CN104312931A - 一种德氏有孢圆酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种德氏有孢圆酵母及其应用，其保藏编号为CGMCC No.8740、CGMCC No.8742。本发明采用紫外线诱变方法对酵母菌进行诱变，然后筛选在酸性条件下具有高活性植酸酶的突变菌株，使突变菌株产生的突变植酸酶在胃环境的pH条件下能够较好的水解植酸。该突变菌株可用于生产饲用或食用植酸酶，还可以用于生产微生物磷肥或生物有机磷肥。另外，突变后的植酸酶基因序列可以被克隆到原核或真核生物基因表达载体上，通过基因工程技术构建基因工程菌株或转基因植物，以高效表达突变植酸酶基因从而生产突变植酸酶。

Description

一种德氏有孢圆酵母及其应用
技术领域
本发明涉及酵母突变菌株及其应用，具体涉及一种产高催化活性植酸酶的德氏有孢圆酵母突变菌株及其应用。 
背景技术
植酸（Phytic acid)又称肌醇六磷酸，含有6个磷酸基团，是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物机体必须的矿物元素，而单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶（Phytase，催化植酸及植酸盐水解的酶），造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低。为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。 
研究表明，在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷和其他矿物元素的利用率，提高对淀粉、脂肪、蛋白质等营养物质的利用率，从而促进动物健康快速的增长，减少粪便中磷含量从而减轻环境的污染。一般情况下，在饲料中添加植酸酶可以使磷的利用率提高20-60％。在玉米-豆粕日粮中添加微生物植酸酶，磷的利用率提高60％。在以豆饼为基础的肉鸡饲料中添加植酸酶，大约有50％的植酸磷被释放。 
提高猪饲料中植酸酶的水解活性，主要是要提高猪用植酸酶在胃环境下的植酸水解能力，其中提高植酸酶在酸性环境下的稳定性和催化活性是重点。因此，优化酵母菌植酸酶，使其在整个酸性范围内具有高催化活性，具有很大的应用潜力和产业价值。随着生物科技的发展，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶基因的大规模表达成为可能。目前来源于Escherichia coli，Aspergillus niger，A.fumigatus等微生物的植酸酶已经在巴斯德毕赤酵母中得到高效表达，并成功地在饲料中应用。然而大多数植酸酶活性的最适pH为4.5到5，在pH2到3 时，酶活性比较低，只有最适pH条件下的30-40％，不利于植酸酶在胃环境中发挥水解植酸的作用。 
发明内容
本发明的目的在于，提供一种德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)，该突变菌株能够产生一种具有高催化活性的突变植酸酶，该突变菌株在pH2.5-5.5范围内均具有催化活性。解决了现有技术中植酸酶在酸性条件下活性较低的技术问题。 
为实现本发明的目的，本发明提供一种德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)，其保藏编号为：CGMCC No.8740。于2014年01月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101)。 
进一步地，本发明提供一种所述德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740在制备突变植酸酶PHY-M中的应用。 
所述制备的突变植酸酶PHY-M在pH2.5-5.5范围内具有催化活性。 
进一步地，本发明提供一种突变植酸酶PHY-M，所述突变植酸酶PHY-M的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述突变植酸酶PHY-M发生突变的位点为，第48位的Ala突变为Thr，第391位的Cys突变为Arg。 
本发明还提供一种编码突变植酸酶PHY-M的基因phy-m，所述基因phy-m的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 
进一步地，所述基因phy-m能够用于克隆到原核或真核生物基因表达载体上，通过基因工程技术构建基因工程菌株或转基因植物，以高效表达植酸酶基因phy-m生产突变植酸酶PHY-M。 
本发明还提供一种突变植酸酶PHY-M在饲料添加剂中的应用。所述饲料添加剂的有效成分为所述突变植酸酶PHY-M对应的核苷酸序列，或者表达所述突变植酸酶PHY-M的宿主细胞。 
