CN104306005A - 用于体外刺激全血的便携设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于体外刺激全血的便携设备，还涉及一种利用负压力收集血液的非玻璃血液收集管。本发明公开了一种利用负压力收集血液的非玻璃血液收集管，包括：非玻璃管；一种或多种抗凝血剂；一种或多种白细胞刺激剂；由负压力活化的可视标记物；以及密封所述收集管的可穿刺的自密封盖；其中收集管内的压力与收集管外的压力相比为负。

Description

用于体外刺激全血的便携设备

本发明是申请号为2011800527669(国际申请号为PCT/US2011/058624)、申请日为2011年10月31日、发明名称为“用于体外刺激全血的便携设备”的发明申请的分案申请。

相关申请

本发明要求分别于2010年11月4日和2011年2月17日申请的美国分案申请编号61/410,223和61/443,907的权益。每个这些申请的内容以引用的方式整体并入本文中。

技术领域

本发明的实施方式一般地涉及能够产生和维持设备内的可控环境条件的便携设备。一些实施方式一般地涉及设备在体外处理和刺激全血的用途。

背景技术

分子生物学领域中的研究显示通过研究细胞的核糖核酸(RNA)可以推导出细胞的遗传来源和功能活性。该信息可能应用至临床实践，用于诊断感染，用于检测是否存在表达致癌基因的细胞，用于检测家族性疾病，用于监控宿主防御机制的状态以及用于确定HLA类型或其他识别标记物。RNA以三种功能上不同的形式存在：核糖体RNA(rRNA)，转运RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。稳定的rRNA和tRNA参与翻译中的催化过程，mRNA分子携带遗传信息。总RNA中仅有约1-5％由mRNA组成，约15％由tRNA组成，约80％由rRNA组成。

mRNA是重要的诊断工具，特别是当用于定量观察基因的上调或下调时。人类外周血液是mRNA分析的优秀临床来源。对血液中特定嵌合mRNA的检测例如表明异常细胞的存在，且用于慢性髓细胞性白血病(CML)的分子诊断(Kawasaki E.S.,Clark S.S.,Coyne M.Y.,Smith S.D.,Champlin R.,Witte O.N.,和McCormick F.P.1988.Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocyticleukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5698-5702,Pachmann K.,Zhao S.,Schenk T.,Kantarjian H.,El-Naggar A.K.,Siciliano M.J.,Guo J.Q.,Arlinghaus R.B.,和Andreeff M.2001.Expression of bcr-abl mRNA individual chronic myelogenousleukaemia cells as determined by in situ amplification.Br.J.Haematol.112:749-59)。微转移癌细胞也可通过在血液中测定癌特异性mRNA来检测，例如结肠癌的癌胚抗原(CEA)、前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)、甲状腺癌的甲状腺球蛋白(Wingo S.T.,Ringel M.D.,Anderson J.S.,Patel A.D.,LukesY.D.,Djuh Y.Y.,Solomon B.,Nicholson D.,Balducci-Silano P.L.,Levine M.A.,Francis G.L.,和Tuttle R.M.1999.Quantitative reverse transcription-PCRmeasurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healthy subjects.Clin.Chem.45:785-89)、黑素瘤的络氨酸酶(Pelkey T.J.,Frierson H.F.Jr.,和Bruns D.E.1996.Molecular and immunological detection of circulating tumor cellsand micrometastasis from solid tumors.Clin.Chem.42:1369-81)。另外，由于这些癌特异性mRNA的水平随着处理而变化，因此对特定mRNA的定量在后续处理中提供有用的指标。

由于血液中包含与白细胞(接近5000白细胞/μL)相比大量的无核红细胞(接近5,000,000细胞/μL)，因此在mRNA分析中第一步通常是将粒细胞或淋巴细胞从全血中分离。然而，由于在不同样品中特定亚群的白细胞的回收率不一致，因此对于每个样品确定分离的白细胞数量，结果常常表示为相对于白细胞的mRNA量，而不是mRNA/μL血液。另外，mRNA量可能在漫长的分离过程中变化。

由于缺乏标准，科学界面临着基因表达分析在不同研究所之间、不同实验之间存在差异的巨大问题。虽然最近的基因扩增技术提供了模板DNA的绝对定量，但这些值不能转化为原始材料中基因的量，因为缺少每个样品中RNA回收产量和cNDA合成效率的信息。总RNA经常地用作mRNA定量的标准标记物，且结果典型地表示为每μg总RNA的基因量。然而，必须强调的是，总RNA并不代表mRNA，因为mRNA片段仅为总RNA的1-5％，而且即使在总RNA量相同时，mRNA体积也会不同。总RNA或mRNA的产量也随着采用何种方法而发生较大变化。一旦提取出RNA，接下来的步骤就是合成cDNA，而合成cDNA本身能够产生不确定性，因为现有的方法并不能表明每次实验中每个RNA模板是否产生cDNA的单拷贝。为了避免上述问题，通过将靶基因的数据与持家基因或rRNA的数据相比较广泛地使用相对定量。然而，对照基因的量通常不一致且可能在实验期间发生变化。并且，该变化显示了临床诊断的严重问题，因为每个临床样本都典型地在不同的时间点进行分析。

