CN104327132A - 一种提取高含量黑芥子苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取高含量黑芥子苷的方法，包括以下步骤：1)以十字花科芸苔属植物芥菜、甘蓝或西兰花为原料，用乙醇提取，获得提取液，提取液回收乙醇后离心，收集上清液；2)上清液用混合溶剂进行萃取，收集有机相，然后减压回收溶剂，得到浓缩液；所述的混合溶剂为选自乙酸乙酯、乙醚和石油醚中的一种与甲醇或丙酮以的5～6：1的体积比的组合；3)浓缩液上阴离子交换树脂柱层析，先水洗树脂柱至流出液澄清，然后用碱液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，得到纯度≥70％的黑芥子苷提取物。本发明采用特殊配比的混合溶剂对上清液进行萃取、结合特定的700A或700B阴离子交换树脂层析工艺，可以获得纯度≥70％的黑芥子苷提取物。

Description

一种提取高含量黑芥子苷的方法

技术领域

本发明涉及植物中活性成分的制备方法，具体涉及一种提取高含量黑芥子苷的方法。

背景技术

已有的研究表明，富含十字花科蔬菜的饮食，如西兰花、花椰菜、甘蓝、芥菜等能减小许多癌症的发病率。目前一致认为，十字花科植物的重要抗癌活性成分前体是硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)。在天然植物中已发现120多种不同的硫代葡萄糖苷，它们存在于11个不同种属的双子叶被子植物中，最重要的是十字花科，所有的十字花科植物都能够合成硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷存在于这些植物的根、茎、叶和种子中，但主要存在于种子中。

黑芥子苷也称黑芥子甙(Sinigrin)是其中脂肪族硫代葡萄糖苷中研究得较多的一种，黑芥子苷的R基团是烯丙基，因此黑芥子苷也叫烯丙基硫代葡萄糖苷。本申请人之前申请的公开号为CN102048791A的发明专利公开了一种黑芥子甙提取物的制备方法，它包括以下步骤：1)以十字花科芸苔属植物芥菜、甘蓝或西兰花为原料用乙酸提取，提取液离心，得上清液；2)向上清液中加入乙醇，调节其中乙醇浓度为80～85％，放置1～1.5小时，离心，收集二次离心液；3)二次离心液浓缩至无醇味，所得浓缩离心液过0.5μm的陶瓷膜，透过液浓缩至原料重量的2～3倍，得浓缩透过液；4)浓缩透过液进大孔树脂柱，收集流出液，用2～3倍树脂重量的水洗脱，收集洗脱液，合并流出液和洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得黑芥子甙提取物。由该方法制得的产品中黑芥子甙含量为20～40％，黑芥子甙的含量较低，而且低含量的产品放置时间较长容易自身发生变化使含量降低，而高含量的产品相对来说比较稳定，放置较长时间时含量基本没有变化。现有技术中，由于黑芥子苷本身的性质以及在提取纯化过程中黑芥子苷容易被破坏(黑芥子苷是硫苷，在酸碱中不稳定，很容易分解或破坏，同时在有其他金属离子(如铁，锌，铜等)存在情况，也容易破坏，温度对其的分解也有很大程度的影响)导致很难分离纯化得到高含量的黑芥子苷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中的不足，提供一种提取高含量黑芥子苷的方法。采用该方法可以获得黑芥子苷含量≥70％的黑芥子苷提取物。

本发明所述的提取高含量黑芥子苷的方法，包括以下步骤：

1)以十字花科芸苔属植物芥菜、甘蓝或西兰花为原料，用乙醇提取，获得提取液，提取液回收乙醇后离心，收集上清液；

2)上清液用混合溶剂进行萃取，收集有机相，然后减压回收溶剂，得到浓缩液；所述的混合溶剂为选自乙酸乙酯、乙醚和石油醚中的一种与甲醇或丙酮的组合，其中乙酸乙酯、乙醚或石油醚中与甲醇或丙酮的体积比为5～6：1；

3)取浓缩液上阴离子交换树脂柱层析，先水洗树脂柱至流出液澄清，然后用碱液洗脱，收集碱液洗脱液，浓缩，干燥，得到黑芥子苷含量≥70％的黑芥子苷提取物；其中，所述的阴离子交换树脂的型号为700A或700B，所述的碱液为0.5～3w/w％的氢氧化钠水溶液或0.5～3w/w％的氢氧化钙水溶液。

为了进一步提高所得产品的纯度，本发明方法还可包括一纯化步骤，所述的纯化步骤是取黑芥子苷提取物与选自甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合混合均匀，调节体系的pH＝4～5，于低温条件下进行放置结晶，分离晶体，干燥，得到黑芥子苷含量≥95％的黑芥子苷产品。