本发明的有益效果在于：本发明提供的保藏的菌株CGMCC No.8740，菌株性能稳定；利用该菌株发酵得到高催化活性的突变植酸酶PHY-M，该突变植酸酶PHY-M在pH2.5-5.5范围内均具有很好的催化活性， 使其在胃环境条件下能够更好地发挥水解植酸的作用。 
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案。 
实验材料和试剂： 
1、菌株 
德氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii），保藏编号为：CGMCCNo.8742。 
2、酶类及其他生化试剂 
FastAp内切酶购自Thermo scientific公司，连接酶购自Invitrogen公司，植酸钠等底物购自Sigma公司，其他都为国产试剂。 
3、培养基 
大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0)。酵母培养基为YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）。 
本实验中所用到遗传学技术均为本领域中的常规技术。 
一、德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)CGMCC No.8740的初筛 
首先对德氏有孢圆酵母菌种进行紫外线诱变，所述德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)菌种的保藏编号为CGMCC No.8742，于2014年01月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。将德氏有孢圆酵母CGMCC No.8742涂布在植酸钙平板上，所述植酸钙平板对应的培养基配制方法为：植酸钙4g/L、葡萄糖30g/L、NH4NO3 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.03g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、pH5.5、琼脂20g/L、115℃灭菌30min；植酸钙单独灭菌，待培养基冷至50℃～60℃时加入，混匀后倒入培养皿中。将所述涂布德氏有孢圆酵母CGMCC No.8742的植酸钙平板置于15W紫外线灯下照射30-90s后盖上皿盖，倒置 于30℃恒温培养箱中避光培养2～3天，挑取平板中的水解透明圈直径较大的酵母单菌落点接于另一植酸钙平板中，培养3～4天，测水解透明圈直径(H)与菌落直径(C)，计算出水解透明圈直径和菌落直径比值(H/C)大小，将H/C值和对照组进行比较，筛选出H/C值较大的突变菌株。然后将筛选出的酵母突变菌株和对照菌株点接于植酸钙平板中，每一菌株点三个平行平板，培养几天后，再测量H/C值大小，筛选出H/C值较大的酵母突变菌株即为所述的德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740。将德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740和对照酵母菌株分别接种于含有50mL液体YPD培养基的250mL三角烧瓶中，30℃，160r/min振荡培养36h后，利用高速冷冻离心机离心(4℃，4000r/min，离心10min)取发酵上清液，并经适当稀释测量植酸酶活性。 
二、酸性环境下德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740的复筛 
将经过诱变处理所筛选出的H/C值较大的酵母突变菌株和对照酵母菌株分别接种于含有50mL液体YPD培养基的250mL三角烧瓶中，30℃，160r/min振荡培养36h后，利用高速冷冻离心机离心（4℃，4000r/min，离心10min）取发酵上清液，分别在pH2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5分析所述酵母突变菌株在整个酸性条件下的植酸酶活性。结果表明：在这些pH条件下，酵母突变菌株的发酵上清液中植酸酶活性相对于对照酵母菌株有较大的提高。 
三、德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740表达的突变植酸酶PHY-M的活性检测 
将所述德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740和未突变的德氏有孢圆酵母CGMCC No.8742分别在植酸钙酵母培养液中30℃、180r/min振荡培养36h。所述植酸钙酵母培养液的配置方法为：植酸钙4g/L、葡萄糖30g/L、NH4NO3 5g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·7H2O 0.03g/L、FeSO4·7H2O 0.03g/L、pH5.5、115℃灭菌30min；植酸钙单独灭菌，待培养基冷至50℃～60℃时加入。测定上述发酵上清液中的植酸酶活性，在pH2.5时植酸酶活性为28.99U/ml，pH5.5时植酸酶活性为14.80U/ml。而在相 同条件下未突变的德氏有孢圆酵母CGMCC No.8742在pH2.5时植酸酶活性为14.78U/ml，pH5.5时植酸酶活性为0.00U/ml。结果表明：德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740表达的突变植酸酶PHY-M在整个酸性环境中都具有很高的植酸水解活性，达到了在胃环境中pH条件下能较好水解植酸的要求。 