通常，从全血中分离纯mRNA是非常困难的，因为全血中包括大量的RNA酶(来自粒细胞)和无核红细胞。虽然各种RNA提取方法能够用于全血(deVries T.J.,Fourkour A.,Punt C.J.,Ruiter D.J.,和van Muijen G.N.2000.Analysisof melanoma cells in peripheral blood by reverse transcription-polymerase chainreaction for tyrosinase and MART-1after mononuclear cell collection with cellpreparation tubes:a comparison with the whole blood guanidinium isothiocyanateRNA isolation method.Melanoma Research 10:119-26,Johansson M.,Pisa E.K.,Tormanen V.,Arstrand K.,和Kagedal Bl.2000.Quantitative analysis of tyrosinasetranscripts in blood.Clin.Chem.46:921-27,Wingo S.T.,Ringel M.D.,AndersonJ.S.,Patel A.D.,Lukes Y.D.,Djuh Y.Y.,Solomon B.,Nicholson D.,Balducci-SilanoP.L.,Levine M.A.,Francis G.L.,和Tuttle R.M.1999.Quantitative reversetranscription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood ofhealthy subjects.Clin.Chem.45:785-89)，但是分析过程是劳动密集型，需要几轮离心，并且需要对消除核糖核酸酶的活性必要的小心操作。

发明内容

在一些实施方式中，本文中提供了一种用于在运输血液期间体外刺激血液的系统，所述系统包括便携设备，所述便携设备能够产生和维持设备内的至少两个温度范围，所述设备包括具有内部腔体的隔热设备壳、加热源以及冷却源。在一些实施方式中，内部腔体的尺寸设为容纳一个或多个血液收集管。在一些实施方式中，在启动加热源后，加热源能够将所述设备内的温度维持在第一温度至少1小时，所述第一温度在约25℃至40℃之间的范围内，并且将所述温度维持在围绕所述维持温度±2.5℃的范围内。在一些实施方式中，冷却源能够将所述设备内的温度维持在低于室温的第二温度至少4小时，并且围绕所述维持温度的温度波动在±5℃以内。

在一个实施方式中，第一温度阶段包括37℃±2.5℃的维持温度。在一个实施方式中，第二温度阶段包括4℃±5℃的维持温度。

在一些实施方式中，所述系统进一步包括多个血液收集管，所述血液收集管包含抗凝血剂和刺激剂。在一些这样的实施方式中，刺激剂包括化学治疗药物、免疫调节剂、疫苗、佐剂、重组蛋白、单克隆抗体、凝血素、致病因子衍生物、过敏原以及它们的组合物中的一种或多种。在一些实施方式中，所述系统进一步包括含有抗凝血剂和刺激剂的相应控制溶剂的多个第二血液收集管。

在一些实施方式中，所述血液收集管包括具有与收集管外的压力相比为负的收集管内的压力的非玻璃管，一种或多种抗凝血剂，一种或多种白细胞刺激剂以及密封所述收集管的可穿刺的自密封盖。在某些实施方式中，血液收集管进一步包括由负压力活化的可视标记物。

在一些实施方式中，所述系统进一步包括温度记录设备，其中所述设备连续记录腔体内的温度用于后续读取。

在一些实施方式中，所述设备进一步包括至少一个额外的隔热容器，所述隔热容器配置为放置于所述便携设备中以容纳加热设备和血液收集管。

在某些实施方式中，加热源为电池供电。在某些实施方式中，加热源由一个或多个原(一次性)电池供电。在某些实施方式中，加热源由一个或多个二次(可充电)电池供电。在其他实施方式中，加热源通过化学反应产生热。

在一些实施方式中，温度记录设备为电池供电。在某些实施方式中，温度记录设备由一个或多个原(一次用)电池供电。在某些实施方式中，温度记录设备由一个或多个二次(可充电)电池供电。在某些实施方式中，冷却源包含可重复使用的冷却剂。

在一些实施方式中，提供一种用于利用负压力收集血液的非玻璃血液收集管，其包括：非玻璃管，一种或多种抗凝血剂，一种或多种白细胞刺激剂，利用负压力活化的可视标记物，密封所述收集管的可穿刺的自密封盖。在一些实施方式中，收集管内的压力与收集管外的压力相比为负，从而允许基于管内的负压力收集精准体积的血液。

在一些实施方式中，所述一种或多种白细胞刺激剂选自由下列所组成的组：化学治疗药物、免疫调节剂、疫苗、佐剂、重组蛋白、单克隆抗体、凝血素、致病因子衍生物、过敏原以及它们的组合。

在一些实施方式中，所述一种或多种抗凝血剂包括肝素。在其他的实施方式中，在肝素之外使用其他抗凝血剂，或使用其他抗凝血剂代替肝素。

在一些实施方式中，所述管适于在约25℃至40℃之间的温度孵育至少约1小时。另外，在一些实施方式中，所述管适于在低至足以冷冻血液样品的温度下存储，并且其中所述收集管在所述温度下在结构上稳定(例如在冷冻或溶化时不会破裂或破碎)。

在一些实施方式中，还提供了一种获得血液样品的方法，其包括：检查非玻璃血液收集管是否存在负压力活化的可视标记物，所述非玻璃血液收集管包括一种或多种抗凝血剂、一种或多种白细胞刺激剂、负压力活化的可视标记物以及密封收集管的可穿刺的自密封盖；若存在活化的标记物，则穿刺患者的静脉系统的静脉；穿刺自密封盖；允许血液填充收集管直至负压力被补偿或直至收集到所需的体积。

在一些实施方式中，提供了一种用于体外刺激血液样品的方法，其包括：如上所述从患者获得血液样品；将包含血液样品的血液收集管放置于便携设备中，并且启动电池供电的加热源；该便携设备能够产生和维持设备内的可控环境，其中所述便携设备包括具有尺寸设为容纳血液收集管的内部腔体的隔热设备壳、电池供电的加热源、冷却源。

