CN104307041A - 纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料的应用。具体涉及纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料抑制破骨细胞生成的应用和纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料作为骨缺损修复材料的应用。纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料在体液环境下所释放的钙离子及硅酸能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，并诱导其分泌大量骨保护素，从而起到抑制破骨细胞活化及破骨功能的作用。而在植入后期，骨保护素分泌恢复正常水平，此时破骨细胞的活化有利于骨改建过程的正常进行。

Description

纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料的应用

技术领域

本发明属于组织工程支架材料领域，涉及一种利用仿生矿化的原理实现两种矿物质---二氧化硅和羟基磷灰石在胶原纤维内有序沉积的方法，构建了具有良好机械性能和成骨特性的新型纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料。

背景技术

I型胶原蛋白是脊椎动物骨、牙等硬组织中的主要有机基质，具有来源广泛、合成简单、生物相容性良好、韧性较强等特点，是组织工程领域常用的支架材料，但是易于降解的特点及较差的机械性能限制了其更广泛的应用。如何用仿生合成的方法，实现I型胶原纤维内的快速有效矿化，恢复自然矿化单位中胶原分子与矿物质从微观水平到介观水平再到宏观水平分级有序的结合形式，从而达到优良的机械性能，是该领域的研究热点和难点，针对该问题的探索也必将为新一代的骨、牙等硬组织修复材料的研发提供全新的思路。

国内外大量研究表明，以聚合物稳定磷酸钙无定形液相前体为基础，初步实现纤维内矿化恢复自然矿化胶原的仿生结构，并具有良好机械强度，而受到广泛关注。但是目前的仿生钙化方法仍存在周期较长、钙化深度受限、钙化不均匀及胶原部分降解等问题，从而制约了该方法的广泛应用。

在自然界的生物矿物中，除含钙矿物(碳酸钙、磷酸钙等)以外，非晶二氧化硅是另一种主要形式。由于二氧化硅具有合成迅速的特点，发明人在前期工作中借鉴生物硅化的原理，以合成迅速的二氧化硅替代传统的羟基磷灰石，实现胶原纤维的快速硅化，从而克服了纤维内钙化技术在应用过程中的瓶颈问题。通过该项技术所形成的硅化胶原支架表面含有大量的活性硅醇基团，从而有利于支架材料的各种功能化修饰，并且能够随着活性硅的水解而进行缓释，所释放出的活性硅能够显著促进骨髓间充质干细胞(BMSC)的成骨分化及血管内皮前体细胞(EPC)的成血管分化，显示了其在骨缺损修复领域中的应用前景。但在发明人进一步推进该材料的转化应用过程中，发现由于纤维内二氧化硅的无定形状态导致材料的机械性能尚无法与自然骨组织相匹敌，并且存在体内降解速度与新生组织长入不匹配，材料骨整合速度较慢等问题亟待解决。

发明内容

针对现有技术的缺陷或不足,本发明的目的在于提供纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料抑制破骨细胞生成的应用。

针对现有技术的缺陷或不足，本发明的另一目的是提供纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料作为骨缺损修复材料的应用。

与现有技术相比,本发明的优点在于:

(1)骨修复材料的早期骨整合对于缺损修复效果至关重要，因此如何在植入早期诱导成骨细胞活化同时抑制破骨细胞功能是实现早期骨整合的关键。纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料在体液环境下所释放的钙离子及硅酸能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，并诱导其分泌大量骨保护素，从而起到抑制破骨细胞活化及破骨功能的作用。而在植入后期，骨保护素分泌恢复正常水平，此时破骨细胞的活化有利于骨改建过程的正常进行。

