锚定的(Membranetethered)PLTXII，成熟裂解的PLTX-II肽序列，嵌合有c-Myc表位tag的亲水连接子序列，和GPI靶向序列(targeting sequence)(B.C,Michael Nitabach和BDM，未公开出版)Gal4系：nsyb-Gal4(Bushey等,2009)，OK6-Gal4、G14-Gal4(Aberle等,2002)，OK371-Gal4(Mahr和Aberle,2006)，Actin-Gal4(Ito等,1997)，Cha-Gal4(Salvaterra和Kitamoto,2001)，clh201-Gal4、1003.3-Gal4(Hughes和Thomas,2007)，ppk-Gal4(Ainsley等,2003)NP2225-Gal4(Sugimura等,2003)，Gadl-Gal4(Ng等,2002)和elav-基因开关(Osterwalder等,2001)。UAS系：UAS-Flag-Smn(Chang等,2008)、UAS-Kir2.1(Paradis等,2001)、UAS-PLTXII和UAS-SDN(Mosca等,2005)电生理学.NMJ电生理学：如前所述进行片段A3的肌肉6的细胞内记录(Imlach和McCabe,2009)。简言之，解剖第三幼虫龄期并在包含1.0mM Ca2+的HL3盐水中进行记录。数据仅由静止膜电位小于-55mV的记录分析。使用Axoclamp 2B扩增仪进行记录。数据在1kHz下进行低通滤过，数字化，并使用Digidata 1322A接口记录至磁盘。eEPSPs和mEPSPs幅度均使用MiniAnalysis程序(Synaptosoft,Inc.)的峰值检测功能测量。所有事件在基因型设盲时手动核实。mEPSPs的幅度和频率由缺失刺激下的连续记录计算(50-100s)。通过在校正非线性求和误差(Martin,1955)后计算(eEPSP幅度/mEPSP幅度)(Davis等,1998)来计算每个单独记录的量子含量。运动节律性：如之前描述记录自发运动节律性(Fox等,2006)。简言之，在标准盐水(Jan和Jan,1976)中进行腹部片段A3的肌肉6的记录，其中CNS和运动神经元是完整的。为了测量平均中间事件间隔，使用MiniAnalysis(Synaptosoft,Inc.)的峰值检测功能检测在3分钟的时间内发生的所有自发eEPSPs事件。移动：基本上如之前描述的进行分析(Suster和Bate,2002)。简言之，将单个幼虫在25℃和70％湿度下置于灯箱上的1％琼脂板上。1分钟适应新环境后，用安装在EMZ-8TR显微镜上的摄像机Sentech STC-620CC视频摄影机捕捉移动路径的记录并用Final Cut Express v 4.0(Apple)记录。这些用QuickTime v7.6.4(Apple)转换成quicktime.mov文件。之后使用DIAS v 3.4.2(Soil Technologies)软件分析路径长度和速度。NMJ免疫组织化学.如之前所述在第三幼虫龄期左右时解剖(Brent等,2009a；Brent等,2009b)。使用Zeiss Axio图像仪上的40×目镜计数Ib和Is型膨体(bouton)。Z1显微镜在肌肉4腹部片段A3。使用的抗体为鼠抗半胱氨酸串连蛋白(cysteinestring protein)(CSP,1:200,爱荷华大学的发展研究杂交瘤库(DevelopmentalStudies Hybridoma Bank at the University of Iowa))、Cy5-缀合的山羊抗辣根过氧化物酶(1:400,Jackson ImmunoResearch)和山羊抗鼠Alexa488(1:2000,Invitrogen)。在Zeiss LSM 510共聚焦显微镜上拍摄幼虫制备物。

免疫印迹.将下列单克隆抗体用于免疫印迹：果蝇特异的抗-SMN(Chang等,2008)、抗-β肌动蛋白(Sigma)、抗-微管蛋白DM 1A(Sigma)和抗-FLAG(Sigma)。用于免疫印迹分析的总蛋白提取物通过SDS样品缓冲液(2％SDS、10％甘油、5％β巯基乙醇、60mM Tris-HCl pH 6.8、溴苯酚蓝)中的果蝇属第三幼虫龄期的均质化，接着简单超声处理和煮沸来制备。蛋白浓度使用RCDC蛋白分析(Bio-Rad)测量。通过12％聚丙烯酰胺凝胶上、接着转移至硝酸纤维素膜上的SDS/PAGE来分析所有蛋白质样品。

果蝇属原种：smnX7(Chang等,2008)、smn73Ao(Chan等,2003)、smnE33(Rajendra等,2007)。

肌肉测量：肌肉面积测量在鬼笔环肽染色的肌肉里脊制备物(musclefillet preparations)的片段A3的肌肉6处进行(Brent等,2009).

