CN104297327B

CN104297327B - 一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法

Info

Publication number: CN104297327B
Application number: CN201410590606.5A
Authority: CN
Inventors: 邓杏飞
Original assignee: Guangdong Guosheng Medical Polytron Technologies Inc
Current assignee: Guangdong Guosheng Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2014-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-10-29
Also published as: CN104297327A

Abstract

本发明公开了一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，其包括以下步骤：a、选择电泳芯片；b、抽取血清或者血浆样品；c、样品稀释及染料预染；d、将10µL电泳凝胶介质加入至电泳芯片的缓冲池内，用1mL针筒空气加压至电泳芯片的样品链接和分离管道；e、电泳芯片的样品池加入10 µL稀释及预染的血清或者血浆样品；f、将加样后的电泳芯片放在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片自动电泳；g、计算机对微流控芯片检测仪所得到的结果进行自动处理分析。通过上述工艺步骤设计，本发明能够简便、快速且自动化地完成高密度脂蛋白亚型和低密度脂蛋白亚型分离作业，进而有助于更加准确评估心血管疾病诊断和指导治疗。

Description

一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法。

背景技术

微流芯片技术，通常称为芯片上实验室，是指在芯片上很小的体积内能进行迅速复杂生物样品分析。一个芯片上实验室系统通常整合自动化和数字化定量和定性多种生物化学分析于一个容易使用的仪器工作平台之内。结合有机合成和生物化学技术，微流芯片仪器现开始集成电子，光学和物理测量与微流体特征一起组成新的基于芯片功能的技术系统。微流芯片技术的优点包括快速，敏感，准确，节省试剂，可自动化和容易操作等。微流芯片技术发展正促使超敏感临床医学快速分子诊断的形成和应用。

大量研究一致认为异常油脂新陈代谢对冠状动脉病（冠心病）的发病原理有重要作用，例如过高的低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TG)血清水平以及低的高密度脂蛋白（HDL) 血清水平，都预示有高的心血管疾病发病风险；尽管这些脂蛋白在冠心病发病中的重要性，但在个体之中，影向心血管事件和冠心病程度有很大的不同，例如，尽管总高密度脂蛋白和总低密度脂蛋白水平都正常，患者仍然发作心脏病。实际上，超过一半冠心病突发病人（譬如心肌梗塞）或者不稳定的心胶痛病人，他们的总胆固醇（总低密度脂蛋白和总高密度脂蛋白）都在正常范围，这说明仅测量总胆固醇（总低密度脂蛋白总高密度脂蛋白）并不能准确估计心血管疾病的风险。

这些可变性也许一部分可归结于这些脂蛋白的高度功能复杂性和非均匀性。血清脂蛋白主要有三个亚型（classes)：高密度脂蛋白（HDL)、LDL（低密度脂蛋白)以及VLDL（非常低密度脂蛋白)，而每个脂蛋白亚型，通过适当的分离手段，可以进一步分成它的亚组分（sub-fractions)，这些脂蛋白亚型的主要不同在于它们的微粒直径、密度以及油脂构成；因而，每个脂蛋白亚型可能致动脉粥样硬化程度亦不同，例如高密度脂蛋白被认为是好的胆固醇，它通过在血管壁逆转运胆固醇，抑制炎症和抗生物氧化反应起保护心脏作用，但是HDL 包含几种亚组分，即颗粒较大和轻的HDL2以及颗粒较小的HDL3；累积证据显示颗粒较大的HDL2 提供主要的防护作用，颗粒小的 HDL3 具体功能依然不完全明了，但有资料显示过高的HDL3可能对心血管疾病有害；同样的，LDL（低密度脂蛋白) 在超速离心处理和梯度胶凝电泳法中可辨认出至少有五种颗粒亚组分和至少有二种LDL 表现型：表现型A，主要由大而轻的 LDL颗粒组成（颗粒大于25.5 nm)；表现型B，为小而密集的LDL微粒（颗粒小于25.5 nm) 组成；但只有 LDL 表现型B与增加心血管疾病发病率密切相关。