(2)本发明所形成的纤维内钙/硅杂化仿生胶原支架相比于其他骨修复材料具有明显的优越性，体现在：

1)纤维内的矿化模式更高程度的模拟了自然骨组织的矿化形式，显著增强了胶原纤维的机械强度，并能够为细胞生长提供更好的内环境；

2)材料中羟基磷灰石/二氧化硅多组分有序结合的特点综合了胶原纤维的生物相容性、羟基磷灰石的骨传导性及活性硅促进成骨、成血管特性；

3)材料钙/硅比例的可控化为定向调节材料的理化性能、机械强度及生物学特性提供了可能，有利于形成适于不同类型骨缺损修复的系列材料；

4)二氧化硅表面的活性硅醇基团及纳米羟基磷灰石的强吸附性，使得材料的可修饰性强，且不同的修饰位点及修饰机理有利于对材料实现多重功能化改性。

(3)与传统矿化中胶原与矿物质的无序混合不同，本发明中采用仿生矿化的方法，通过仿生矿化类似物(聚丙烯氯化铵、聚天冬氨酸、聚丙烯酸)的使用，实现了胶原纤维内部的有序矿化，模拟了自然骨组织胶原纤维与矿物质有序排列的纤维内矿化形式，而这种纤维内矿化形式是构成自然骨组织7级分级结构的基础，不仅决定了骨组织在纳米尺度上的力学性能，更对其整体机械和生物学特性起着决定性作用。

(4)由于氯化胆碱具有良好的生物安全性，因此本发明中采用氯化胆碱来稳定硅酸前体溶液，从而为硅酸前体对胶原纤维内部间隙的渗透提供足够的时间。在本发明中采用聚阳离子聚丙烯氯化铵对胶原支架进行前期处理，与胶原纤维表面的阴性电荷位点结合，从而形成富含多聚阳离子的胶原纤维内环境，以促进后期带负电荷的硅酸前体对胶原纤维的粘附、渗透。此外带正电荷的聚丙烯氯化铵有可能与胶原纤维表面的阴性电荷位点结合并发生相分离，模拟了硅藻蛋白兼性分子的特点，为渗透入胶原纤维内部的液相硅酸前体向固相高聚合度的二氧化硅转化提供催化位点，而形成二氧化硅在胶原内部的有序沉积，反映出胶原自然矿化状态时的周期性横纹结构。这种纤维内部的二氧化硅可以进一步为聚阴离子稳定的磷酸钙前体在胶原纤维内部的定向聚集、成核及晶体转化与生长提供位点，从而大大缩短纤维内矿化所需的时间，解决了现有仿生钙化技术中矿化周期长(14天-3月)、矿化不均匀、胶原部分降解等问题。

(5)本发明通过先硅化后钙化的方式，在胶原纤维内部同时引入了二氧化硅和羟基磷灰石两种矿物质，在显著提高胶原支架机械性能的同时，极大的促进了材料的促成骨特性。该材料应用于骨组织工程时，表现出力学性能优、生物相容性高、促成骨活性强等优势。此外，这种钙/硅杂化材料表面存在大量带有负电荷的硅醇基团及活性羟基，可有效结合细胞募集因子SDF-1(等电点＝9.9，中性环境下带有强正电荷)，从而使支架具有自体细胞募集功能；同时纳米羟基磷灰石的强吸附特性便与其与成骨诱导因子特异结合(如BMP-7)，达到促进成骨功能。细胞因子将随材料在体内降解而缓慢、有序释放，使得无需添加额外的缓释系统而实现了杂化骨自体细胞募集性/成骨诱导性的双重功能化修饰，从而达到诱导自体骨组织原位再生的功能，克服了常规骨组织工程中种子细胞获取困难、来源有限、费用昂贵、成骨活性不足等严重缺陷。

附图说明

图1中左图为为实施例1的未矿化胶原支架；右图为实施例1的仿生杂化胶原支架；

图2为实施例1的仿生杂化处理胶原支架的Micro CT重建图像；

图3为实施例1的纤维内杂化胶原支架的热重分析，其中实线表示质量保留率；虚线表示微分质量保留率；

图4为实施例1纤维内杂化胶原支架、对比例2仿生钙化胶原支架和对比例1的仿生硅化胶原支架的机械性能对比分析图；

图5为实施例1仿生杂化胶原支架活性硅及钙离子的释放特点，SCS:硅化胶原、CCS:钙化胶原、BCS:杂化胶原；

图6为实施例1的仿生杂化胶原支架在模拟体液中浸泡24小时后表面形成大量羟基磷灰石沉积；

图7为不同支架材料的生物相容性对比图，图中相同大写字母表示不同支架组间不具有统计学显著，P>0.05；相同小写字母表示不同支架浸提液组间不具有统计学显著，P>0.05；