移动：基本上如之前所述进行幼虫移动分析(Suster和Bate,2002)(参见补充信息)。

运动节律性：如之前所述记录自发运动节律性(Fox等,2006)。为了测量平均峰电位间隔，使用MiniAnalysis(Synaptosoft,Inc.)的峰检测功能检测在3分钟的时间内发生的所有自发eEPSPs事件。

NMJ电生理学：如之前所述进行来自肌肉6，片段A3的细胞内记录(Imlach和McCabe,2009)。

药物处理：基因开关GAL4 SMN表达通过在SMN突变体表型测量之前用l0g/ml的RU486培养148小时、96小时、72小时或48小时幼虫来诱导(所有对照都在L3阶段左右时分析)。SMN诱导通过免疫印迹证实。对于4-AP处理，将2mM 4-AP(Sigma)加入在孵化后即刻培养幼虫并贯穿随后整个幼虫期的酵母膏。

统计学方法：如使用Instat 3.0(GraphPad)所说明的通过ANOVA检测显著性。在所有附图中，误差线表示平均值的标准差，且*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。

实施例1.果蝇属smn突变体模型的确认。

为了在果蝇属中模拟SMA患者中发现的低水平SMN，使用接合蛋白(zygotic protein)冗余的SMN等位基因(smnX7)，其具有除去整个smn编码区但不破坏附近的基因座的小缺陷(Chang等,2008)。这些动物中剩余的SMN由母体蛋白贡献，与第三幼虫龄期时的对照相比，该母体蛋白提供<6％的SMN水平(附图1A)。smnX7突变体从未起始蛹化，但反而持续第三幼虫龄期，通常在该阶段存活超过5天，与之前的其它smn突变体等位基因的观察(Chan等,2003)相一致。

为了证实该表型依赖于SMN，使用Actin-Gal4在smnX7突变体中遍在表达转基因UAS flag-tagged SMN构建体(Chang等,2008)。这恢复了smnX7突变体的正常蛹化，其中100％的幼虫起始蛹化和>80％随后接近产生可存活的成虫(数据未示出)。因此，smnX7突变体在幼虫阶段晚期具有低水平的SMN并可通过转基因SMN来解救。除非另有注释，否则将该突变等位基因用于所有随后的实验。

果蝇属smn突变体幼虫比对照动物小。为了验证这是否与肌肉大小减少相关，将smn突变体和对照幼虫的肌肉用鬼笔环肽标记。结果显示smn突变体的肌肉表面积与对照相比具有46％(P<0.001)的减少(图1A-C，还参见表S1)。通过转基因SMN的遍在表达完全解救该缺陷。Smn突变体幼虫比对照行动迟缓且行动频率低。为了定量该缺陷，将视频捕捉和追踪软件用于测量smn突变体和对照幼虫的移动。结果显示，smn突变体的移动速度与对照动物相比显示63％(P<0.001)的降低，这通过转基因SMN的遍在表达恢复至对照水平(图1D-F)。因此，与SMA患者类似，具有低水平SMN的果蝇属具有肌肉和移动缺陷。

