CN104304026B - 一种尾巨桉dh30-1品种的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，通过外植体的建立、外植体消毒、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽等步骤实现，针对初代培养、继代和生根培养选择了专用的培养基组成，合理的炼苗措施使尾巨桉移栽后生长快，成活率高，达到了繁殖系数高，繁殖效果好的目的。同时本发明方法生产成本低廉，得到的组培苗遗传状一致，是桉树组培快繁的有效途径，且适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及桉树栽培技术领域，特别涉及一种尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法。
背景技术
尾巨桉DH30-1品种（E.urophylla×E.Grandis），是广西东门林场，以印度尼西亚种源东门尾叶桉优树U16（Eucalyptusurophylla）作为母本，以澳大利亚种源东门巨桉优树G22（Eucalyptusgrandis）作为父本杂交优势种，后经无性繁殖得到的优良桉树品种，综合表现优良，干形通直、林相整齐、分枝小、无病虫害，年均蓄积量大，经济效益明显，适合大面积范围推广种植。
多年的推广试验证明，6.5年生DH30-1表现最突出，在不同无性系间活立木平均每公顷蓄积的邓肯检验中，平均树高24.65m，平均胸径15.82cm，平均每公顷蓄积达到45m3/hm2以上,经济和生态效益十分显著，因此，将该优良品种在短时间内大量繁殖，获得性状表现一致，稳定遗传，未发生性状分离的后代具有重要意义，桉树为多年生异花授粉的木本植物，种间天然杂交产生杂种的现象频繁，后代严重分离，因此采用有性繁殖手段难以保持优树特性，而无性生殖方法如扦插、压条、嫁接等不利于大量繁殖，组织培养技术培养快速繁殖桉树是较为有效的方法。
组织培养（TissueCulture）是在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织的技术，它具有以下重要意义：（1）促进优良遗传材料的快速繁殖；（2）脱毒良种苗的培养和无病毒苗的大量繁殖；（3）特殊育种材料的快速繁殖；（4）基因工程植株的快速繁殖；（5）离体保存种质的快速繁殖。据统计，目前已有60余种桉树组织培养获得成功，从上世纪60年代Susses首先报道了赤桉实生苗外植体获得愈伤组织开始，国内外先后在柠檬桉（1969年）、巨桉（1974年）、美丽花桉（1976年）、白桉（1975年）、杂种桉树（1980年）、灰桉、王桉（1980年）、雷林一桉（1981年）、柳窿F1杂交代（1981年）、赤桉（1992年）进行了相关组织培养技术的研究。
同时，对于桉树的组织培养方面的研究也有许多：
1、名称：尾巨桉的立体培养和快速繁殖；作者：刘奕清、王大平、熊运海；园艺学报第32卷；摘要：论述了尾巨桉T13号的组培快繁方法。于生长季节采集尾巨桉T13号的半木质化嫩枝，去除叶片，剪成单芽茎段，用自来水冲洗15min，0.5%洗衣粉溶液浸泡15min，再用自来水冲洗干净。将材料分别放入无菌塑料空杯中，每杯放15-20个，75%酒精浸泡30s，0.1%升汞消毒10-12min，最后用无菌水冲洗3-5次，接种到诱导培养基中。诱导腋芽萌发和增殖继代的基本培养基为改良MS（硝酸铵减为1/3，简称EU），生根的基本培养基为1/2MS，附加不同浓度的BA、IBA、NAA、活性炭（AC），蔗糖3%，琼脂5.0g./L，pH6.0。诱导培养利用室内自然散射光（不开灯），增殖继代、壮苗生根培养，光照12h/d，光强1500-2000lu，温度26±3℃，环境湿度405-70%。结果与分析：EU+BA0.5+NAA0.2诱导愈伤组织最佳，增殖效果最好。该研究使用传统的蔗糖作为碳源，培养基成本相对较高，且蔗糖的营养成分单一，不能更为全面的为细胞分裂提供营养物质，在一定程度上影响培养效果。另外，培养基中没有添加提高抗逆性和抑制杂菌污染的成分，组培苗的成活率会受到影响。
