CN104324030B - Ml3403作为细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ML3403作为细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用。申请人进行的实验发现，ML3403能够有效破坏细粒棘球蚴原头节的细胞结构，降低其生存活力，从而抑制细粒棘球蚴原头节的生长。在此基础上，本发明还公开了ML3403作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，由于ML3403能够有效抑制细粒棘球蚴原头节的生长，其用于治疗细粒棘球蚴病能高效杀灭原头节且对正常机体损害小。

Description

ML3403作为细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及到{4-[5-(4-氟苯基)-2-甲硫基-3H-咪唑-4-基]-吡啶-2-基}-(1-苯基乙基)-胺，即ML3403的应用，尤其涉及到其抑制细粒棘球蚴原头节以及治疗与细粒棘球蚴原头节引发的细粒棘球蚴病，属于药物化学领域。

背景技术

棘球蚴病(echinococcosis)俗称包虫病(hydatid disease)，是棘球蚴绦虫的中绦期幼虫寄生于人及其他一些动物体内所引起的一种严重危害人民健康和畜牧业发展的人畜共患寄生虫病，主要有细粒棘球蚴病(囊型包虫病cysticechinococcosis，CE)和多房棘球蚴病(泡型包虫病alveolar echinococcosis，AE)两种，其分别由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，E.g)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，E.m)寄生于人体及某些动物体内所致。目前，对于肝囊性包虫病的治疗，通常采用手术治疗，即闭合式肝包虫外膜内外囊完整摘除术，尽管手术的治疗方法具有并发症少、创伤小、根治性等优点,但是当包虫囊肿体积较大或临近重要脏器或管道时，采用手术方式可能导致头节的外漏和残留，增加术后复发的风险。

因此近年来在动物实验和临床上尝试使用了多种药物用于包虫病的治疗，例如吡喹酮、阿苯达唑、甲苯达唑等，临床常用的治疗包虫的药物主要有：经典西药，如苯并咪唑类抗包虫代表药物阿苯达唑和甲苯咪唑；药物新剂型，主要是抗棘球蚴脂质体药物；新发展的药物，如苯并咪唑类衍生物奥吩达唑；两种以上药物联合，如阿苯达唑和吡喹酮联合用药等。临床实践证实，这些药物不论是用于包虫病病人的全身化疗还是用于局部辅助用药，治疗效果都不尽理想，并且长期用药还可能使病人产生严重的副作用。

发明内容

在申请人的长期研究中，发现通过影响细粒棘球蚴原头节的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号转导通路，能够抑制其细胞之间信息交流，从而抑制其生长与发育。申请人广泛研究了各种能够作用于MAPK信号通路的特异性阻断方式，惊喜地发现化合物ML3403作为p38信号转导通路激酶的特异性抑制剂通过特异的直接占据p38ATP结合位点而阻止p38信号转导通路激酶活化，从而抑制p38的过度激活，阻止p38信号通路，从而抑制原头节细胞的生长，进而杀灭原头节。

基于上述发现，申请人完成了本发明。

在本发明中，ML3403，可从多家试剂公司购买，例如TOCRIS、西玛科技等，其分子式为C₂₃H₂₁FN₄S，其分子量为404.5，英文命名为{4-[5-(4-fluorophenyl)-2-methylsulfanyl-3H-imidazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-(1-phenylethyl)-amine，，对应的中文名称为{4-[5-(4-氟苯基)-2-甲硫基-3H-咪唑-4-基]-吡啶-2-基}-(1-苯基乙基)-胺，对应的CAS为549505-65-9，化学结构如下所示：

首先，本发明公开了ML3403作为细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用。

申请人的研究发现，ML3403能够抑制细粒棘球蚴原头节的细胞p38信号转导通路激酶的蛋白表达水平，影响原头节内caspase-3酶的活性，从有效抑制细粒棘球蚴原头节的生长发育，从而可以作为细粒棘球蚴原头节优良的抑制剂，由于其显著的抑制效果，在临床用药时能够抑制术中原头节外溢。

