CN104311649B - 一种能提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白e6及其编码基因与应用 - Google Patents
一种能提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白e6及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6及其编码基因与应用。该蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物光合效率的蛋白质。结果表明：E6蛋白在光合作用中有重要功能，为高光效工程藻株的改造提供了一个很好的靶标基因，也为作物改良提供良好的备选目标基因。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6及其编码基因与应用。
背景技术
光合作用是生物界赖以生存的基础。它直接或间接地为地球上的生物提供能量，与人类面临的粮食、能源问题等密切相关。随着世界人口的增加，粮食、能源和资源问题日益严峻，提高包括藻类等在内的光合生物的光能利用效率，已经成为一项日益紧迫的任务。
莱茵衣藻是单细胞真核绿藻，是研究光合作用、光合产氢和细胞逆境适应机制的模式物种。通过科学研究挖掘重要的可以提高光能利用效率的新基因，不仅可为高放氢工程藻株设计提供可利用的基因元件，也对发现衣藻高效率低成本制氢的新思路和新方法有重要价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有提高植物光合效率的莱茵衣藻蛋白E6及其编码基因。
本发明所提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物光合效率相关的蛋白质。
本发明所提供的所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组藻株、或含有B2)所述表达盒的重组藻株、或含有B3)所述重组载体的重组藻株。
上述相关生物材料中，B1)所述的核酸分子如序列表中序列1的第1-579位核苷酸分子所示。
上述蛋白质或相关生物材料在提高植物光合效率中的应用也是本发明的保护范围。
上述应用中，所述植物为藻类，具体为莱茵绿藻。
本发明的另一个目的是一种构建光合能力提高的转基因植物的方法。
本发明所提供的构建光合能力提高的转基因植物的方法包括如下步骤：将上述所述蛋白质的编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，光合能力提高。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因为序列表中序列1的第1-579位核苷酸的DNA分子。
上述方法中，所述光合能力提高为光合效率提高。
上述方法中，所述植物为藻类，具体为莱茵衣藻。
实验表明：E6基因与E6的光合表型是相关的，E6基因在光合作用中有重要功能，为高光效工程藻株的改造提供了一个很好的靶标基因，也为作物改良提供良好的备选目标基因。
附图说明
图1为e6突变体互补藻株筛选。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
植物材料：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400(mt+)，购自美国杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)。
菌株和质粒：pSI103质粒购自美国杜克大学莱茵衣藻中心(Chlamy centerhttp://www.chlamy.org/)；pJR38质粒由马普协会分子生理研究所Ralph Bock教授提供，在文献“Generation of Chlamydomonas strains that efficiently express nucleartransgenes,Neupert et al.,The Plant Journal,2009,57,1140-1150”中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。pSI103质粒和pJR38质粒中均含有巴龙霉素抗性基因。
培养基的配制：
1)正常TAP培养液：NH4Cl 0.4g/L；MgSO4·7H2O 0.1g/L；CaC12·2H2O 0.05g/L；K2HPO40.108g/L；KH2PO40.056g/L；Trisbase 2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’s traceelements)1ml/L；冰乙酸1ml/L；其余为水。
2)固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加1.5％的琼脂粉。
3)亨特微量元素(Hunter’s trace elements):H3BO411.4g/L；ZnSO4·7H2O22.0g/L；MnCl2·4H2O 5.06g/L；CoCl2·6H2O 1.61g/L；CuSO4·5H2O 1.57g/L；(NH4)6Mo7O24·4H2O1.10g/L；FeSO4·7H2O 4.99g/L；其余为水。
4)用TAP固体培养基培养莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400(mt+)、e6突变体及互补藻株：配制TAP液体培养液，121℃高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻单克隆到液体TAP培养液中，置 于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃，60rpm，100μEs-1m-2)，悬浮培养细胞，固体培养时，将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。
实施例1、E6基因的获得
1、莱茵衣藻总RNA的提取：
取指数生长期的莱茵衣藻CC400(mt+)细胞(4-6)x106细胞/毫升，5000rpm离心5min后，加入1mL裂解液RZ，振荡混匀。室温放置5min后，4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入新的无RNase的离心管中。加200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃，12000rpm离心10min。把上层水相转移到新的无RNase的离心管中，缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀全部转入吸附柱中。4℃，12000rpm离心30s，弃离心管中废液，加500μL去蛋白液，4℃，12000rpm离心30s，弃废液。加700μL漂洗液，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液。再加500μL漂洗液，室温静置2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液。4℃，12000rpm离心2min，去除残余液体，开盖晾干。将吸附柱转入一个新的无RNase的离心管中，加50μL RNase-free dd-H2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min。弃上清，获得莱茵衣藻总RNA。