2、名称：桉树组织培养快繁技术；作者：林莹燕；广西职业技术学院毕业论文（设计），摘要：比较详细的论述了桉树从初代培养的取样、材料的灭菌、接种、培养和培养基的配方（MS+BA0.5+IBA0.2）；继代中的接种方法、培养基（MS+BA1.0+KT0.5+IBA0.1-0.5）和培养条件；生根培养中的培养基的配方（1/2MS+ABT1.5+IBA0.1+活性炭0.25%）、接种方法和培养和条件；育苗中的炼苗、基质的准备、移栽和育苗过程中各种管理措施等。同样，该研究的培养基中没有添加提高抗逆性和抑制杂菌污染的成分，组培苗的成活率会受到影响。
3、授权公告号为CN103155872B的专利：一种尾巨桉胚状体诱导育苗方法，它以尾巨桉无菌苗茎段为外植体，经胚性愈伤组织诱导、胚状体诱导及胚状体萌发可以得到完整的再生植株；采用本发明的方法可得到经胚状体发生途径再生植株，结果稳定，重复性良好，能应用与生产上大规模商品化育苗，为尾巨桉育种奠定了基础。上述专利采用尾巨桉无菌苗茎段为外植体来诱导胚性愈伤组织，后经体细胞胚胎发生再生途径得到再生植株，操作较为复杂，实施难度大，同时使用尾巨桉无菌苗茎段为外植体，母本的优良特性有待考究，单纯采用该技术商品化育苗并不能有效遗传亲本优良特性。
可见，目前虽然对于桉树组织培养技术研究较多，但有目的性的针对优树的优良性状进行扩繁，同时能有效推广应用的组培快繁方法还有很多工作需要摸索，由于DH30-1为多年生尾巨桉品种，市场组培苗较少，资源紧俏，而对于该品种的组织培养工作并未有效开展，对尾巨桉DH30-1新品种进行组织培养研究，对于该优良品种的快速繁殖，满足市场供应，提高该优良品种的生态效益和经济效益具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是针对以上不足，提供一种操作难度低、繁殖系数高、防治周期短、能稳定遗传且成活率高的尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，
本发明的技术方案如下：
尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，具体步骤如下：
①外植体的建立：经选育出的DH30-1品种，种植成试验林，于2月份，选择4-5年的树龄，生长健壮、树干粗大、无病虫害的优树，从离地面20-25公分处伐倒，一个月后，树桩开始长出萌芽条，等2周后芽条长约10公分、半木质化、芽眼还没萌动，将芽条采回作为外植体材料。为减少材料污染源，采取芽条时，应选择连续三天以上晴好天气后进行。将采回的芽条去除大部分叶片后，用自来水冲洗15min，0.5%洗衣粉溶液浸泡15min，再用自来水冲洗干净。
②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4-5次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒9min，无菌水冲洗4-5次，切取萌芽条顶芽下来第二节起1-2节的带芽茎段，长1-2cm。
③初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成分为：MS+IAA0.4mg/L+6-BA1.4mg/L+4%糖蜜，培养基pH5.9；光照强度1000Lux，培养温度25±2℃，培养时间35±2天。
④继代培养：初代培养至节处长出丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+0.18%氨基寡糖素+8%糖蜜；培养温度25±2℃，光照时间16h/d，培养基pH5.8-6.0；培养20天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每20天如此继代一次，扩繁试管苗。
⑤生根培养：待步骤④扩繁的试管苗取出，转入生根培养，生根培养基成分为：1/3MS+IBA0.5mg/L+ABT0.2mg/L+0.8%氨基寡糖素+15%糖蜜；光照强度为3000Lux，培养温度25±2℃，培养至25天，根长至2cm,苗长高3cm时出瓶。
继代培养基和生根培养基中氨基寡糖素的主要作用为：（1）激发丛芽组织产生酚类化合物、木质素及病程相关蛋白，提高丛芽抗逆能力；（2）活化植物细胞，促进植物生长，调节植物抗性基因的表达，使用氨基寡糖素作为继代培养基和生根培养基，在所述剂量下不会对外植体的培养产生抑制作用，在培养过程中，不易受到杂菌污染，发明人经过多次验证证明氨基寡糖素在本发明继代培养基和生根培养基中起着重要作用，是其重要组成部分。