在一些实施方式中，在启动加热源后加热源能够将内部腔体内的温度维持在约25℃至40℃之间的范围至少1小时。在一些实施方式中，冷却源包括可重复使用的冷却剂，并且能够将设备内的温度维持在低于室温的温度至少4小时。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括：检查第二非玻璃血液收集管是否存在负压力活化的可视标记物，其中所述第二非玻璃血液收集管包括一种或多种抗凝血剂和一种或多种白细胞刺激剂的控制溶剂；若存在活化的标记物，则穿刺非玻璃血液收集管的自密封盖，并从患者的穿刺的血管收集第二血液样品；并且将含有第二血液样品的第二血液收集管放置于便携设备中。

在一些实施方式中，所述方法还包括血液样品的体外分析，其中包括从便携设备移除第一和第二血液样品，并测定来自第一和第二血液样品的一种或多种靶mRNA或一种或多种靶蛋白。

另外，提供了一种体外刺激血液样品的方法，其包括：从患者收集第一血液样品至血液收集管中，所述血液收集管包括非玻璃管、一种或多种抗凝血剂和一种或多种白细胞刺激剂；将血液收集管放置于上述用于体外刺激血液的系统中，并启动电池供电的加热源，从而体外刺激血液样品。

还提供了一种用于体外刺激血液样品的试剂盒，其包括：利用负压力收集血液的非玻璃血液收集管，能够产生和维持设备内的至少两个温度阶段的便携设备；所述非玻璃血液收集管包括非玻璃管(其中收集管内的压力与收集管外的压力相比为负)、一种或多种抗凝血剂、一种或多种白细胞刺激剂以及密封收集管的可穿刺的自密封盖；所述便携设备能够产生和维持设备内的至少两个温度阶段，包括隔热设备壳、加热源以及冷却源；所述隔热设备壳具有尺寸设为容纳多个血液收集管的内部腔体；在启动加热源后所述加热源能够将设备内的温度维持在约25℃至40℃之间的范围至少1小时，其中围绕所述维持温度的波动在±2.5℃以内，并且

所述冷却源能够将设备内的温度维持在低于室温的第二温度至少4小时，并且围绕第二温度的温度波动在±5℃以内。

在一些实施方式中，试剂盒中的设备在约37℃±2.5℃的维持温度下维持第一温度阶段。在一些实施方式中，试剂盒中的设备在约4℃±5℃的维持温度下维持第二温度阶段。

在一些实施方式中，试剂盒包括选自由下列所组成的组的一种或多种白细胞刺激剂：化学治疗药物、免疫调节剂、疫苗、佐剂、重组蛋白、单克隆抗体、凝血素、致病因子衍生物、过敏原以及它们的组合。

在一些实施方式中，试剂盒包括一种或多种抗凝血剂，所述一种或多种抗凝血剂仅包括肝素或包括肝素与其他的抗凝血剂的组合。

在一些实施方式中，试剂盒的血液收集管适于在约25℃至40℃之间的温度孵育至少约1小时。在一些实施方式中，血液收集管适于在低至足以冷冻血液样品的温度下存储，并且其中收集管在所述温度下在结构上稳定。

在一些实施方式中，提供了一种用于在血液运输期间体外刺激血液的系统，所述系统包括：能够产生和维持设备内的可控环境的便携设备。所述设备包括隔热设备壳、多个血液收集管、电池供电的加热源以及冷却源；其中所述隔热设备壳具有尺寸设为容纳多个血液收集管的内部腔体，所述多个血液收集管包含抗凝血剂和刺激剂。在某些实施方式中，在启动加热源后加热源能够将设备内的温度维持在约25℃至40℃之间的范围内至少1小时。在一些实施方式中，冷却源包含可重复使用的冷却剂。在某些实施方式中，冷却源能够将设备内的温度维持在低于室温的温度至少4小时。在某些实施方式中，冷却源能够将设备内的温度维持在低于室温的温度约4至24小时。在某些实施方式中，系统还包括多个第二血液收集管，其包含抗凝血剂和刺激剂的相应控制溶剂。在一些实施方式中，系统进一步包括温度记录设备，其中所述设备连续记录腔体内的温度用于后续读取。

附图说明

图1表示根据某些实施方式的填充有血液样品的一组真空血液收集管；

图2表示根据某些实施方式在存储容器或孵育器中体外刺激血液；

图3表示根据某些实施方式从全血样品分离白细胞的示意性过程；

图4表示根据某些实施方式从全血样品分离的白细胞的存储和配送；

图5为示出根据某些实施方式的mRNA分析的准备步骤的示意性流程图；

图6为根据本发明所述实施方式从设备内部记录的温度随着时间的图表；

图7通过示出抽到管中的水重量在各个管之间没有显著不同从而描述了制造负压力管的可再现性；

图8通过示出抽到管中的水重量在制造后存储14天后没有显著不同从而描述了制造的负压力管在存储后的稳定性；

图9A-9D表示在制造的负压力管中进行的刺激实验与现有的多孔板(multi-well strip)方法相比的比较结果；

图10A-10C表示在制造的负压力管中进行的基因诱导实验与现有的多孔板方法的额外的比较结果；

图11A-11B描述关于血液样品随时间和刺激后的稳定性的数据；

图12A-12F描述关于在不同温度下刺激和孵育导致的基因诱导水平的数据；

图13A-13B描述关于在本文所述的便携设备中孵育导致的基因诱导水平与在温度控制孵育器中相比的数据；

图14描述在本文所述的便携设备中孵育的6个单独的管中记录的温度曲线。

具体实施方式

需要体外血液刺激的改进方法和完成这种方法的设备。一些现有的体外刺激的方法依赖于抽血后的条件。然而，长时间存储血液不符合生理要求，会给血液样品和试验带来负面影响。另外，mRNA诱导可能会在存储中变化。理想地，应在抽血后立即刺激血液。处理血液，在37℃下孵育，分离白细胞或在-80℃的温度下存储刺激后的血液，这些操作在很多情况或地点都是不现实的。例如，若在精密实验室或医院外的位置抽血，则在生理条件下孵育或在-80℃的温度下存储刺激后的血液都是不现实的。