上述纯化步骤中，优选是将体系置于0～4℃条件下进行放置结晶。该纯化步骤中，用于与黑芥子苷提取物混合的溶剂的用量通常为黑芥子苷重量的3～6倍。通常用盐酸、硫酸或冰醋酸来调节体系的pH值。

上述技术方案的步骤1)中，提取用乙醇的浓度为50～80v/v％，优选为50～60v/v％；提取的方式与现有常用的提取方法相同，优选采用回流提取，提取的次数通常为1～3次，每次提取时的料液比通常为1g：5～10g(当原料为干燥原料时)，每次提取的时间通常为1～3h；优选选用芥菜种子、甘蓝种子或西兰花花蕾或嫩芽。

上述技术方案的步骤2)中，每次萃取时，萃取用的混合溶剂的用量与现有常规萃取方式时相同，优选的，混合溶剂与上清液体积比为6～8：1。

上述技术方案的步骤3)中，碱液洗脱时，采用薄层层析跟踪检测。申请人在实验中发现，可以按下述标准进行洗脱液的收集：当流出液有苦味时收集，流出液无苦味时停止收集。该步骤中，洗脱用的碱液的浓度优选为1～2w/w％。

与现有技术相比，本发明采用上述特殊配比的的混合溶剂对回收乙醇并离心处理的上清液进行萃取，可以有效去除上清液中残余的杂质(如多糖、蛋白质、其它容易与有效成分发生变化的组分)，再结合特定的700A或700B阴离子交换树脂对除杂后的浓缩液层析，可以获得黑芥子苷含量≥70％(HPLC法)的黑芥子苷提取物；进一步地，在纯化操作后可以获得纯度≥95％(HPLC法)的黑芥子苷产品，填补了目前市场上尚未有工业化生产得到如此高纯度产品的空白；而且整个方法操作简单易控，生产成本低。

附图说明

图1为本发明实施例1制得产品的高效液相图谱；

图2为本发明实施例5制得产品的高效液相图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

1)取干燥的芥菜种子100kg(黑芥子苷含量为3.3％，HPLC法，下同)，粉碎，用相当于原料重量8倍、50v/v％的乙醇回流提取2h，过滤，残渣再用相当于原料重量10倍、50v/v％的乙醇回流提取1.5h，过滤，合并提取液，所得提取液减压回收乙醇后离心，收集上清液；

2)上清液用混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)萃取2次，合并收集有机相(上层溶液)，然后减压回收溶剂，得到浓缩液(6波美)；

3)取浓缩液上700B型阴离子交换树脂柱层析，先水洗树脂柱至流出液澄清且无色，然后用1.5w/w％的氢氧化钠水溶液洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的碱液洗脱液，减压浓缩，干燥，得到黑芥子苷提取物4.00kg。

取本实施例所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为74.50％(HPLC法，下同，图谱如图1所示)，原料黑芥子苷回收率为90.30％。

对比例1

重复实施例1，不同的是，在步骤3)中，用717#阴离子交换树脂代替700B型阴离子交换树脂。

由本对比例制得黑芥子苷提取物4.10kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为41.50％，原料黑芥子苷回收率为51.56％。

对比例2

重复实施例1，不同的是，在步骤3)中，用731型阴离子交换树脂代替700B型阴离子交换树脂。

由本对比例制得黑芥子苷提取物3.95kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为40.5％，原料黑芥子苷回收率为48.48％。

对比例3

重复实施例1，不同的是，在步骤3)中，用D941型阴离子交换树脂代替700B型阴离子交换树脂。

由本对比例制得黑芥子苷提取物3.98kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为39.5％，原料黑芥子苷回收率为47.64％。

对比例4

重复实施例1，不同的是，在步骤2)中，用单独的乙酸乙酯替代原来的混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)。

由本对比例制得黑芥子苷提取物4.20kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为58.55％，原料黑芥子苷回收率为74.52％。

对比例5

重复实施例1，不同的是，在步骤2)中，用单独的丙酮替代原来的混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)。

由本对比例制得黑芥子苷提取物4.15kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为55.85％，原料黑芥子苷回收率为70.24％。

对比例6

重复实施例1，不同的是，在步骤2)中，用单独的乙醚替代原来的混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)。

由本对比例制得黑芥子苷提取物4.35kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为56.60％，原料黑芥子苷回收率为74.61％。

实施例2

重复实施例1，不同的是，在步骤2)中，用体积比为1：3的石油醚与丙酮的组合替代原来的混合溶剂(乙酸乙酯的甲醇的体积比为5:1)。

由本实施例制得黑芥子苷提取物4.10kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为72.50％，原料黑芥子苷回收率为90.08％。