而在三种培养基中添加糖蜜（糖厂蔗糖生产分离出来的不结晶的含糖液体）也有重要作用：（1）作为组织快繁培养基的碳源，替代蔗糖，降低生产成本；（2）含有大量植物更易于利用的各种单糖、粗蛋白质和矿物质，较蔗糖营养更为全面。
其它的培养基化合物可以从化学词典或农作物栽培的教科书检索到其名称和作用，本发明采用这些化合物进行组合对尾巨桉DH30-1品种最为适合，特别是加上富含营养成分的糖蜜，是经过很多筛选才最后确定的。
⑥炼苗：选择健壮、半木质化的试管苗出瓶移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度85-90%，光照10000lux。
⑦移栽；炼苗15天后移到露天培养，当育苗盘中苗木高度为15-20cm时，移栽造林。
尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，还包括组培苗移栽后的管理，具体为：移栽前，将组培苗在定根水中浸泡1-2h；施足基肥，及时追肥，并及时防治病虫害。
所述定根水组成为：3%甲霜灵+3%恶霉灵+0.05%吲哚丁酸+0.05%萘乙酸钠+0.5%聚丙烯酸钠+纯净水余量。
所述防治病虫害为：在苗期防治立枯病、枯萎病；在生长期防治灰霉病、叶斑病、落叶病；使用饵剂防治白蚁、蛴螬、地老虎；在生长期使用热雾剂防治桉树毛虫、尺蠖。
本发明的有益效果为；
一、保持了DH30-1的优良性状：速生丰产、轮伐期短(工业纤维材)；干形通直、分枝小、林相整齐；材质好，纹理直，耐瘠薄，适合大面积区域种植。
二、本发明的桉树组培快繁方法操作难度低、生产成本低，易于在大范围内推广使用。在大规模组织培养过程中，培养基使用糖蜜作为重要成分，替代了蔗糖，直接降低了培养基的成本；同时，培养基中氨基寡糖素在培养基中的适量使用有效抑制了杂菌侵染，减少组培风险，是较为成熟可靠安全的组培快繁方法。
三、利用本发明桉树组培快繁方法生产的组培苗成活率高，DH30-1组培苗成活率在95%以上，同时适合在广西大部分地区种植推广，直接提高了经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，意识本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。
实施例1
尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，具体步骤如下：
①外植体的建立：经选育出的DH30-1品种，种植成试验林，于2月份，选择4-5年的树龄，生长健壮、树干粗大、无病虫害的优树，从离地面20-25公分处伐倒，一个月后，树桩开始长出萌芽条，等2周后芽条长约10公分、半木质化、芽眼还没萌动时，将芽条采回作为外植体材料。为减少材料污染源，采取芽条时，应选择连续三天以上晴好天气后进行。将采回的芽条去除大部分叶片后，用自来水冲洗15min，0.5%洗衣粉溶液浸泡15min，再用自来水冲洗干净。
②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗5次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒9min，无菌水冲洗4次，切取萌芽条顶芽下来第二节起1-2节的带芽茎段，长1-2cm。
③初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成分为：MS+IAA0.4mg/L+6-BA1.4mg/L+4%糖蜜，培养基pH5.9；光照强度1000Lux，培养温度25±2℃，培养时间35±2天。
④继代培养：初代培养至节处长出丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+0.18%氨基寡糖素+8%糖蜜；培养温度25±2℃，光照时间16h/d，培养基pH5.8-6.0；培养20天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每20天如此继代一次，扩繁试管苗。
⑤生根培养：待步骤④扩繁的试管苗取出，转入生根培养，生根培养基成分为：1/3MS+IBA0.5mg/L+ABT0.2mg/L+0.8%氨基寡糖素+15%糖蜜；光照强度为3000Lux，培养温度25±2℃，培养至25天，根长至2cm,苗长高3cm时出瓶。