另外，需要一种能够用于一致地且可重复地体外刺激全血的便携设备。还需要一种能够对刺激的血液细胞进行孵育的便携设备以及使用其的方法。还需要一种能够从刺激后的血液细胞分离并存储白细胞的便携设备以及使用其的方法。

在某些实施方式中，公开了用于体外刺激全血的方法和设备。在一些实施方式中，本文中公开的设备是便携式的。在某些实施方式中，设备可用于一些地点，例如医院或实验室外面的地方。在某些实施方式中，设备配置为自调节，例如维持设备内的某个所需温度一定的时间。在某些实施方式中，随着时间维持一个以上的温度(例如，实现顺序所需的温度)。在一些实施方式中，设备适于在全血样品的刺激、孵育和存储以及运输中顺序使用，如下更详细的描述。

在某些实施方式中，从患者收集全血至血液真空收集管中。具有基因特异性引物和探针的相对直接地鉴定和生产，基因扩增技术能够鉴别和定量特异mRNA水平，甚至是来自不同基因的库的mRNA，这使得全血成为mRNA分析的理想材料。在一些实施方式中，一个或多个收集管包含血液刺激剂。在一些实施方式中，收集的全血在收集中肝素化。在一些实施方式中，全血被收集至两个或更多个收集管中。刺激剂可以是液体或固体。可采用足以搅动全血并加速与肝素和/或刺激剂混合的方式振荡或移动所述管。

在某些实施方式中，刺激剂包括化学治疗药物、免疫调节剂、疫苗、佐剂、重组蛋白、单克隆抗体、凝血素或致病因子衍生物。在某些实施方式中，化学治疗药物包括阿糖胞苷、红比霉素、阿霉素、肾上腺素、依托泊苷、阿柔比星或米托蒽醌。在某些实施方式中，重组蛋白包括白介素(例如，白介素-2或白介素10和干扰素(例如γ干扰素)。在某些实施方式中，致病因子的衍生物包括纯化的蛋白衍生物(例如，PPD比如结核菌素PPD)。使用其他刺激剂例如植物凝集素(PHA)、酵母聚糖、肿瘤坏死因子等。

在某些实施方式中，将血液收集至管中以后，在促进刺激全血的条件下孵育血液。在优选的实施方式中，在生理条件下孵育血液。在某些实施方式中，使用约37℃的温度以模仿生理条件。在某些实施方式中，使用约30℃至约33℃之间、约33℃至约35℃之间、约35℃至37℃之间或约37℃至39℃之间的温度。在某些实施方式中，将样品在生理温度下维持并孵育约30分钟至约4小时，包括约30分钟至约1小时，约1小时至约2小时，约2小时至约3小时，约3小时至约4小时以及它们的重叠范围。在某些实施方式中，孵育时间可比4小时更长(例如，4至6小时，6至8小时，8至10小时，10至12小时，12至24小时以及它们的重叠范围)。

在某些实施方式中，样品置于具有能够加热一个或多个管的加热源的存储容器或孵育器中。优选地，存储容器或孵育器中的加热源能够在血液样品中维持生理条件(例如，接近生理温度)。在某些实施方式中，加热源能够在血液管内维持生理条件约30分钟至约4小时，包括约30分钟至1小时，约1小时至约2小时，约2小时至约3小时，约3小时至约4小时以及它们的重叠范围。在一些实施方式中，孵育时间大于4小时(例如约6至8小时或8小时至过夜)。在某些实施方式中，加热源包括加热板。在某些实施方式中，加热板(或其他加热设备)可用电池供电以提供热。在某些实施方式中，计时器调节加热器的操作时间，从而在所需的孵育时间段后，将加热器关闭。在某些实施方式中，使用珀尔贴加热源。在某些实施方式中，使用独立可燃燃料设备用于产生热。在某些实施方式中，加热设备可通过放热化学反应或过程提供热(例如，“封口包(smack-pack)”)。在一些实施方式中，使用冷却管，其中使所需温度的水通过孵育器的壁循环从而将孵育器的内部加热(或冷却)至所需的孵育或存储温度。在一些实施方式中，使用隔离体(在设备内部作为一个整体)将管置于与加热源非常接近的位置从而改善孵育温度随时间的稳定性。与加热源类似地，在某些实施方式中，冷却源可以是通过电池或基于化学反应物(例如尿素、硫酸铵和水)供电。冷却系统可选地包括发动机类似设备例如斯特林冷却器(Stirling Cooler)(FPSC)，或电气设备例如珀尔贴冷却器(Peltier cooler)。在某些实施方式中，使用独立的可重复使用的冰包。在一些实施方式中，冷却系统维持设备内的温度至少24小时(例如，在运输便携设备的整个过程中)。在一些实施方式中，冷却系统能够维持设备内的温度约24小时至约72小时。在某些实施方式中，当加热源启动时，该时间段包括孵育时期。同样，在一些实施方式中，贯穿整个运输过程，当加热源启动时在生理温度下孵育收集管，然后，当加热源关闭时在较低温度下存储收集管(例如，以稳定mRNA)。

在某些实施方式中，存储容器或孵育器配置为被运输或配送到医院或实验室同时在血液样品管中维持生理条件(例如，在配送设备的同时刺激，随后冷却血液样品)。在某些实施方式中，将血液样品从存储容器或孵育器移除，冷却至约-80℃的温度并存储直至后续处理和测试。在一些实施方式中，孵育器同时作为存储容器，使用者改变孵育器的配置(例如移除加热板并安装冰包)从而将孵育器转变为存储容器。然而在一些实施方式中，使用分离的孵育器和存储容器。