果蝇属幼虫的移动已与腹神经索(VNC)中的节段中枢模式生成网络(CPGs)的节律性活动相关联(Fox等,2006)，其接收来自脑半球(Cattaert和Birman,2001)和本体感受感觉神经元(Cheng等,2010；Hughes和Thomas,2007；Song等,2007)的输入并输出活动至运动神经元。为了测量这些模式生成神经元的活动，在左脑和VNC留在原位的制备物中记录运动神经元的自发活动(Fox等,2006)。在对照动物中，运动活动以规律性间隔的周期性爆发与之前的研究一致(Cattaert和Birman,2001；Fox等,2006)(图1G)。相反，该活动在smn突变体中破坏，在smn突变体中具有短的不规则爆发，持续时间也变化(图1H)。该缺陷通过测量smn突变体和对照中在固定的时间内所有自发峰事件(spike events)之间的峰电位间隔来定量。与对照相比，smn突变体显示90％(P<0.001)的峰电位间隔增加(图1I)。正如移动的情况一样，正常的节律性运动活动通过转基因SMN的遍在表达被完全恢复。因此，在果蝇属smn突变体中运动回路的输出是缺陷的。

单个运动神经元的神经递质释放性质

将脑除去并使用吸力电极(suction electrode)直接刺激运动神经元(Imlach和McCabe,2009)。与对照相比，smn突变体的NMJ处诱发的兴奋性突触后电位(eEPSP)幅度存在23％(P<0.005)的增加(图1J-L)。NMJ eEPSP幅度在smnX7突变体中的增加通过转基因SMN的遍在表达恢复至对照水平(图1L)。还观察到小型兴奋性突触后电位(mEPSP)频率60％(P<0.05)的增加。相比之下，smn突变体NMJ末端处的mEPSP幅度与对照没有不同(附图2A,B)，导致量子含量64％(P<0.001)的增加(附图2C)。这些发现与smn突变体中运动神经元的神经递质释放性质的突触前变化一致。进行smnX7与其它smn突变体等位基因的交叉杂合组合(trans-heterozygous combinations)，结果证实这些突变体中eEPSP幅度的类似变化，这在杂合smnX7动物中未发现(附图2D)。当研究smnX7突变体NMJ的形态特征时，突触结的数量与对照相比没有显著差异(附图2E)。总之，果蝇属smn突变体具有增加的NMJ诱发的神经递质释放，伴随有肌肉生长、移动和运动节律性的缺陷。

实施例2.神经系统中SMN的恢复解救smn突变表型。

SMN的消耗除了扰乱肌肉生长以外扰乱果蝇属运动系统的多重输出。为了鉴定对正常SMN水平的细胞自主需求，反复地将更加组织-限定的Gal4驱动子用于评价smn突变体的解救。首先，使用幼虫肌肉特异的驱动子G14-Gal4仅在smnX7突变体的肌肉中表达转基因SMN。这不产生肌肉表面积的显著增加(图2C,E)或者对smn突变体的移动、节律性运动输出和NMJ eEPSP幅度的影响(图2F-H)。

接下来，仅在使用神经元特异的nsyb-Gal4驱动子的smn突变体的神经系统中试验SMN恢复。与SMN的肌肉恢复相反，SMN的泛神经元恢复将smn突变体的肌肉表面积完全解救至对照水平(图2B,D,E)，而且还彻底恢复了它们的移动速度、节律性运动输出和NMJ eEPSP幅度(图2F-H)。smn突变体的仅神经元解救不足以产生可存活的果蝇属成虫(数据未示出)，推测是由于未被解救的组织中的SMN水平变得完全消耗至损害细胞存活力的点(Chan等,2003)。结果表明，smn突变体幼虫中肌肉生长的缺陷是由于神经系统中而非肌肉纤维本身正常SMN水平的非自主性需求。

实施例3.SMN在胆碱能神经元而非运动神经元中需要。

与人脊髓类似，果蝇属VNC由具有多种神经递质表达的神经元填充。除了中枢中间神经元亚群以外，所有果蝇属运动神经元为谷氨酸能的(Daniels等,2008)。由于在smn突变体的NMJ处存在神经递质释放的突触前缺陷，所以试验转基因SMN在运动神经元中表达以解救smn突变体的能力。OK371-Gal4用作在囊泡谷氨酸转运体(vesicular glutamate transporter)启动子中嵌入的增强子陷阱(enhancer trap)，从而仅在smn突变体的谷氨酸能神经元中表达转基因SMN。这与单独smn突变体相比不产生肌肉表面积、移动速度或节律性运动输出的差异(图3F-G)。出乎意料的是，这些动物的NMJ处的eEPSP幅度的异常增加没有减少(图3B,C,E)。使用第二独立的运动神经元特异性驱动子OK6-Gal4证实该不期望的结果(图3E-H)。因此，类似于肌肉生长中对SMN的需求，smn突变体的NMJ处的异常神经递质释放不是运动神经元中SMN的细胞自主缺失的结果。该结果促进了调查研究来确定是否在果蝇属运动回路中的其它神经元类型中需要SMN。