因此，对脂蛋白亚组分进行精细分析并进一步分离高密度脂蛋白（HDL) 和低密度脂蛋白（LDL) 能提供更可靠和准确的心血管疾病的预测、诊断以及治疗。

分离血脂蛋白亚类作为心血管疾病的研究已进行几十年，几种常用方法包括密度梯度高速离心分析法（Analytical and Density Gradient Ultracentrifugation，ADGUC)、梯度胶凝电泳分析法（Gradient Gel Electrophoresis， GGE)、管胶凝体电泳法（Tube Gel Electrophoresis， TGE)、核磁共振光谱分析法（核磁共振)、高性能液相色谱分析法（HPLC)以及垂直自动分离法（Vertical Auto Profile， VAP)。

梯度胶凝电泳分析法（GGE) 已被临床实验室应用于分离HDL亚型和LDL 亚型近三十年；根据GGE分析，HDL 至少可被分成5个亚型，即HDL2a 、HDL2b 和HDL3a， HDL3b 和HDL3c，其中，HDL2b 是最大的HDL亚型。据信HDL2b水平与患者的临床后果有密切相关，但其它HDL亚型的临床意义仍是未知的。

同样的，LDL（低密度脂蛋白) 也可以用GGE方法定亚型，至少有二种LDL 表现型：表现型A，主要由大而轻的LDL颗粒组成（颗粒大于25.5 nm) ；表现型B，为小而密集的LDL微粒（颗粒小于25.5 nm) 组成， LDL 表现型B与增加心血管疾病发病率密切相关。

GGE 分离脂蛋白亚型根据脂蛋白微粒的大小，分辨力比较高，但样品分析很费时且不能自动化；对于分析样品时间，一个周期通常需要大约一个星期，这种时间长和费力的过程限制了它在临床诊断实验室的应用。其它方法譬如核磁共振、密度梯度超速离心处理、垂直自动分离法（VAP)以及管胶凝体电泳法，由于设备昂贵，技术上挑战性或费力费时，难以自动化操作和结果数码化的本质都难以被广泛接受应用在临床实验室。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，本方法能够简便、快速且自动化地完成高密度脂蛋白亚型和低密度脂蛋白亚型分离作业，进而有助于更加准确评估心血管疾病诊断和指导治疗。

提供一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，包括有以下步骤：

a、设计一种电泳芯片：电泳芯片设置有十字形微管道，十字形微管道包括有横向微管道以及与横向微管道交错布置的纵向微管道，横向微管道包括有位于纵纵向微管道左端侧的左横向微管道以及位于纵向微管道右端侧的右横向微管道，纵向微管道的前端延伸至横向微管道的前端侧，左横向微管道、右横向微管道的末端分别设置有朝后延伸且与纵向微管道平行布置的平行段，各平行段的末端分别设置有至少两条分支微管道，各分支微管道的末端以及纵向微管道的前端分别设置有样品池，左横向微管道、右横向微管道的中部分别设置有朝后延伸的支向微管道，各支向微管道的末端分别设置有缓冲池，纵向微管道的后端设置有废液池，在废液池的前部纵向微管道上设置有检测点；连通样品池和废液池之间的微管道构成进样通道；连通缓冲池和废液池之间的微管道构成分离通道；

b、抽取血清或者血浆样品；

c、样品稀释及染料预染：取5 µL血浆或者血清样品，用凝胶电泳缓冲液进行1：50倍稀释且预染5分钟，凝胶电泳缓冲液由250 mmol/L的缓冲液与5µmol/L的脂蛋白染料组成；

d、将10µL电泳凝胶介质通过电泳芯片的分离通道加入缓冲池内，用1mL针筒空气加压至电泳芯片的进样通道和分离通道，电泳凝胶介质由200 mmol/L的缓冲液、浓度为0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0% 或者10%的多聚体凝胶体、0.15 µmol/L的脂蛋白染料组成；

e、通过电泳芯片的进样通道对样品池加入10 µL稀释及预染的血清或者血浆样品；

f、将加样后的电泳芯片放在微流控芯片检测仪上进行微流控芯片自动电泳；

g、计算机对微流控芯片检测仪所得到的结果进行自动处理分析。

在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法中，所述凝胶电泳缓冲液以及所述电泳凝胶介质中的缓冲液为TE缓冲液或者N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸，且缓冲液的PH值可在下列数值中选择：7.0、7.5、8.0 或者8.5。

在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法中，所述脂蛋白染料为下列中的一种：苏丹黑B、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青，4-氯苯盐或者 C6-NBD神经酰胺。

在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法中，所述多聚体凝胶体为下列中的一种：聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚N，N-二甲基丙烯酰胺或者羟基纤维素。