图8为不同支架材料在体外实验中的促成骨特性，图A为各组支架对骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性的影响；图B为各组支架对骨髓间充质干细胞体外形成矿化结节能力的影响；图C为各组支架对骨髓间充质干细胞体外成骨分化相关基因表达的影响，CS:未矿化胶原、SCS:硅化胶原、CCS:钙化胶原、BCS:杂化胶原；ALP：碱性磷酸酶、COLI：I型胶原、OPN：骨桥蛋白、OC：骨钙素、OPG：骨保护素、RANKL：核因子κB受体活化因子配体N＝6表示：每组6个样本；

图9为不同支架材料在体外实验中抑制破骨前体细胞的分化及破骨功能结果对比图，A图为各胶原支架与骨髓间充质干细胞共培养7天后的OPG及RANKL蛋白表达变化；B图为与支架材料共培养后的骨髓间充质干细胞对RAW细胞破骨分化及骨吸收功能的影响，C图为RAW细胞TRAP染色，D图为RAW细胞骨吸收陷窝检测；

图10为仿生杂化胶原支架激活骨髓间充质干细胞的相关通路变化该图显示，仿生杂化胶原支架可通过激活骨髓间充质干细胞P38(由硅激活)及AKT(由钙激活)通路，显著促进其分泌破骨抑制因子骨保护素(OPG)，从而抑制破骨前体细胞的分化及破骨功能，A图为各胶原支架与骨髓间充质干细胞共培养7天后的ERK1/2，P38及AKT通路的活化情况。由图可见仿生硅化胶原支架(SCS)主要活化ERK1/2及P38通路，仿生钙化胶原支架(CCS)主要活化AKT通路，仿生杂化胶原支架(BCS)三条通路均显著活化；B图为A实验定量统计分析结果；C图为BCS可显著促进骨髓间充质干细胞表达破骨抑制因子OPG，该作用可被P38通路抑制剂SB203580及AKT通路抑制剂LY294002显著阻断，但ERK1/2通路抑制剂U-0126则无阻断作用，D图为为C实验定量统计分析结果；E为与BCS共培养后的骨髓间充质干细胞可显著促进RAW细胞破骨分化及骨吸收功能，第一行为RAW细胞TRAP染色，第二行为RAW细胞骨吸收陷窝检测。BCS的上述作用可被P38通路抑制剂SB203580及AKT通路抑制剂LY294002显著阻断，但ERK1/2通路抑制剂U-0126则无阻断作用。F与G:为E实验定量统计分析结果。上述结果表明BCS的抑制破骨作用主要是通过释放硅激活骨髓间充质干细胞P38通路，释放钙激活其AKT通路，两者的叠加作用显著促进干细胞分泌OPG，从而达到了明显抑制破骨前体细胞分化及成熟的效果。BCS释放硅激活干细胞ERK1/2通路主要是参与了其成骨分化过程；p-ERK：磷酸化的细胞外信号调节激酶、total-ERK：整体细胞外信号调节激酶、p-p38：磷酸化的p38、total-p38：整体p38、p-AKT：磷酸化的蛋白激酶B、total-AKT：整体蛋白激酶B。图中相同大写字母、小写字母、数字表示不同组间不具有统计学显著，P>0.05。

图11为仿生杂化胶原支架修复小鼠颅骨缺损的典型显微CT图片。

具体实施方式

在仿生硅化领域中，硅藻、海绵等生物在常温常压下可快速合成硅质细胞壁，这一现象引起研究者的浓厚兴趣。从硅藻细胞壁中提取的长链聚胺可以在体外快速催化硅酸前体溶液凝集形成二氧化硅。这一现象提示我们使用合成迅速的二氧化硅替代传统的羟基磷灰石，有望实现胶原纤维内的快速有效矿化，形成以胶原纤维内部二氧化硅有序沉积为特征的支架材料。同时这种纤维内部的二氧化硅可以进一步为纤维内羟基磷灰石的聚集、成核、生长提供位点，从而大大加速了纤维内钙化的进程，形成以纤维内部二氧化硅和羟基磷灰石有序沉积为特征的新型支架材料。已有研究表明二氧化硅水解所释放的硅酸具有促进成骨、成血管的潜能，而羟基磷灰石则具有良好的生物相容性和骨传导性，从而为早期的骨结合提供物质基础，那么所形成的新型仿生杂化胶原材料是否具有促进骨缺损修复的作用呢？国内外尚未见利用仿生矿化的方法，实现胶原分子纤维内杂化矿化，构建新型纤维内仿生硅化胶原支架材料并应用于骨缺损修复的报道。