在其他的实施方式中，单个设备发挥孵育器、存储容器和配送容器的作用。例如，在某些实施方式中，提供单个隔离的设备(例如容器)，其包括加热源和冷却源。在某些实施方式中，设备进一步包括温度记录设备，其允许对设备内的温度历史进行分析。在某些实施方式中，设备可选地配置有用于收集血液的管。在这样的实施方式中，所述管可选地包含所需的刺激剂，例如本文中所述的那些。因此，提供单个的设备，其允许使用刺激剂在所需的时间段内在生理温度下刺激(例如孵育)血液样品，然后将刺激后的血液样品在较低的温度(例如在室温或低于室温)下孵育一段时间，上述每一步都发生在将设备配送至对基因表达进行分析的地点过程中。已经确定在这样的温度下进行刺激后mRNA的稳定性。不管mRNA的稳定性如何，温度记录设备提供一定程度的样品的质量控制，可对没有暴露于适宜刺激条件(例如温度过高或过低，孵育时间缩短或延长)的样品进行鉴别和丢弃。

这样的设备特别有利于抽血实验室使用。为了避免不同实验室在进行体外刺激中的差异，如本文中所述的设备设置为能够在多个实验室进行可控的且可重复的体外刺激。实验室首先从患者获得血液样品。在某些实施方式中，血液抽入标准的血液收集管中，但在优选的实施方式中，血液直接抽入提供给实验室的管中，管中包含所需的刺激剂(或控制溶剂)。在某些实施方式中，可选地利用管的真空压进行抽血，从而降低由于收集的体积而产生的差异。收集至含有刺激剂的管中后，将管置于设备中，并启动加热源和冷却源。在某些实施方式中，加热源和冷却源整合在设备中，而在某些实施方式中，使用者将启动的源置于设备中。在某些实施方式中，温度记录设备可选地启动并置于设备中，而在另外的实施方式中，温度记录设备整合在设备中。最后，实验室将设备密封并配送到后续的基因表达分析的中央位置。在这样的实施方式中，使用标准的橡胶管盖。在于实验室中进行刺激和分离的其他实施方式中，如下面更详细描述的，使用具有隔离基质的专用盖板。

如本文中所述的那样，设备由对设备内的环境带来隔离效果的材料(例如，聚苯乙烯泡沫，玻璃纤维等)构成。因此，设备与加热源和冷却源组合，起到将设备内(例如，放置了含有血液的管的地方)的温度维持在所需温度所需的时间长度的作用。在某些实施方式中，所维持的温度曲线从接近生理温度的起始时间段(例如用于刺激血液样品)开始，接着是较低温度的第二时间段(例如用于稳定刺激后的mRNA)。例如参见图6。可以理解，在对mRNA进行刺激或任何相关诱导后，降低的温度(与加热源产生的生理温度相比)足以将诱导的mRNA维持较长的时间段(足以将设备配送到能长期保存样品的中央实验室)。

在替代的实施方式中，可在原位刺激血液样品后原位分离白细胞。孵育后，将含有血液样品的管从孵育器移除。可将盖从血液管移除并用具有白细胞捕获膜的盖代替。可将若干白细胞滤膜层叠在一起以提高捕获的白细胞的产量。在一些实施方式中，白细胞捕获膜位于盖上，使得当盖与样品管卡合时，白细胞膜朝向血液样品(例如，与血液样品并置)。在某些实施方式中，含有白细胞捕获膜的盖还包括吸湿材料以及能够打开以移除吸收材料的盖。在某些实施方式中，白细胞膜位于盖的近端，吸水材料位于盖的远端。在某些实施方式中，白细胞捕获膜包括白细胞吸附介质或适用捕获白细胞的其他类似纤维或玻璃基质。

在某些实施方式中，可通过倒转样品管并允许重力拉动样品材料穿过膜，从而捕获白细胞。在其他实施方式中，使用离心、真空压、正大气压或其他类似有效手段用来使样品材料移动穿过膜。吸水材料会从血液样品吸收水和其他材料，例如红细胞，而白细胞被捕获并保留在盖中的滤膜上。

在某些实施方式中，存储容器或孵育器可用来在分离白细胞以后存储、运输和/或配送样品。如前面讨论的那样，在某些实施方式中，存储容器或孵育器可冷却或加热样品以在配送和存储期间维持所需的条件。在某些实施方式中，存储容器中使用环境条件。在一些实施方式中，使用第二“封口包”或其他冷却或加热产生机制来建立所需的存储温度(例如多温度方案)。

在某些实施方式中，在从血液样品分离白细胞之后，准备mRNA分析。mRNA分析的准备可通过以下来进行：对白细胞进行细胞裂解以产生含有mRNA的裂解产物，将裂解产物转移至GENEPLATE以捕获mNRA，并对mRNA进行定量。在一些实施方式中，在现场进行分离，然后冷冻以备分析。在某些实施方式中，在现场(例如在实验室外)将mRNA转化成cDNA，然后冷冻以备后续的扩增分析(或其他种类的基因表达分析)。

