CN104293886A - 一种用荧光sybr方法检测黄斑变性基因位点的试剂盒 - Google Patents

一种用荧光sybr方法检测黄斑变性基因位点的试剂盒 Download PDF

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张华忠
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明公开了一种用荧光SYBR方法检测黄斑变性基因位点的试剂盒。包括同时检测CFH基因上rs1061170号SNP位点、ARMS2基因上rs10490924号SNP位点、C3基因上rs2230199号SNP位点、SKIV2L基因上rs429608号SNP位点、TIMP3基因上rs9621532号SNP位点的特异性引物对及SYBRGreenⅠ荧光染料、用于实时定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与黄斑变性相关的CFH、ARMS2、C3、SKIV2L和TIMP3基因上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体发生黄斑变性风险性。

Description

一种用荧光SYBR方法检测黄斑变性基因位点的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测黄斑变性基因位点的试剂盒，通过同时检测与黄斑变性密切相关的基因CFH、ARMS2、C3、SKIV2L和TIMP3上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体发生黄斑变性风险性。
背景技术
黄斑变性是与年龄相关的视网膜脉络膜中心区域（黄斑区）的光感受器—视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）-Bruch膜—脉络膜毛细血管复合体的进展性病变，可导致中心视力的丧失。
黄斑变性通常发生于50岁以上人群，部分患者侵及双眼，是美国和其他发达国家老年人群中的首位致盲原因，在全世界范围内大约有5千万患者，其发生率随着人口的老化迅速上升。在美国，75岁以上人群中大约有6~8%患有能导致严重视力损害的晚期黄斑病变。在中国，北京地区调查结果显示75岁以上人群黄斑变性患病率早期和晚期分别为2.99%和0.90%。国人黄斑变性患病率虽然远低于欧美国家，但由于中国人口结构的老龄化趋势，其造成的危害依然不能忽视。
目前，研究者们从分子遗传学研究黄斑变性，已定位出五个与黄斑变性密切相关的基因，它们分别是CFH基因、ARMS2基因、C3基因、SKIV2L基因和TIMP3基因。
补体是由存在于人或脊椎动物血清与组织液中的一组可溶性蛋白以及存在于白细胞与其他细胞表面的一组膜结合蛋白和补体受体所组成的。在机体免疫系统中担负抗感染和免疫调节作用，并参与免疫病理反应。补体主要通过经典途径、旁路途径以及凝集素途径等三种方式被激活后发挥免疫防御功能，三条激活途径均可产生C3转化酶，促使C3活化为C3a和C3b，进而导致膜攻击复合体C5 b-9生成，使细胞溶解从而发挥免疫学作用。
CFH是补体旁路激活途径的调节因子，定位于染色体1q32。它由20个短共有重复区域（short consensus repeats，SCRs）组成，每个SCR由大约60个氨基酸组成，形成球状结构。CFH能够选择性阻断C3活化为C3b，并可以降解C3b，从而调控补体通路的激活过程。经研究指出CFH对炎症反应的控制作用对某些老年人的眼睛来说是必不可少的。
位于染色体10q26的ARMS2是第二个被发现与黄斑变性发病机理相关的位点，在视网膜和胎盘均有表达。ARMS2是假定的人类基因，编码一个假定的蛋白，含107个氨基酸，除了9个已知的磷酸化位点以外，其功能未知。改变灵长类特有ARMS2的编码序列，等位基因T的突变使69号氨基酸由丙氨酸变为丝氨酸，在哺乳动物细胞表达时产生一种线粒体蛋白。相关的线粒体功能紊乱可导致能量代谢和动态平衡的破坏，产生反应性氧化物，线粒体DNA的体细胞突变产物堆积，凋亡通路被激活。黄斑变性患者视网膜的线粒体数目和体积减少，线粒体ARMS2蛋白出现A69S替代，导致功能改变使黄斑区光感受器的年龄相关性变性的易感姓增加。Kanda等通过翻译了人类视网膜的ARMS2cDNA克隆，表明ARMS2编码真实的蛋白。
SKIV2L基因编码的DEAD box蛋白被认为在参与胚胎，精子，细胞生长和分裂的过程中起到重要作用。
TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白，是MMPs活性的特异性抑制因子。现已发现4种，分别命名为：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP-3的分子量为28kD，可以促进非转化细胞的增殖及转化表现的表达。TIMP-3可抑制MMP-1、MMP-2、MMP-9和MMP-13的活性。
在TIMPs家族中，TIMP-3与其他成员不同，可以与ECM紧密结合，这种结合需借助于TIMP-3的C末端功能区。TIMP-3的C末端如果在156位、166位、167位、168位氨基酸发生点突变，或是在第4内含子与第5外显子之间插入异常碱基，可以造成Sorsby黄斑变性，一种常染色体遗传性视觉障碍疾病，此病的一个重要特征是脉络膜新血管生成的作用。      
发明内容
基于CFH、ARMS2、C3、SKIV2L和TIMP3基因上的5个SNP位点多态性可用来评估叶酸代谢遗传能力的基础，本发明提供一种检测个体叶酸代谢障碍的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测CFH基因上rs1061170号SNP多态性基因型的特异性引物对；
检测ARMS2基因上rs10490924号SNP多态性基因型的特异性引物对；
检测C3基因上rs2230199号SNP多态性基因型的特异性引物对；