抑制输入是运动回路功能的重要调节剂(Featherstone等,2000)，所以将谷氨酸脱羧酶1启动子Gal4用于恢复氨基丁酸能神经元中的SMN，然而未见任何smn突变表型的显著解救(图3EH)。果蝇属神经系统中的大多数兴奋性神经元是胆碱能的(Salvaterra和Kitamoto,2001)，运动神经元从胆碱能神经元接收突触输入(Baines,2006)。因此，转基因SMN在使用胆碱乙酰转移酶(Cha)启动子-驱动的Gal4的smn突变体中恢复。与谷氨酸能和氨基丁酸能驱动子相反，胆碱能神经元中转基因SMN的表达水平完全解救smn突变体的肌肉生长、移动和节律性活动缺陷(图3E-G)。此外，SMN在胆碱能神经元中的表达还将smn突变体的NMJ末端的eEPSP幅度完全解救至对照水平(图3D,H)。因此，SMN仅在胆碱能神经元中的表达足以完全解救smn突变表型并能够非自主地解救运动神经元和肌肉二者的SMN-依赖性缺陷。

SMN在本体感受和中枢胆碱能神经元二者中需要

除了大多数兴奋性中枢神经元以外，所有果蝇属幼虫感觉神经元是胆碱能的(Salvaterra和Kitamoto,2001)。为了仔细分析这两个群体对正常SMN水平的需求，测定仅在感觉神经元中的转基因SMN表达从而解救smn突变表型的能力。果蝇属感觉神经元分为三大类-多树突神经元(md)，其存在5亚类(bd、I、II、III和IV)，外部感官神经元(es)和弦音神经元(chordotonal neurons,ch)。将一组感觉神经元Gal4驱动子(图4A)用于仅在主要类型的感觉神经元中恢复SMN。当SMN在所有md神经元和es感觉神经元中表达而不在ch神经元或中枢神经元中表达时，smn突变体的节律性运动输出和诱发的NMJ eEPSP幅度均恢复至对照水平，且肌肉表面积增加至对照的83.5％(P<0.05)(图4D,F,G)。然而，利用该驱动子的转基因SMN的表达并未显著改变smn突变体的移动(图4E)。相反，SMN在ch神经元中的表达并未解救任何smn突变表型(图4D-G)。使用在md或es感觉神经元的较小亚群中表达的另外的Gal4驱动子(图4A)，发现其足以恢复仅在bd和I型md神经元中的SMN，从而解救smn突变体的节律性运动输出和NMJ神经传递的缺陷并增加了smn突变体的肌肉生长(图4D,F,G)。SMN在具有Cha-Gal4的CNS和周围胆碱能神经元二者中的表达完全解救包括移动和肌肉大小在内的所有表型(图4D-G)。这表明，除了bd和I型md感觉神经元以外，SMN必须在至少一种存在于CNS内的其它另外的胆碱能神经元群体中恢复来彻底校正smn突变体的移动并完全恢复肌肉大小。bd和I型md感觉神经元近来已证实是对果蝇属幼虫的运动回路的本体感受反馈所需要的(Cheng等,2010；Hughes和Thomas,2007)。为了测定是否这些神经元形态上被SMN消耗所破坏，检测了在smn突变体中标记的bd和I型神经元的感觉或轴突过程，然而没有在感觉过程中发现明显的缺陷(数据未示出)，并且与对照类似，这些神经元的轴突凸出到CNS中(图4B,C)。数据因而显示本体感受神经元中减少的SMN可能破坏它们的功能而不是它们的发育或连通性(connectivity)。