根据需要，可使用不同浓度的ML3403，一般来说，为了能够产生抑制作用，ML3403的浓度为不低于5μmol/L，具体地说其浓度在5-150μmol/L，作用时间不低于12小时。

针对常见的原头节生长密度，也就是临床上大约300-1000个/ml的情形，优选的，ML3403的浓度为50-100μmol/L，作用时间24-72小时。

在上述浓度和使用时间下，对细粒棘球蚴原头节具有比较理想的抑制和杀灭效果。

其次，由于具有上述作用，本发明还公开了ML3403作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，由于ML3403能够特异性的阻断细粒棘球蚴原头节的细胞p38信号转导通路激酶的蛋白表达，其用作药物活性成分可以直接治疗由细粒棘球蚴原头节导致的各种疾病，主要是囊性包虫病，尤其是囊性肝包虫病。

需要注意的是，上述的药物应用并非局限于人体，也可以是动物体上的。

为了能够产生抑制作用，ML3403的浓度为不低于5μmol/L，具体地说其浓度在5-150μmol/L，作用时间不低于12小时。

针对常见的原头节生长密度，也就是临床上大约300-1000个/ml的情形，优选的，ML3403的浓度为50-100μmol/L，作用时间24-72小时。

附图说明

图1A、1B为正常培养的细粒棘球蚴原头节，其中1B为1A的染色效果图；

图2A、2B为ML3403对细粒棘球蚴原头节光镜结构的影响，其中，2A为50μmol/LML3403作用3d，2B为50μmol/L ML3403作用5d；

图3为ML3403对细粒棘球蚴原头节活力的影响；

图4为ML3403对细粒棘球蚴原头节表面超微结构的影响，其中，A：50μmol/LML3403作用1d；B：50μmol/LML3403作用3d后；C：80μmol/LML3403作用1d；D：80μmol/LML3403作用3d；

图5为ML3403对细粒棘球蚴原头节内部超微结构的影响，其中，A：50μmol/LML3403作用1d；B：50μmol/LML3403作用3d后；C：80μmol/LML3403作用1d；D：80μmol/LML3403作用3d；

图6为ML3403对细粒棘球蚴原头节p38表达的影响。

具体实施方式

为了说明ML3403对细粒棘球蚴原头节的杀灭效果，申请人进行了下述实验。实验1：ML3403体外作用于细粒棘球蚴原头节的效果

取新鲜的自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，清洁羊肝表面，用75％酒精消毒表面，无菌条件下抽取含原头节的囊液，移入无菌瓶中。用PBS(PH＝7.2)清洗原头节3次至澄清，用0.1％伊红染液做染色排斥实验，98％以上拒染。肉眼观察原头节呈细白沙样均匀颗粒，活性好的原头节沉降速率快，活性不好的或者死亡的原头节沉降速率相对比较慢。

倒置显微镜下观察原头节虫体呈内陷型，散在密布，虫体结构饱满，呈椭圆形，结构清晰完整，钙颗粒清亮而明显。然后将原头节分装至含10％小牛血清的RPMI 1640培养基中(青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)，置37℃、5％CO2培养箱内培养。

实验分组：RPMI 1640空白对照组、12.5μmol/L ML3403组、25μmol/L ML3403组、50μmol/L ML3403组、80μmol/L ML3403、100μmol/L ML3403组、DMSO组。取六孔板，每孔设5mL体系，按以上分组，配好相应的培养液。

将在体外培养5天后的细粒棘球蚴原头节用PBS(pH＝7.2)清洗3遍，每组培养液中加入约2000个原头节，置37℃，5％CO₂孵育箱内培养，在倒置显微镜下观察ML3403对细粒棘球蚴原头节形态和活力的影响。

数据统计方法：加药后24h开始，每组每天均匀抽取200μL培养液(平均含原头节约90-120个)，用0.1％伊红染色15min，倒置显微镜下观察原头节的活力。活头节拒染、不着色，且有活动性；死亡或活力减弱的原头节红染着色，伴有结构破坏。计算每组每天平均死亡率。每隔4d换液一次(每组体系和浓度同第一次加药时)，连续观察，直至最大作用浓度的原头节全部死亡。实验重复三次。