实施例3

重复实施例1，不同的是，在步骤3)中，用700A型阴离子交换树脂代替700B型阴离子交换树脂。

由本实施例制得黑芥子苷提取物4.05kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为73.80％，原料黑芥子苷回收率为90.57％。

实施例4

重复实施例1，不同的是，在步骤3)中，用3w/w％的氢氧化钙水溶液代替1.5w/w％的氢氧化钠水溶液。

由本实施例制得黑芥子苷提取物3.94kg，对所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为74.20％，原料黑芥子苷回收率为88.59％。

实施例5

1)取干燥的芥菜种子150kg(黑芥子苷含量为3.5％)，粉碎，用相当于原料重量8倍、55v/v％的乙醇回流提取2h，过滤，残渣再用相当于原料重量7倍、50v/v％的乙醇回流提取1h，过滤，残渣继续用相当于原料重量5倍、80v/v％的乙醇回流提取1h，过滤，合并提取液，所得提取液减压回收乙醇后离心，收集上清液；

2)上清液用混合溶剂(乙酸乙酯的丙酮的体积比为5:1)萃取2次，合并收集有机相(上层溶液)，然后减压回收溶剂，得到浓缩液(8波美)；

3)取浓缩液上700A型阴离子交换树脂柱层析，先水洗树脂柱至流出液澄清且无色，然后用1.5w/w％的氢氧化钙水溶液洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的碱液洗脱液，减压浓缩至浸膏(20波美)；

4)取浸膏与相当于其4倍重量的丙酮混合均匀(也可以干燥后再与相当于干燥物4倍重量的丙酮混合均匀)，用盐酸调节体系的pH＝4.5，于4℃条件下放置12h结晶，分离晶体，干燥，得到黑芥子苷产品4.3kg。

取本实施例所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为96.3％(图谱如图2所示)，原料黑芥子苷回收率为78.8％。

实施例6

1)取干燥的芥菜种子200kg(黑芥子苷含量为3.1％)，粉碎，用相当于原料重量10倍、60v/v％的乙醇回流提取3h，过滤，所得提取液减压回收乙醇后离心，收集上清液；

2)上清液用混合溶剂(石油醚与丙酮的体积比为5:1)萃取2次，合并收集有机相(上层溶液)，然后减压回收溶剂，得到浓缩液(6波美)；

3)取浓缩液上700B型阴离子交换树脂柱层析，先水洗树脂柱至流出液澄清且无色，然后用0.5w/w％的氢氧化钠水溶液洗脱，薄层层析跟踪检测，收集含目标成分的碱液洗脱液，减压浓缩至浸膏(20波美)；

4)取浸膏与相当于其4倍重量的乙酸乙酯混合均匀(也可以干燥后再与相当于干燥物4倍重量的乙酸乙酯混合均匀)，用冰醋酸调节体系的pH＝4，于4℃条件下放置12h结晶，分离晶体，干燥，得到黑芥子苷产品4.97kg。

取本实施例所得的黑芥子苷提取物进行检测，纯度为95.9％，原料黑芥子苷回收率为76.9％。

Claims (5)

1.一种提取高含量黑芥子苷的方法，包括以下步骤：

1)以十字花科芸苔属植物芥菜、甘蓝或西兰花为原料，用乙醇提取，获得提取液，提取液回收乙醇后离心，收集上清液；

2)上清液用混合溶剂进行萃取，收集有机相，然后减压回收溶剂，得到浓缩液；所述的混合溶剂为选自乙酸乙酯、乙醚和石油醚中的一种与甲醇或丙酮的组合，其中乙酸乙酯、乙醚或石油醚中与甲醇或丙酮的体积比为5～6：1；

3)取浓缩液上阴离子交换树脂柱层析，先水洗树脂柱至流出液澄清，然后用碱液洗脱，收集碱液洗脱液，浓缩，干燥，得到黑芥子苷含量≥70％的黑芥子苷提取物；其中，所述的阴离子交换树脂的型号为700A或700B，所述的碱液为0.5～3w/w％的氢氧化钠水溶液或0.5～3w/w％的氢氧化钙水溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法还包括纯化步骤，所述的纯化步骤是取黑芥子苷提取物与选自甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯中的一种或两种以上的组合混合均匀，调节体系的pH＝4～5，于低温条件下进行放置结晶，分离晶体，干燥，得到黑芥子苷含量≥95％的黑芥子苷产品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将体系置于0～4℃条件下进行放置结晶。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：提取用乙醇的浓度为50～80v/v％。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：洗脱用的碱液的浓度为1～2w/w％。