⑥炼苗：选择健壮、半木质化的试管苗出瓶移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度85-90%，光照10000lux。
⑦移栽；炼苗15天后移到露天培养，当育苗盘中苗木高度为15-20cm时，移栽造林。
实施例2
尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，具体步骤如下：
①外植体的建立：经选育出的DH30-1品种，种植成试验林，于2月份，选择4-5年的树龄，生长健壮、树干粗大、无病虫害的优树，从离地面20-25公分处伐倒，一个月后，树桩开始长出萌芽条，等2周后芽条长约10公分、半木质化、芽眼还没萌动时，将芽条采回作为外植体材料。为减少材料污染源，采取芽条时，应选择连续三天以上晴好天气后进行。将采回的芽条去除大部分叶片后，用自来水冲洗15min，0.5%洗衣粉溶液浸泡15min，再用自来水冲洗干净。
②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒9min，无菌水冲洗5次，切取萌芽条顶芽下来第二节起1-2节的带芽茎段，长1-2cm。
③初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成分为：MS+IAA0.4mg/L+6-BA1.4mg/L+4%糖蜜，培养基pH5.9；光照强度1000Lux，培养温度25±2℃，培养时间35±2天。
④继代培养：初代培养至节处长出丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+0.18%氨基寡糖素+8%糖蜜；培养温度25±2℃，光照时间16h/d，培养基pH5.8-6.0；培养20天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每20天如此继代一次，扩繁试管苗。
⑤生根培养：待步骤④扩繁的试管苗取出，转入生根培养，生根培养基成分为：1/3MS+IBA0.5mg/L+ABT0.2mg/L+0.8%氨基寡糖素+15%糖蜜；光照强度为3000Lux，培养温度25±2℃，培养至25天，根长至2cm,苗长高3cm时出瓶。
⑥炼苗：选择健壮、半木质化的试管苗出瓶移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度85-90%，光照10000lux。
⑦移栽；炼苗15天后移到露天培养，当育苗盘中苗木高度为15-20cm时，移栽造林。
⑧移栽后的管理：移栽前，将组培苗在定根水中浸泡1-2h，定根水组成为：3%甲霜灵+3%恶霉灵+0.05%吲哚丁酸+0.05%萘乙酸钠+0.5%聚丙烯酸钠+纯净水余量；每棵组培苗使用8kg优质腐熟农家肥，外加1.5kgNPK15:15:15复合肥；在移栽后3个月、6个月各追肥1次，每次追肥使用尿素1.2kg/棵，以后每年追肥一次，每次使用2.5kg尿素/棵，并及时防治病虫害。
在DH30-1生长过程中防治病虫害及使用药剂如下：苗期立枯病和枯萎病仅有零星发生，对发生病害的组培苗使用定根水稀释800倍后，每棵组培苗灌药水500-800克；灰霉病使用巴斯夫药剂50%啶酰菌胺水分散粒剂稀释5000倍喷雾；叶斑病和落叶病使用巴斯夫的25%吡唑醚菌酯乳油，稀释8000倍均匀喷雾，除能有效预防病害发生意外，还具有明显促进桉树生长作用；使用0.5%氟虫腈饵剂防治地下害虫蛴螬地老虎和白蚁，使用方法为将饵剂均匀撒在组培苗周围，每棵使用饵剂20克-30克；在3-5年龄期桉树爆发尺蠖和毛虫时，使用广西田园生化股份有限公司生产的1.8%阿维·氯氰热雾剂防治，节省工时，提高工效，保证了桉树的丰产。
以下为本发明方法得到的尾巨桉DH30-1组培苗试验结果：
可以看出，本发明尾巨桉DH30-1品种组培快繁方法，繁殖系数高，生根率达99%以上，成活率在95%以上，组培苗移栽后能迅速适应露天环境，生长迅速，抗外界不良环境能力强，已种植推广2000亩，创造了较大的经济效益、生态效益和社会效益。
Claims (2)
1.一种尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，其特征在于：步骤如下：