本发明的纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料可采用下述方法制备：

(1)采用胶原(牛胶原、猪胶原等)溶胀液冷冻干燥法制备疏松多孔的胶原支架，并进行交联固定；

(2)采用聚丙烯氯化铵溶液对上述制备的胶原支架进行表面处理；

(3)通过水解正硅酸四乙酯获得正硅酸溶液，与不同浓度的氯化胆碱溶液混合后，制备稳定的硅酸前体溶液；

(4)将步骤(2)所得的经表面处理的胶原支架置于步骤(3)所得的硅酸前体溶液中进行矿化处理，制得以纤维内二氧化硅矿物质在胶原分子内的有序沉积为特征的仿生硅化胶原材料；

(5)制备聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液；

(6)将步骤(4)所得的纤维内仿生硅化胶原支架材料置于步骤(5)所得的聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中孵育制得纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料。该纤维内杂化胶原支架材料以胶原纤维内羟基磷灰石与二氧化硅有序沉积为特点、具有不同钙/硅比例的仿生杂化胶原支架材料。

实施例1：

该实施例为纤维内仿生硅化胶原支架材料的构建：

(1)取新鲜牛腱500g，去除筋膜、脂肪等杂质后切成薄片；将切好的腱片加入250mL 0.5％的蛋白酶消化液中，在37℃恒温下进行消化处理3小时后，使用100mL 0.3g/L H₂O₂溶液终止酶消化反应，蒸馏水反复冲洗后晾干；将100g晾干的腱片加入100mL 0.1％的醋酸溶液进行溶胀，搅拌均匀并离心除去杂质；采用磷酸盐溶液进行反复盐析，以提高胶原溶液纯度；使用聚乙二醇进行浓缩，制备终浓度为20mg/mL的胶原溶液；-20℃预冷2小时后，置于正空冷冻干燥机冻干24小时，制得多孔胶原海绵；使用0.3M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺/0.06M N-羟基琥珀酰亚胺溶液室温下对胶原海绵进行交联固定5小时，以稳定支架结构；蒸馏水反复冲洗后，再次冷冻干燥，制得孔径50-200μm，孔隙率约为90％的胶原海绵支架。

(2)将步骤(1)所得的胶原海绵支架置于10mg/ml的聚丙烯氯化铵溶液中，37℃恒温下孵育4小时；蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得经聚阳离子表面处理后的胶原海绵支架；

(3)室温以正硅酸四乙酯为原料采用稀酸水解法制备浓度为3％的正硅酸；将所得正硅酸与72mM的氯化胆碱按照1:1的体积比均匀混合，并将终溶液pH值调至5.5；3000转/分钟离心3分钟，取上清制得36mM的氯化胆碱稳定的1.5％的正硅酸前体溶液。

(4)将步骤(2)所得的经表面处理的胶原支架置于步骤(3)所得的稳定硅酸前体溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的硅酸前体溶液，孵育4天后，使用蒸馏水反复冲洗，制得纤维内仿生硅化胶原支架材料。

(5)以Tris缓冲液为溶剂分别制备9mM CaCl₂·2H₂O溶液及4.2mM K₂HPO₄溶液，将上述溶液等容混合，并加入聚阴离子稳定剂如聚天冬氨酸(100μg/mL，从而制得聚天冬氨酸稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液(终浓度：4.5mMCaCl₂·2H₂O/2.1mM K₂HPO₄)。

(6)将步骤(4)所得的纤维内仿生硅化胶原支架材料置于步骤(5)所得的聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中，每天更换钙化液，37℃条件下孵育4天，制得仿生钙/硅杂化胶原支架，如图1、图2所示。所得材料使用PBS反复冲洗材料后冷冻干燥备用。所得仿生杂化胶原支架的矿物质含量约为78.7％，如图3所示，其机械性能优于单纯纤维内硅化或纤维内杂化的材料，如图4所示。