在使用具有白细胞捕获盖的管的一些实施方式中，将具有白细胞捕获膜的盖从血液收集管移除。在某些实施方式中，接着打开盖上的盖板以移除吸湿材料，吸湿材料可丢弃(或回收和/或用于其他分析)。然后将新的管连接至含有白细胞捕获膜和白细胞的盖。可穿过用于移除吸湿材料的盖板向管中添加裂解缓冲液。使用裂解缓冲液将捕获于滤膜上的白细胞裂解以从白细胞释放mRNA。可通过离心、抽真空、正压力或乙醇洗涤后抽真空来完成裂解产物向基因板或其他收集管的转移。通过产生cDNA和PCR扩增cDNA来对mRNA进行定量。特别优选的实施方式使用TaqMan PCR(荧光定量PCR)来定量mRNA。

关于可用于一些实施方式的裂解缓冲液的组成的更多细节可在2006年3月15日申请的美国专利申请第11/376,018号中找到，目前该申请为悬而未决状态，其以引用方式整体并入本文中。在一些实施方式中，从mRNA来合成cDNA。在优选的实施方式中，接着使用实时PCR且使用专门设计用于扩增某些所需基因的引物(例如已建立的或推定的疾病标记物)进行cDNA扩增。关于某些实施方式中使用的PCR反应的更多细节可在美国专利申请第11/376,018中找到。关于对来自全血细胞的mRNA定量的更多细节可在2004年3月9日申请的美国申请编号10/796,298中找到，目前其以美国专利第7,745,180被公布，且其以引用的方式整体并入本文中。

完成PCR反应后，对一个或多个基因(例如疾病标记物)的mRNA(以检测得到的PCR扩增的cDNA量表示)进行定量。在某些实施方式中，通过将编码一个或多个标记物的mRNA的量与参考值比较来计算定量。在其他的实施方式中，参考值是不被刺激剂诱导的基因，例如持家基因的表达水平。也可使用本领域周知的持家基因作为参考值。在其他的实施方式中，持家基因用作校正因子，例如最终的比较是一个或多个标记物的诱导表达水平与来自非诱导(对照)样品的相同标记物比较。在另外的其他实施方式中，参考值为零，从而一个或多个标记物的定量由绝对数值表示。在一些实施方式中，计算一个或多个攻击性免疫标记物的表达与一个或多个防御性免疫标记物的表达相比较的比值。在另外的其他实施方式中，不进行标准化。

在某些实施方式中，提供一种试剂盒，其包括本文中公开的任何设备的组合。在某些实施方式中，试剂盒包括含有肝素的血液收集真空管，含有肝素和刺激剂的血液收集真空管，能够将血液收集真空管在生理温度下维持至少30分钟的加热板(或其他加热源)。在某些实施方式中，试剂盒包括能够存储和配送一个或多个血液收集真空管的存储容器。在某些实施方式中，试剂盒包括包含白细胞膜和吸湿材料的盖。

实施例

参照下列实施例描述具体的实施方式，下列实施例应仅认为是示例性的而不是限制性的。

实施例1-体外血液刺激

图1-5表示根据某些实施方式用于收集血液、处理样品以及在处理的血液样品上进行mRNA分析的方法和设备。如图1所示，在填充全血细胞之前管A和B都含有肝素。在其他的实施方式中，肝素(或其他抗凝血剂)可手动加入到管中。管A用作对照，因为其不含有任何刺激剂。管B含有干燥的刺激剂。如上所述，在某些实施方式中，手动加入刺激剂，包括其他的刺激剂。将血液收集到样品管中，然后振动或摇动管以确保肝素和/或刺激剂与收集的血液混合。

然后，如图2所示，使用一次性孵育器孵育图1的血液样品。在一些实施方式中，在生理条件下进行孵育。在某些实施方式中，使用约37℃的温度。一次性孵育器具有能够加热样品2-4小时的加热板。在其他的实施方式中，可根据需要增加或降低孵育的时间和/或温度。

接下来，如图3所示，将刺激的血液样品从孵育器移除。将管的盖移除并用具有白细胞膜和吸收材料的盖替代。当盖与管卡合时，白细胞膜更接近管中的血液。接下来，在孵育之后，将管倒转过来从而使得血液与白细胞膜接触。在重力(或其他的力，取决于不同的实施方式，例如真空压)的辅助下过滤血液样品。白细胞被捕获到膜上，且吸湿材料捕获穿过白细胞膜的材料(例如血浆、红血细胞等)。接下来，将两个样品管放回所需条件(例如用于存储的-80度)下的孵育器中。如图4所示，接着使用孵育器存储或配送样品。

如图5所示，样品管经过更多步骤以准备mRNA分析。将具有白细胞滤膜和吸湿材料的盖从管移除。然后将吸湿材料从盖上的盖板移除。然后将含有滤得的白细胞的白细胞过滤器与干净的样品管卡合。接下来，穿过盖中的盖板添加裂解缓冲液以处理白细胞。然后将管旋转或离心以收集管底部的裂解产物并转移至GENEPLATE(基因板)或其他收集器皿。然后，可通过PCR或其他本领域已知方法确定裂解产物中靶RNA的量。

实施例2-血液收集管的制造和试验

通常，血液收集管由玻璃制成，由于生产中的缺陷、暴露于不稳定的温度或处理不当，血液收集管可能会破裂。假设血液样品常被收集用于评价患者的健康状况，则血液样品可能含有对收集和/或分析血液样品的个人造成危险的病原体、化学物质或其他物质。从而，在一些实施方式中，提供了一种非玻璃血液收集管，其降低了管体破裂和有关人员意外地暴露于患者血液样品中的风险。非玻璃血液收集管，例如本文中公开的非玻璃血液收集管与传统玻璃管相比是有利的，因为能够将收集的血液样品冷冻存储于-70℃以下(例如在刺激的方案以后)，且在最终分析之前的解冻过程中破裂的风险降低。在一些实施方式中，非玻璃管包括聚丙烯。在其他的实施方式中，使用聚苯乙烯管。在另外的其他实施方式中，可以使用对于承受管内的负压的产生(和保持)和一个或多个冷冻-解冻循环足够的耐用的其他聚合物或塑料管。