四、突变植酸酶PHY-M的序列检测 
将德氏有孢圆酵母CGMCC No.8740接种于含有50mL液体YPD培养基的250mL三角烧瓶中，30℃，160r/min振荡培养18h，利用高速冷冻离心机离心(4℃，8000r/min，离心10min)取沉淀菌体。采用酵母基因组DNA提取试剂盒(购于天根公司)提取德氏有孢圆酵母DNA，植酸酶基因序列扩增采用上游引物(5′–ATGCTTTGGGAAAAAATTGGTACTCAGG–3′)和下游引物(5′–TTATTTTTTGATCAAACTAGCGT–3′)，扩增程序：94℃变性5min，(94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min)×30，72℃延伸10min，4℃保温。PCR扩增产物送到上海英维捷基生物技术有限公司进行测序，通过BioXM 2.6软件将基因序列转化为氨基酸序列，该氨基酸序列即为突变植酸酶PHY-M对应的序列。所述突变植酸酶PHY-M的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。与未突变的植酸酶进行比对，发现所述突变植酸酶PHY-M发生突变的位点为，第48位的Ala突变为Thr，第391位的Cys突变为Arg。 
五、突变植酸酶PHY-M的编码基因phy-m的合成 
根据突变植酸酶PHY-M的氨基酸序列，设计突变植酸酶PHY-M的编码基因phy-m，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，设计PCR引物5’端含有Not I内切酶位点，3’端含EcoRI内切酶位点，引物序列如下： 
5’端引物TDphyFor：CCGGAATTCATGCTTTGGGAAAAAATTGGTACTCAGG 
3’端引物TDphyRev：TAGCGGCCGCTTATTTTTTGATCAAACTAGCGT 
以原始植酸酶基因phy为模板，用上述引物进行PCR扩增，即可合成突变植酸酶PHY-M的编码基因phy-m。取阳性克隆质粒DNA进行基因 测序。测序结果确定突变植酸酶基因序列第142位的碱基G突变为A，第1171位的碱基T突变为C；编码的氨基酸序列突变位点为第48位的Ala突变为Thr，第391位的Cys突变为Arg。 
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明方法范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。 

Claims (9)

1.一种德氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)，其保藏编号为：CGMCC No.8740。 
2.如权利要求1所述的德氏有孢圆酵母，其特征在于：所述德氏有孢圆酵母在制备突变植酸酶PHY-M中的应用。 
3.如权利要求2所述的德氏有孢圆酵母，其特征在于：所述制备的突变植酸酶PHY-M在pH2.5-5.5范围内具有催化活性。 
4.一种突变植酸酶PHY-M，其特征在于：所述突变植酸酶PHY-M的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 
5.如权利要求4所述的突变植酸酶PHY-M，其特征在于：所述突变植酸酶PHY-M发生突变的位点为，第48位的Ala突变为Thr，第391位的Cys突变为Arg。 
6.一种编码突变植酸酶PHY-M的基因phy-m，其特征在于：所述基因phy-m的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 
7.如权利要求6所述的编码突变植酸酶PHY-M的基因phy-m，其特征在于：所述基因phy-m能够用于克隆到原核或真核生物基因表达载体上，通过基因工程技术构建基因工程菌株或转基因植物，以高效表达植酸酶基因phy-m生产突变植酸酶PHY-M。 
8.一种突变植酸酶PHY-M在饲料添加剂中的应用。 
9.如权利要求8所述的一种突变植酸酶PHY-M在饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述饲料添加剂的有效成分为所述突变植酸酶PHY-M对应的核苷酸序列，或者表达所述突变植酸酶PHY-M的宿主细胞。 
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