①外植体的建立：选择4-5年树龄，生长健壮、树干粗大、无病虫害的优树，从离地面20-25cm处伐倒，待树桩萌芽长至10cm、半木质化、芽眼还未萌动时，将芽条采回作为外植体材料；为减少材料污染源，采取芽条时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回的芽条去除大部分叶片后，用自来水冲洗15min，0.5%洗衣粉溶液浸泡15min，再用自来水冲洗干净；
②外植体消毒：步骤①得到的外植体用75％的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4-5次，沥干水，然后置于0.1％的升汞溶液中消毒9min，无菌水冲洗4-5次，切取萌芽条顶芽下来第二节起1-2节的带芽茎段，长1-2cm；
③初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成分为：MS+IAA0.4mg/L+6-BA1.4mg/L+4%糖蜜，培养基pH5.9；光照强度1000Lux，培养温度25±2℃，培养时间35±2天；
④继代培养：初代培养至节处长出丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+0.18%氨基寡糖素+8%糖蜜；培养温度25±2℃，光照时间16h/d，培养基pH5.8-6.0；培养20天，形成2cm长的具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每20天如此继代一次，扩繁试管苗；
⑤生根培养：待步骤④扩繁的试管苗取出，转入生根培养，生根培养基成分为：1/3MS+IBA0.5mg/L+ABT0.2mg/L+0.8%氨基寡糖素+15%糖蜜；光照强度为3000Lux，培养温度25±2℃，培养至25天，根长至2cm,苗长高3cm时出瓶；
⑥炼苗：选择健壮、半木质化的试管苗出瓶移栽在泥炭土：椰糠配比为1:3的营养基质中，保持空气湿度85-90%，光照10000lux；
⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养，当育苗盘中苗木高度为15-20cm时，移栽造林；所述的尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，还包括组培苗移栽后的管理，具体为：移栽前，将组培苗在定根水中浸泡1-2h；施足基肥，及时追肥，并及时防治病虫害；所述定根水组成为：3%甲霜灵+3%恶霉灵+0.05%吲哚丁酸+0.05%萘乙酸钠+0.5%聚丙烯酸钠+纯净水余量。
2.根据权利要求1所述的尾巨桉DH30-1品种的组培快繁方法，其特征在于：所述防治病虫害为：在苗期防治立枯病、枯萎病；在生长期防治灰霉病、叶斑病、落叶病；使用饵剂防治白蚁、蛴螬、地老虎；在生长期使用热雾剂防治桉树毛虫、尺蠖。
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| ‘T13’号桉树再生体系的建立;刘奕清;《中国种业》;20061231(第4期);第31-32页，尤其是第1节和第2.1-2.5节 * |
| Efficient Regeneration of Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis from Stem Segment;Lejun Ouyang et al.;《Braz. Arch. Biol. Technol.》;20120630;第55卷(第3期);第329-334页 * |
| 尾巨桉胚培养与快速繁殖研究(简报);韦大器等;《亚热带植物科学》;20081231;第37卷(第4期);第 785~791页，尤其是摘要 * |
| 新型分裂素PBU对尾巨桉胚性愈伤组织诱导及植株再生的影响;欧阳乐军等;《植物生理学报》;20111231;第47卷(第8期);第785-791页，尤其是摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104304026A (zh) | 2015-01-28 |
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