(7)使用25kGy的γ-射线对步骤(6)所得的纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料进行灭菌。

对比例1：

该对比例提供的是关于纤维内仿生硅化胶原支架材料的制备方法：

(1)胶原支架制备方法同实施例1步骤(1)。

(2)将步骤(1)所得的胶原海绵支架置于10mg/ml的聚丙烯氯化铵溶液中，37℃恒温下孵育4小时；蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得经聚阳离子表面处理后的胶原海绵支架。

(3)室温以正硅酸四乙酯为原料采用稀酸水解法制备浓度为3％的正硅酸；将所得正硅酸与72mM的氯化胆碱按照1:1的体积比均匀混合，并将终溶液pH值调至5.5；3000转/分钟离心3分钟，取上清制得36mM的氯化胆碱稳定的1.5％的正硅酸前体溶液。

(4)将步骤(2)所得的经表面处理的胶原支架置于步骤(3)所得的稳定硅酸前体溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的硅酸前体溶液，孵育4天后，使用蒸馏水反复冲洗，制得纤维内仿生硅化胶原支架材料。

对比例2：

该对比例提供的是关于纤维内仿生钙化胶原支架材料的制备方法：

(1)胶原支架制备方法同实施例1步骤(1)。

(2)以0.1M Tris缓冲液为溶剂分别制备9mM CaCl₂·2H₂O溶液及4.2mMK₂HPO₄溶液，将上述溶液等容混合，并加入聚阴离子稳定剂如聚天冬氨酸(100μg/mL)，从而制得聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液(终浓度：4.5mM CaCl₂·2H₂O/2.1mM K₂HPO₄)；

(3)将步骤(1)所得的胶原支架置于步骤(2)所得聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中，37℃条件下孵育14天后，使用蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得具有分级结构的纤维内仿生钙化胶原支架材料。

关于纤维内杂化胶原支架对破骨细胞生成的抑制作用和纤维内杂化胶原支架对骨缺损修复的实验(试验对象选择实施例1和对比例1、2制备的材料)：

(1)硅酸及钙离子释放谱试验

将100mg仿生杂化胶原支架置于15mL pH 7.3的Tris缓冲液中37℃孵育7天，每天使用硅钼酸蓝分光光度法检测溶液中硅酸浓度，使用钙离子电极检测溶液中的钙离子浓度。

(2)生物活性试验

将仿生杂化胶原支架置于模拟体液中，37℃条件下孵育24小时后，样品进行树脂包埋及透射电镜(TEM)观察所形成的纤维外磷酸钙盐情况。

(3)生物相容性试验

采用MTT法检测各种胶原支架及其浸提液对大鼠骨髓间充质干细胞琥珀色脱氢酶活性的影响。分别制备直径5mm，厚度2mm的未矿化胶原、仿生硅化胶原、仿生钙化胶原及仿生杂化胶原支架，置于10％DMEM中孵育2天。支架材料直接接触组中，直接在支架材料上接种100μl密度为5×10⁵/mL的细胞悬液；支架浸提液组中，使用Transwell共培养系统将支架材料与细胞隔开，支架材料置于Transwell上室，等量细胞接种于下室。细胞与材料共培养72h，加入MTT琥珀酸盐溶液培养60min后采用福尔马林固定。使用二甲基亚砜将紫色的MTT结晶物充分溶解，并用酶标仪测量562nm处的吸光度。

(4)体外促成骨特性试验

(4.1)碱性磷酸酶活性检测：同上分别在未矿化胶原、仿生硅化胶原、仿生钙化胶原及仿生杂化胶原支架上接种100μl密度为5×10⁵/mL的细胞悬液，在普通培养基中共培养72h后，采用成骨诱导培养基(RAFMX-90021，上海晶旷生物科技有限公司)体外诱导成骨，分别于成骨诱导7及14天后使用ALP染色试剂盒(博士德公司，武汉)检测碱性磷酸酶的活性；