在胚胎形成后能够解救Smn突变表型

在孵化之前的胚胎发育24小时期间果蝇属幼虫神经元发育、连通并变得功能性(Baines,2006)。为了测定是否SMN消耗能够破坏该时期的神经系统组装，将'基因开关'RU486-药物诱导性Gal4系统用于控制转基因SMN的暂时回复。为了探询继胚胎形成完成之后转基因SMN的表达是否能够解救smn突变体表型，将携带有神经元特异的elav-基因开关驱动子的smn突变体幼虫和对照在孵化后即刻暴露至含有培养基的RU486，并贯穿随后的整个幼虫时期。(图5A)。当转基因SMN表达不被诱导时，与仅smn突变体相比没有差异(图5C-F)。相反，当SMN表达在胚胎发生后即刻诱导时，第三幼虫龄期的肌肉大小、移动、节律性运动输出和运动神经元eEPSP幅度不能与对照动物相区别(图5B-F)。该结果显示出，在胚胎形成后恢复SMN表达能够解救smn突变体，其显示它们不具有运动回路组装的持久缺陷。

smn突变体神经系统中的SMN表达推迟到幼虫期后期进行。当转基因SMN在胚胎孵化后的48或96小时的smn突变体中诱导时，与对照相比，发现肌肉体积、运动节律性缺陷和移动仅部分恢复的中间表型(图5C-D)。相反，NMJ eEPSP幅度在smn突变体中仅通过48小时的SMN表达便彻底恢复至对照水平(图5B,F)。这些结果揭示对SMN恢复的时机的差异表型敏感度，其中NMJ神经递质甚至在末期也可完全通过升高SMN水平来校正，而移动、运动节律性和肌肉生长需要较早且较长的暴露于增加的SMN水平的持续时间。

抑制胆碱能神经元活动模拟SMN消耗的方面。

在果蝇属胚胎发育时期，彻底除去向运动神经元的胆碱能输入导致运动神经元超兴奋性和增加神经传递(Baines等,2001)。假设smn突变体中运动神经元性质的非自主变化可能通过从运动回路中胆碱能神经元的缺陷型兴奋性输入来解释。所有胆碱能神经元的活动的彻底缺失或抑制导致胚胎致死(Kitamoto等,2000)。为了试验该假设，采用设计为部分抑制胆碱能神经元中的神经传递的转基因工具。使用表达抑制膜去极化的适度水平的人向内整流通道(human inward rectifying channel)Kir2.1(Paradis等,2001)或者表达抑制突触N-型电位门控钙离子通道的膜锚定Plectreurys Toxin II(PLTXII)(B.C.,Michael Nitabach和B.D.M，未公开出版)的细胞系。为了测定该方法的效力，这些转基因首先仅在使用OK6-Gal4的运动神经元中表达。发现Kir2.1将eEPSP幅度减少32％(P<0.001)而PLTXII的表达将eEPSP幅度减少96％(P<0.001)，表明两种转基因能够部分地抑制神经传递。

为了检测对抑制胆碱能神经元功能的运动系统的作用，使Kir2.1或PLTXII在使用Cha-Gal4的野生型动物的胆碱能神经元中表达。然而，胆碱能神经元中的转基因的表达对肌肉表面积没有作用(图6C)，但这些基因的表达分别将移动显著地抑制41％(P<0.001)和42％(P<0.001)(图6D)。它们还破坏了自发节律性运动活动，诱导平均峰电位间隔54％(P<0.05)或59％(P<0.05)的增加(图6B,E)。重要的是，胆碱能神经元功能的抑制还导致谷氨酸能运动神经元的NMJ处增加的eEPSP幅度(图6A,F)。Kir2.1在胆碱能神经元中的表达产生NMJ eEPSP幅度的50％的增加(P<0.001)，而PLTX的表达诱导45％的增加(P<0.001)(图6F)。因此，胆碱能神经元活动的抑制重复smn突变体的多个特征，包括对运动神经元的神经递质释放性质的非细胞自主作用，与smn突变体中功能已减少的运动回路中的胆碱能神经元一致。