实验2：ML3403作用后原头节表面结构的变化

选择光镜下观察形态和活力变化较显著的实验组的原头节，PBS洗涤3次，每次5min；置4％戊二醛固定24h。将原头节放入浓度为50％、70％、80％、90％、100％的酒精内逐级梯度脱水，脱水时间分别为5min、10min、30min、1h至过夜，临界点干燥，真空喷金LOOA，在LEO1430VP扫描电子显微镜下观察原头节表层超微结构变化。

实验3：ML3403作用后原头节内部结构的变化

根据光镜下观察原头节活力的变化，选择形态和活力变化较显著的实验组的原头节，PBS洗涤3次，每次5min；置4％戊二醛前固定24h。用小离心管离心，去除上清液，用琼脂糖包埋头节，取出凝胶继续放入4％戊二醛内固定24h。将固定好的原头节用PBS(PH7.4)冲洗3次，每次15min，2％OsO4中后固定1h，用PBS再冲洗两遍。酒精逐级梯度脱水，30％→50％→60％各10min，70％过夜，次日再置80％→90％各10min，100％30min。之后丙酮逐级脱水，环氧树脂(Epon812)包埋，固定后修型，LKB2088V型超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅双重染色，置于日立H-600型透射电子显微镜观察原头节内部超微结构的变化。

实验4：Western blot检测ML3403作用后原头节内p38蛋白表达水平

根据生物化学教材上的标准的蛋白表达的Western Blot检测实验操作流程检测p-p38蛋白表达水平。

实验5：ML3403对细粒棘球蚴原头节内caspase-3酶活性的影响

利用市售的Caspase-3活性荧光检测试剂盒基于分光光度法检测细粒棘球蚴原头节细胞中的Caspase-3酶活性。

实验结果如下所示：

实验1的结果：

在倒置显微镜下观察，正常原头节虫体呈内陷型，散在密布，虫体结构饱满，呈椭圆形，结构清晰完整，钙颗粒清亮而明显(图1)。

ML3403作用细粒棘球蚴原头节3d，50μMML3403组少量原头节被伊红着色，50μMML3403作用细粒棘球蚴原头节5d，原头节可见虫体结构破坏；随着ML3403作用浓度的增加，作用时间的延长，ML3403对细粒棘球蚴原头节的杀伤作用越明显，伊红染色可观察到虫体团缩、体积变小，原头节被伊红染色数量增加，原头节边缘不规整(图2)。

经倒置显微镜下观察，从活力曲线图中可以看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，ML3403对原头节活力的抑制率增加(图3)。

实验2的结果：

扫描电镜观察发现，50μmol/LML3403作用1d后，原头节虫体皮层出现疱样改变；作用3d后，原头节体表破坏加重，顶突界面缺损，吸盘变型，头钩排列紊乱现部分缺损。80μmol/LML3403作用1d后，原头节虫体尾端皮层出现皱缩，体表现指状突起；作用3d后，原头节皮层微毛断裂脱落，呈虫蚀样损害，顶突结构严重破坏，头钩严重缺损，吸盘变型(图4)。

实验3的结果：

透射电镜观察发现，50μmol/LML3403作用于原头节1d后，TEM观察发现合胞体带囊泡扩张，出现微小空泡，实质细胞内异染色质增多；作用于原头节3d后，实质细胞间出现空泡变化。80μmol/L ML3403作用于原头节1d后，实质细胞细胞质浓缩，细胞核核周隙增宽，核染色质边集，部分细胞核仁消失；作用于原头节3d后，微毛紊乱，大部分实质细胞胞质浓缩，细胞核核周隙增宽，核仁消失，染色质凝集呈边缘化，实质细胞间结构松散，出现空泡变化，可见板层残余小体(图5)。