(4.2)茜素红染色：细胞培养同上，于诱导成骨21天后，采用0.1％茜素红进行染色，10％醋酸处理30分钟后使用10％氨水中和，酶标仪读取上清液在405nm处的吸光度，根据已知钙离子浓度的校正曲线来评估体外形成矿化结节的能力。

(4.3)RT-PCR检测成骨相关基因变化：细胞培养同上，于成骨诱导7天和14天后采用Trizol法提取细胞总RNA，Takara反转录体系(DRR036A)获得cDNA，SYBR法(Takara，DRR820A)扩增，ABI7500检测待测基因拷贝数。成骨相关基因包括：碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(Type I Collagen)、、骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)、骨保护素(OPG)，核因子κB受体活化因子配体(RANKL)。

(4.4)Western blot技术验证相关蛋白的变化：同上细胞与材料共培养后，冰浴条件下用细胞裂解液消化细胞，离心取上清，蛋白定量；配胶，上样，电泳，转膜；封闭3h，加一抗4℃孵育过夜，荧光二抗孵育1h，Odyssey红外成像系统观察拍照；Image Pro Plus 6.0图象分析软件分析结果。检测分子为OPG和RANKL。

(5)体外抑制破骨特性试验

使用Transwell系统(96孔，0.4微米，康宁)将不同的支架材料(下层)与骨髓间充质干细胞(上层)共培养7天。

(5.1)酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色

将上述支架材料处理后的骨髓间充质干细胞(上层)与1×10⁴的RAW 264.7细胞(下层)在Transwell中共培养7天，并在培养基中添加50ng/ml的RANKL(R&D Systems公司，Abdingdon，UK)。使用4％甲醛固定下层细胞，并使用TRAP染色试剂盒(387-A，Sigma-Aldrich公司)对其进行染色。400倍镜下随机选择10个视野，进行TRAP阳性多核细胞(三个或更多个核的每个细胞)计数(N＝6)。

(5.2)骨吸收陷窝法

将RAW264.7细胞(2×10³/孔)接种在1毫米厚的灭菌牙本质片上，37℃下培养24小时后使用Transwell系统加入上述支架材料处理后的骨髓间充质干细胞共培养，并在培养基中添加50ng/ml的RANKL。14天后，超声去除牙本质表面细胞，用1％甲苯胺蓝染色2分钟，染色骨吸收陷窝显示为蓝色区域。400倍镜下随机选择10个视野进行拍照，使用Image J图像分析软件计算吸收陷窝的面积。

(6)体外骨缺损修复能力检测

选取4周龄SD大鼠，腹腔注射麻醉后，纵行切开头皮达颅骨外膜，沿冠状缝制备直径为5mm的圆形标准颅骨缺损，将仿生杂化胶原支架植入缺损区，并进行创口缝合。术后8周，1％戊巴比妥钠麻醉大鼠后，Micro-CT(德国Inveon,SIEMENS)观察骨修复情况。

试验结果：

如图5所示，纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料具有缓慢释放活性硅及钙离子的作用，从而为杂化胶原支架优越的促成骨特性提供了物质基础。

如图6所示，纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料在模拟体液中浸泡24小时后表面形成大量羟基磷灰石沉积，显示了良好的生物活性。

如图7所示，相比于未矿化胶原、单纯硅化胶原及单纯钙化胶原，纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料显示了更优的生物相容性。

如图8和图9所示，在体外实验中纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料能够显著促进小鼠骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性、体外矿化结节形成及促成骨基因的表达，同时在早期(7天)，纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料能够显著促进OPG的表达，而抑制RANKL的表达，而在后期其对OPG的促进作用及RANKL的抑制作用则减弱。

如图10所示，此外纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料处理后的小鼠骨髓间充质干细胞能够抑制破骨前体细胞的分化及破骨功能的表达。

如图11所示，将纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料与小鼠骨髓间充质干细胞培养4天后，植入小鼠5-mm颅骨缺损内，进行骨缺损修复发现两个月内即可修复骨缺损区。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims (2)

1.纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料抑制破骨细胞生成的应用。

2.纤维内仿生硅钙杂化胶原支架材料作为骨缺损修复材料的应用。