许多抽血管通过使得血液从患者(或分离的血液收集设备)流入收集管中负的内部压力(相对于外部环境而言)来操作。这不仅使得以较低的患者不适感进行抽血，还避免血液回流入患者的静脉系统。

为了确定制造具有负的内部压力的非玻璃(例如塑料)管的可重复性，手动制作具有自密封的可穿刺的盖的塑料管以使其具有负的内部压力。在4个实验的每个实验中制造3个管(总计12个管)。使用一端浸入水中的剂量注射针21穿刺所述盖，从而允许负压力将水抽入管中。然后称量每组管的重量。如图7所示，不同实验中管的均重没有显著差异，从而说明制造这样的收集管是可重复的。

管除了在样品收集中具有可重复性之外，重要的是还相对于维持管内的负压力具有足够的使用期限以及管本身的耐用性。同样，如上所述的制备其他的管。然后将它们在室温下存储0至14天。如上所述，使用剂量注射针21收集水，并对管进行称重。图8描述了重量，其显示出将管存储14天与存储2天相比或与制造后立即使用相比，管内的负压力没有差别。

实施例3-制造的血液收集管与多孔板的比较

确认制造非玻璃血液收集管的可重复性以后，进行以下实验来评定这样的收集管是否与更传统的体外血液刺激方法(例如，将小体积血液置于孔中并单独添加刺激剂)具有一样好的性能。

如上所述制造血液收集管。将三个管在4℃(图9中的管PHA 4C#1，#2，#3)或室温(图9中的PHA RT)下存储20天。然后将血液抽至6个管中：对照肝素管，空白肝素管，4个含PHA的管。将来自对照肝素管的血液在微孔板管胚(每个3孔，60μL血液/孔)中进行刺激(使用PBS或PHA)。将其余5个管在37℃下孵育4小时。如前面所述的那样使用SYBR绿色实时PCR对各种mRNA进行定量(Mitsuhashi M et al.Clin.Chem.52:634-642,2006)。

简单的说，将白细胞去除膜(Leukosorb；Pall)安装到96孔滤板上并置于固定有寡聚(dT)的收集板上方。使用150μL的5mmol/L Tris(pH 7.4)润湿滤膜。在120g 4℃下离心1分钟以从膜去除Tris溶液，然后向每个孔加入50μL刺激后的全血样品，并立即在120g 4℃下离心2分钟。然后用300μL的磷酸盐缓冲盐溶液洗涤各孔一次。在2000g 4℃下离心5分钟以去除盐溶液后，向滤板的各孔添加60μL储备裂解缓冲液(5g/L N-十二烷基肌氨酸，4×标准柠檬酸盐，10mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，1mmol/L EDTA，1ml/L IGEPAL CA-630(NP-40的替代物)，1.79mol/L硫氰酸胍(均来自Sigma))，并补充10mL/L 2-巯基乙醇(Bio-Rad)，0.5g/L蛋白酶K(Pierece)，0.1g/L鲑鱼精DNA(5PrimeEppendorf/Brinkman)，0.1g/L大肠杆菌(Escherichia coli)tRNA(Sigma)，特异反向引物每个5nmol/L以及1010分子/L的合成RNA34(作为外部对照)。然后将板在37℃孵育10分钟，置于固定寡聚(dT)的收集微板(GenePlate；RNAture)上方，并在2000g 4℃离心5分钟。在4℃过夜存储后，使用100μL普通裂解缓冲液洗涤微板3次，然后使用150μL 4℃的洗涤缓冲液(0.5mol/LNaCl，10mmol/L Tris(pH 7.4)，1mmol/L EDTA)洗涤3次。

通过添加30μL含1×反转录缓冲液的缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，5.5mM MgCl2，1nL/μL吐温20)、脱氧核苷三磷酸各1.25mM、4个单位的rRNasin以及80U MMLV反转录酶(Promega；不含引物)，并在37℃孵育2小时，从而在每个孔中直接合成cDNA。从每30μL反应物中，将4μLcDNA直接转移至384孔PCR板，并添加5μL TaqMan通用型主混合物(Applied Biosystems)和每个mRNA或β-肌动蛋白的5μM正向和反向引物各1μL。在PRISM 7900HT(Applied Biosystems)中进行PCR，95℃10分钟进行1个循环，接着95℃30秒、55℃30秒和60℃1分钟进行45个循环。每个基因在单独的孔中扩增。利用分析软件(SDS；Applied Biosystems)确定循环阈值(Ct)即产生一定量PCR产物(基于荧光)的循环。通过用每个PBS处理对照样品的Ct减去每个PHA处理样品的Ct来确定ΔCt，并以2^-ΔCt计算倍增量。

如图9A-9D所示，血液收集管显示出对于对照反应的比较结果(例如比较PBS板与普通真空管(Plain Vacuum Tube))。并且，没有检测到含PHA的管在室温下存储与在4℃存储之间存在差异。最后，对于所有被测基因(β-肌动蛋白、γ干扰素、白介素2和GM-CSF)，没有检测到在多孔板形式中进行的和在含PHA的血液收集管中进行的PHA刺激之间存在差异。这些结果表明在血液收集管中刺激血液与在多孔板形式中进行刺激具有同等的可靠性和可重复性。