实施例4.增加神经元兴奋性解救smn突变表型。

建立在smn突变体中运动回路具有功能缺陷的假设的基础上，进行实验以确定是否增加这些动物中胆碱能神经元的兴奋性能够增加运动网络活动并改变smn突变表型。通过显性失活(SDN)转基因抑制Shaker(Sh)IA型向外K+流增强使膜兴奋性增强并增加突出末端的EPSP的幅度和持续时间(Mosca等,2005)。由于抑制K+通道活动的遗传方法有益于smn突变表型，进行实验以检验是否K+通道的药理学拮抗剂也能够有效。试验了4-氨基吡啶(4-AP)，FDA批准的电压激活的脊椎动物(Hayes,2007)和果蝇属K+通道(Wicher等,2001)的小分子抑制剂。将4-AP加入幼虫培养基并滴定化合物以鉴别野生型幼虫在不致死下能够耐受药物的最大剂量(2mM)。检测对照和smn突变体二者的整个幼虫时期暴露4-AP的影响。在对照动物中，4-AP对肌肉大小不具有影响，但幼虫的移动减少35％(P<0.01)，节律性运动活动降低40％(P<0.01)，且NMJ eEPSP幅度减少21％(P<0.001)，表明在该剂量下温和的全身毒性(图7D-G)。尽管如此，smn突变体在整个幼虫时期在包含4-AP的培养基上生长，肌肉表面积与未处理的smn突变体相比增加66％(P<0.001)(图7D)。移动还增加55％(P<0.05)且没有显著地不同于用4-AP处理的对照(图7E)。smn突变体中节律性运动活动的缺陷基本上改善，峰电位间隔的异常增加在用4-AP处理的对照之上仅减少31％(p<0.001)(图7F)。最后，用4-AP处理的smn突变体的增加的NMJ EPSP幅度减少27％(P<0.001)，没有显著地不同于4-AP处理对照(图7G)。因此，与遗传抑制类似，K+通道的药理学抑制能够积极地有益于smn突变表型，与为SMN消耗的关键后果的运动回路缺陷型兴奋性一致。

本发明已参考具体实施方案进行了说明。然而，将显而易见的是，可对本发明作出各种修饰和更改而不偏离其较广泛的精神和范围。因此，说明书和附图视为说明性而非限制性含义。本发明在此通过上述实验并通过下列实施例来说明，不应解释为限制性的。本申请全文引用的所有文献、未决专利申请和公布专利再次清楚地引入以作参考。尽管采用了特定的术语，但除非另有说明，否则它们是用于本领域的。

表1.肌肉面积、移动、运动节律性和NMJ ePSP幅度

所有基因型的肌肉面积、移动、运动节律性和NMJ eEPSP幅度测量。

+/-平均值的标准差。相对于对照计算的显著性值。

*＝p＜0.05 **＝p＜0.01，***＝p＜0.00

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Claims

1.一种方法，其包括

鉴定患有脊髓性肌萎缩的受试者，和

向所述受试者给药治疗有效量的K+通道拮抗剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述K+通道拮抗剂为广谱类K+通道拮抗剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述K+通道拮抗剂为4-氨基吡啶。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述K+通道拮抗剂选自由4-(二甲基氨基)吡啶、4-(甲基氨基)吡啶和4-(氨基甲基)吡啶组成的组。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为每次给药约0.5mg至100mg范围内的量和所述拮抗剂每天给药一至三次。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为每次给药约10mg。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述K+通道拮抗剂配制为口服。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗有效量为每次给药约0.5mg至10mg之间的量。

9.一种药物制剂，其包括4-AP和选自由4-(二甲基氨基)吡啶、4-(甲基氨基)吡啶和4-(氨基甲基)吡啶组成的组的一种以上的试剂。

10.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述4-AP和所述一种以上的试剂配制于用于穿过血脑屏障递送的脂质体中。

11.一种药物制剂，其包括配制于用于穿过血脑屏障递送的脂质体中的4-AP。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述SMA为1型SMA。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述SMA为2型SMA。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述SMA为3型SMA。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述K+通道拮抗剂直接给药至硬膜外静脉丛、脑、脊柱或脑脊液中。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述K+通道拮抗剂选自由多非利特、索他洛尔、依布利特、阿奇利特、溴苄胺、氯非铵、E-4031、尼非卡兰、替地沙米和司美利特组成的组。