在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法中，所述微管道的横截面呈方形，其深度可在下列范围内选择：8～35μm ,宽度可在下列范围内选择：50～150μm。

本发明提供的方法，步骤简单，速度快，能够简便、快速且自动化地完成高密度脂蛋白亚型和低密度脂蛋白亚型分离作业，进而有助于更加准确评估心血管疾病诊断和指导治疗。

附图说明

图1是本发明方法中电泳芯片的构造图。

具体实施方式

参照图1所示：

设计一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，包括有以下步骤：

a、设计一种电泳芯片：电泳芯片设置有十字形微管道，十字形微管道包括有横向微管道5以及与横向微管道5交错布置的纵向微管道9，横向微管道5包括有位于纵纵向微管道9左端侧的左横向微管道8以及位于纵向微管道9右端侧的右横向微管道7，纵向微管道9的前端延伸至横向微管道5的前端侧，左横向微管道8、右横向微管道7的末端分别设置有朝后延伸且与纵向微管道9平行布置的平行段10、11，各平行段的末端分别设置至少两条分支微管道12、13，各分支微管道的末端以及纵向微管道9的前端分别设置有样品池1，左横向微管道8、右横向微管道7的中部分别设置有朝后延伸的支向微管道14，各支向微管道14的末端分别设置有缓冲池2，纵向微管道9的后端设置有废液池3，在废液池3的前部纵向微管道9上设置有检测点4；连通样品池1和废液池3之间的微管道构成进样通道；连通缓冲池2和废液池3之间的微管道构成分离通道；为提高分离效果，可将分离通道的形状设置成S形，相当于延长了分离通道的长度。

b、抽取血清或者血浆样品；

在上述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法中，所述凝胶电泳缓冲液以及所述电泳凝胶介质中的缓冲液为TE缓冲液或者N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸，且缓冲液的PH值可在下列数值中选择：7.0、7.5、8.0、8.5。

Claims

1.一种采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，其特征在于，包括有以下步骤：

a、设计一种电泳芯片：电泳芯片设置有十字形微管道，十字形微管道包括有横向微管道以及与横向微管道交错布置的纵向微管道，横向微管道包括有位于纵向微管道左端侧的左横向微管道以及位于纵向微管道右端侧的右横向微管道，纵向微管道的前端延伸至横向微管道的前端侧，左横向微管道、右横向微管道的末端分别设置有朝后延伸且与纵向微管道平行布置的平行段，各平行段的末端分别设置有至少两条分支微管道，各分支微管道的末端以及纵向微管道的前端分别设置有样品池，左横向微管道、右横向微管道的中部分别设置有朝后延伸的支向微管道，各支向微管道的末端分别设置有缓冲池，纵向微管道的后端设置有废液池，在废液池的前部纵向微管道上设置有检测点；连通样品池和废液池之间的微管道构成进样通道；连通缓冲池和废液池之间的微管道构成分离通道；

b、抽取血清或者血浆样品；

c、样品稀释及染料预染：取5 µL血浆或者血清样品，用凝胶电泳缓冲液进行1：50倍稀释且预染5分钟，凝胶电泳缓冲液由250 mmol/L的TE缓冲液或者N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸与5µmol/L的脂蛋白染料组成；

d、将10µL电泳凝胶介质通过电泳芯片的分离通道加入缓冲池内，用1mL针筒空气加压至电泳芯片的进样通道和分离通道，电泳凝胶介质由200 mmol/L的TE缓冲液、浓度为0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0% 或者10%的聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧化乙烯、聚N，N-二甲基丙烯酰胺或者羟基纤维素中的一种和0.15 µmol/L的脂蛋白染料组成；

2.根据权利要求1所述的采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，其特征在于：缓冲液的PH值可在下列数值中选择：7.0、7.5、8.0 或者8.5。

3.根据权利要求2所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，其特征在于：所述脂蛋白染料为下列中的一种：苏丹黑B、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青，4-氯苯盐或者C6-NBD神经酰胺。

4. 根据权利要求1所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，其特征在于：所述微管道的横截面呈方形，其深度可在下列范围内选择：8～35μm ,宽度可在下列范围内选择：50～150μm 。

5.根据权利要求4所述采用微流控芯片分析血清脂蛋白亚型精细亚组分的方法，其特征在于：所述分离通道的形状设置成S形结构。