进行其他实验来确定收集血液样品和刺激样品之间的延迟作用。将血液抽取至4个含肝素的如上所述制造的真空管中(3个普通管，1个含有干扰素α2b，IFNa2b的管)。抽血后立即将一个普通管和IFNa2b管置于37℃孵育器中2小时。立即将其他普通管等分至多孔板管中，并用PBS或IFNa2b(每个3孔，60μL血液/孔)在37℃刺激2小时。孵育后，将各管在-80℃下存储。将最后的普通管在4℃下存储6小时，然后等分至多孔板以使用IFNa2b刺激。如图10A至10C所示，IFNa2b管(空心三角)的特性与在板孔中的传统IFNa2b刺激(空心圆圈)相同。相比之下，对于GIP2和CXCL10(实心方块)，起初在体外刺激之前在4℃存储6小时的血液表现出比IFNa2b少的诱导。实际上，在孵育期间可能有mRNA的降解，因为β-肌动蛋白的水平下降(图10A)。

实施例4-刺激后血液样品的稳定性

为了评估刺激后血液样品的稳定性，在板条孔中使用DNR(终浓度10μM)、AraC(终浓度100μM)或PBS在37℃下刺激血液4小时，然后在4℃下存储0-3天。在4℃孵育后，将样品在-80℃冰箱中存储直至分析。这些实验条件设计为代表样品在本文所述便携孵育设备在运输期间会暴露的可能条件。如上所述对3个mRNA(ACTB，p21和PUMA)进行定量。

如图11A-11B所示，β-肌动蛋白不被任一种试剂(空心符号为PBS对照，实心符号为DNR或ArcC刺激)诱导，并且β-肌动蛋白mRNA的水平在3天中相对稳定。图11A示出DNR引起p21的显著诱导(空心和实心三角之间的箭头)。AraC刺激也得到类似的结果(图11B)。类似地，两种试剂都诱导PUMA表达。刺激后存储1天以后，p21和PUMA的表达水平与0天时类似。然而，刺激后存储3天后，对于两种刺激剂，p21和PUMA的水平都表现出降低(更高的Ct值)。刺激后1天还具有明显的增加。同样地，这些结果表明在某些实施方式中，刺激后存储2天是可能的。然而在一些实施方式中，刺激后的血液可在4℃存储1天。

还对两种不同的孵育温度评估了诱导的时间过程。这是为了评估样品可暴露于孵育温度且仍提供可靠且稳定的基因表达数据的时间。用PHA、IFNa2b或PBS(重复三次)在板孔中在37℃或42℃下刺激血液0-9小时，然后在-80℃下冷冻存储。这些温度代表本文中公开的便携孵育和存储设备的用于某些实施方式的小型便携加热器的可操作范围。对ACTB，IL2和CXCL9mRNA进行定量。

如图12A和12D所示，无论什么刺激剂在40℃或37℃下孵育血液样品不会改变β-肌动蛋白的表达。图12B和12E表明通过与PHA孵育来诱导IL-2mRNA无论在42℃下或37℃下进行都是类似的。另外，当在1小时至9小时之间的任一点进行刺激时，表达水平都是类似的。类似地，图12C和12F中，无论孵育温度和孵育时间CXCL-9被干扰素诱导至类似的程度。因此，在一些实施方式中，根据所使用的刺激条件，存在较大的灵活性。这允许从更多位置配送样品，因为更大的距离会落在9小时孵育时间和1小时孵育的范围内。并且，在一些实施方式中，这种灵活性在选择加热元件中是有利的，因为若孵育时间范围更宽，则所使用的加热设备类型的选择范围更大。

图13A和图13B描述了由PHA或IFNα刺激然后在本文所公开的便携设备或可控孵育器中(在各种温度下)孵育时IL2或CXCL9的诱导水平的比较。如图所示，使用便携设备进行孵育与可控孵育器相比，IL2和CXCL9诱导没有显著差异。这再次表明了可用于进行体外刺激血液样品的温度和时间(如上所述)的灵活性水平。

图14描述了由6个温度记录器记录的温度曲线，每个温度记录器加载在6个血液收集管之一中并置于与电池供电的加热源相连的铜箱中。铜箱与两个蓝冰冰袋一起置于如上所述的便携设备中。这些数据表明，即使存在蓝冰，铜箱内的温度也能由于加热源的存在而维持在40℃两个小时。一旦加热源关闭，温度降至2℃并维持直至16小时。不同管之间没有可识别的差异，这表明将样品管置于铜箱中不会影响孵育温度。

本领域的技术人员应当理解，在不背离本发明范围的前提下可对上述设备和方法进行各种省略、增加和变更，所有这些变更和改变都落在由随附的权利要求限定的本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种利用负压力收集血液的非玻璃血液收集管，包括：

非玻璃管；

一种或多种抗凝血剂；

一种或多种白细胞刺激剂；

由负压力活化的可视标记物；以及

密封所述收集管的可穿刺的自密封盖；

其中收集管内的压力与收集管外的压力相比为负。

2.根据权利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述一种或多种白细胞刺激剂选自由下列所组成的组：化学治疗药物、免疫调节剂、疫苗、佐剂、重组蛋白、单克隆抗体、凝血素、致病因子衍生物、过敏原以及它们的组合。

3.根据权利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述一种或多种抗凝血剂包括肝素。

4.根据权利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述管适于在约25℃至约40℃之间的温度孵育至少约1小时。

5.根据权利要求1所述的非玻璃血液收集管，其中所述管适于在低至足以冷冻血液样品的温度下存储，并且其中所述收集管在所述温度下在结构上稳定。

6.一种用于从患者获得血液样品的方法，包括：

检查权利要求1所述的血液收集管是否存在负压力活化的可视标记物；

若存在活化的标记物，则穿刺所述患者的静脉系统的静脉；

穿刺自密封盖；并且

使血液填充收集管直至负压力被补偿或直至收集到所需的体积。