实验4的结果：

用Western blot检测原头节内p38蛋白表达水平，发现ML3403作用于细粒棘球蚴原头节24h后，100μmol/LML3403组较其它浓度组p38蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，25μmol/L组、50μmol/L组、80μmol/L组较Control组有统计学差异(P<0.05)(图6)；p38信号转导通路抑制剂ML3403体外可以抑制细粒棘球蚴原头节内的p38蛋白水平表达。

实验5的结果：

根据测得的A405值和标准曲线，计算出样品中生成的对硝基苯胺(ρNA)浓度(表1)。

采用单因素方差分析对caspase-3活性检测数据进行统计分析，组间两两比较采用SNK法。从结果推测原头节内caspase-3的活性表达，ML3403作用24h时，80μmol/LML3403组的表达最强；ML3403作用48h时,50μmol/LML3403组caspase-3的活性表达最强。

表1.不同浓度ML3403作用于原头节不同时间caspase-3活性(n＝3)

(注：#P<0.05，与Control组相比；^▽P<0.05，与Control组相比；P<0.05，与Control组相比；P<0.05，与Control组相比)

综合上述实验结果我们可以看到，本领域早年发现的BAY43-9006和PD184352作用于多房棘球蚴囊泡有效的阻断Erk样MAPKK信号转导通路的级联反应，但这两种抑制剂仅仅只能使多房棘球蚴囊泡处于静止期。而本发明的ML3403则不同，应用ML3403作用于细粒棘球蚴原头节可以看到不同浓度的ML3403均对体外培养的细粒棘球蚴原头节有抑制和杀伤作用，此作用具有剂量依赖性和时间依赖性，即随着药物浓度的增加和用药时间的延长，原头节的抑制率增加，倒置显微镜下可见原头节的钙颗粒减少，头节活动度下降，伊红染色可观察到被染色的原头节数量逐渐增多，说明不同浓度的ML3403均对体外培养细粒棘球蚴原头节有抑制和杀伤作用。

不同浓度的ML3403作用细粒棘球蚴原头节后，在扫描电镜和透射电镜下观察发现，原头节的微毛出现不同程度的缺损，并且生发层内的细胞被空泡所替代。这些都不利于形成育囊，从而抑制原头节的生长。在人或绵羊的包虫囊内，原头节主要依赖机体前端的顶突、头钩和吸盘等附着在宿主细胞组织并吸收营养，有利于虫体的发育，应用ML3403后能破坏原头节的顶突，使其头钩出现不同程度的缺损，吸盘变形，从而杀死原头节。

从实验结果可以看到，ML3403作用于细粒棘球蚴原头节，原头节内p38的表达浓度降低，并且p38蛋白被抑制也呈现量效关系和时效关系。空白对照组的原头节p38的含量过表达，应用ML3403，随着ML3403浓度的增加和用药时间的延长，ML3403抑制原头节内p38的蛋白表达水平越明显。因此ML3403通过特异的直接占据p38的ATP结合位点而阻止p38活化，从而抑制p38的过度激活，因此具有阻止p38信号通路的作用，从而抑制原头节细胞的生长，进而杀灭原头节。

从实验结果可以看到，ML3403作用于细粒棘球蚴原头节，在作用24h后80μmol/L ML3403组capase-3活力表达最强，而作用48h后，50μmol/L ML3403组capase-3活力表达最强。在ML3403作用24h时，100μmol/LML3403组capase-3活力表达反倒低于50μmol/LML3403组和80μmol/LML3403组，是由于100μmol/LML3403组药物浓度高，原头节细胞凋亡快，自身和培养基中的ATP不足以维持细胞凋亡，则刺激因子由引起细胞凋亡转为细胞坏死，而在死亡细胞中caspase-3是呈阴性表达的，因此在作用24h时，100μmol/LML3403组capase-3活性表达反倒低。

Claims (2)

1.ML3403作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，其中，ML3403的浓度为5-150μmol/L，作用时间不低于12小时。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于ML3403的浓度为50-100μmol/L，作用时间24-72小时。