2、cDNA第一链合成：
以上述获得的莱茵衣藻总RNA为模板，使用全式金有限公司cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA第一链。反应体系：2μL 10x TSII mix，1ul 10μmol OligodT20，1-5μg总RNA，补灭菌双蒸水至20μL。50℃温浴30min，70℃加热15min后终止反应。获得莱茵衣藻的cDNA第一链。
3、E6基因的扩增：
以上述获得的莱茵衣藻的cDNA第一链为模板，采用表1中的引物序列PCR扩增E6基因。反应程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。反应体系：2×HS GC buffer I 12.5μL，dNTP mixture(各2.5mM)2μL，模板cDNA1μL，PRIMERSTAR(5U/μL)0.5μL，F/R各1μL，补ddH2O至25μL。以上引物均在生工生物工程股份有限公司合成。引物序列见下表1。
表1.PCR扩增所用的引物序列
5、PCR产物的克隆及鉴定：
用Tiangen琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209-03)回收纯化目的条带，将目的片段与pEasy-blunt载体(购自北京全式金公司)连接，获得重组载体。将重组载体转化 大肠杆菌(Escherichia coli)Trans-T1感受态细胞(购自北京全式金公司)，用蓝白斑方法筛选阳性克隆。挑取单克隆培养，进行PCR鉴定，并将阳性克隆送至北京三博生物技术有限责任公司测序。测序结果表明：插入pEasy-blunt载体的基因序列如SEQ ID No.1中第1-579位核苷酸分子所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1-192位所示。
实施例2、e6突变体的获得
1、重组莱茵衣藻的获得
将质粒pSI103用KpnI线性化。称取0.1g玻璃珠(425-600um，Sigma)置于1.5ml离心管中，121℃灭菌20分钟后，放于室温待用。将100ul的CC400(mt+)藻液和10ul的pSI103质粒加入上述盛有玻璃珠的离心管中，在vortex(Genie 2)上，7档震动15秒后，室温25℃放置4分钟。用移液器将藻液转移到新鲜的TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养24小时后(25℃，60rpm，110μEs-1m-2)，2500rpm离心，收集沉淀用TAP培养液悬起后，涂在含有巴龙霉素(10ug/ml)的培养基平板上，能够生长的藻株，为重组莱茵衣藻。
2、e6突变体的获得
通过叶绿素荧光测定方法从上述获得的重组莱茵衣藻中筛选e6突变体：在进行荧光测定时，先将衣藻从平板上划起，接种到50ml三角瓶中培养至指数生长期后，转移到装有100ml TAP培养基的250ml三角瓶中，并调节初始OD750为0.05。后将其置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养，待长到指数生长期后，调节叶绿素浓度到12ug/ml，在暗适应20min后，通过IMAGING-PAM测定Y(II)值。
野生型的Y(II)值为0.51-0.55，筛选Y(II)值小于0.30的重组藻株。当重组藻株的Y(II)值为0.16时，则该重组藻株即为e6突变体。
将该e6突变体进行测序，结果表明：野生型上的SEQ ID No.3所示的序列被SEQ IDNo.4所示的质粒pSI103上的序列替换，获得e6突变体。e6突变体其余基因组序列与野生型基因组序列一致，SEQ ID No.3所示的序列中第683-3535位为e6基因的序列。
实施例3、互补藻株的获得
将实施例1中测序正确的克隆提取质粒(购自北京索莱宝公司)用限制性内切酶NdeI和EcoRI(购自Takara公司)分别酶切上述质粒及pJR38载体，37℃酶切2小时后，用Tiangen(Beijing，China)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209-03)回收纯化目的条带和pJR38载体，并将纯化后的目的条带与pJR38载体用T4 DNA连接酶25℃连接3小时，获得pJR38-E6质粒。再将pJR38-E6质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)Trans-T1 感受态细胞(购自北京全式金公司)。挑取单克隆，用上述引物F/R进行PCR扩增，以获取阳性克隆，并将其送至北京三博生物技术有限责任公司测序。测序结果表明：插入pJR38载体NdeI和EcoRI之间的基因序列如SEQ ID No.1中第1-579位核苷酸分子所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2中第1-192位所示。
将测序正确的克隆提取质粒(购自北京索莱宝公司)。将其转化实施例2中获得的e6突变体，并用下列特异性引物筛选并验证互补藻株(如图1所示)。引物序列如表2所示。
表2.PCR扩增所用的引物序列
实施例4、叶绿素荧光测定
Y(II)表示在一光照强度下，开放的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率，反应了PSII光化学淬灭的能量占PSII天线系统吸收的总能量的比例。计算公式为(Fm’-Fo’)/Fm’，其中Fo’和Fm’为光化光下的初始荧光和最大荧光值。
为了确定e6突变体的表型与E6基因之间的关系，我们对野生型、e6突变体和互补藻株(C-14、C-19…C-41)的荧光参数Y(II)进行了测定。在进行荧光测定时，先将衣藻从平板上划起，接种到50ml三角瓶中培养至指数生长期后，转移到装有100ml TAP培养基的250ml三角瓶中，并调节初始OD750为0.05。后将其置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养，待长到指数生长期后，调节叶绿素浓度到12ug/ml，在暗适应20min后，通过IMAGING-PAM测定Y(II)值。
从图1中可以看出，在正常条件下，e6突变体的Y(II)值仅相当于野生型的37％，这说明该突变体的光合电子传递速率受到了影响。而在筛选到的一系列互补藻株中，其Y(II)值均有不同程度的恢复(48-92％)，这说明E6基因与E6的光合表型是相关的，在光合作用中有重要功能。
Claims (2)
1.如下1）-6）任一所述在提高植物光合效率中的应用；
1）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）编码1）所述蛋白质的核酸分子；
3）含有2）所述核酸分子的表达盒；
4）含有2）所述核酸分子的重组载体、或含有3）所述表达盒的重组载体；
5）含有2）所述核酸分子的重组质粒、或含有3）所述表达盒的重组质粒；
6）含有2）所述核酸分子的重组藻株、或含有3）所述表达盒的重组藻株、或含有4）所述重组载体的重组藻株。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为莱茵绿藻。
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