检测SKIV2L基因上rs429608号SNP多态性基因型的特异性引物对；
检测TIMP3基因上rs9621532号SNP多态性基因型的特异性引物对；
    实时定量PCR反应组件（包括ddH2O、Buffer、MgCl2溶液、dNTPs、Taq酶、SYBR染料等）
    本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对CFH基因上rs1061170号SNP位点、ARMS2基因上rs10490924号SNP位点、C3基因上rs2230199号SNP位点、SKIV2L基因上rs429608号SNP位点、TIMP3基因上rs9621532号SNP位点而设计，能使用SYBR Green荧光PCR技术特异性检测出这五个SNP位点基因型的引物对。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的，并可用常规的引物合成技术进行合成。
优选的，检测CFH基因上rs1061170号SNP多态性基因型的特异性引物对为：
有义引物1-1：                     AAATGGATATAATCAAAGTC（SEQ ID NO:1）
有义引物1-2：                     AAATGGATATAATCAAAGTT（SEQ ID NO:2）
反义引物1：                     AGATTTACCCTGTACAAACT（SEQ ID NO:3）
优选的，检测ARMS2基因上rs10490924号SNP多态性基因型的特异性引物对为：
有义引物2-1：                ACACTCCATGATCCCAGCAG（SEQ ID NO:4）
有义引物2-2：                     ACACTCCATGATCCCAGCAT（SEQ ID NO:5）
反义引物2：                    TGGTAAGCAGAGCTCAGTGT（SEQ ID NO:6）
优选的，检测C3基因上rs2230199号SNP多态性基因型的特异性引物对为：
有义引物3-1：              GTTCAAGTCAGAAAAGGGTC（SEQ ID NO:7）
有义引物3-2：              GTTCAAGTCAGAAAAGGGTG（SEQ ID NO:8）
反义引物3：               GCCTGCACGGTCACGAACTT（SEQ ID NO:9）
优选的，检测SKIV2L基因上rs429608号SNP多态性基因型的特异性引物对为：
有义引物4-1：              GGTGGAGACGAGCCACTTGA（SEQ ID NO:10）
有义引物4-2：              GGTGGAGACGAGCCACTTGG（SEQ ID NO:11）
反义引物4：               GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG（SEQ ID NO:12）
优选的，检测TIMP3基因上rs9621532号SNP多态性基因型的特异性引物对为：
有义引物5-1：              GGTGGAGACGAGCCACTTGA（SEQ ID NO:13）
有义引物5-2：              GGTGGAGACGAGCCACTTGG（SEQ ID NO:14）
反义引物5：               GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG（SEQ ID NO:15）
    本发明试剂盒的组分和含量包括：
    溶液            单份体积     终浓度
    ddH2O          30.2μl
    Buffer            5μl         1×
    MgCl2            4μl         2mM
    dNTPs            4μl         200nM each
    Primer（SP+AP）  1μl+1μl    0.4uM each
    Taq               0.3μl       1.5U in all
    SYBR Green荧光染料  2.5μl       1×
    本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
 
    热循环参数：
    94℃     2min
    94℃     45sec
    60℃     45sec
    72℃     1min
    72℃     7min
40循环
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
 
实施例1. 检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的提取
用真空采血管采集人体外周血，提取血液中的基因组DNA。
步骤2：如果要做N管，在一个1.5ml或更大体积的管子中，一次加入从ddH2O到SYBR每个试剂，体积为：N×单份体积。
在冰上操作，保持试剂的活性。
因为SYBR荧光染料的缘故，要避免中强光照射。
在移液准确的前提下，尽量缩短操作时间，减少非特异扩增。
充分振荡，使成分均匀。
步骤3：在PCR管中加入模板DNA和步骤2已配置完成的混合溶液，振荡，离心。
步骤4：实时定量PCR反应
使用可检测与黄斑变性相关的基因的实时定量PCR检测试剂盒，其中，包含下列引物对：
有义引物1-1：                     AAATGGATATAATCAAAGTC（SEQ ID NO:1）
有义引物1-2：                     AAATGGATATAATCAAAGTT（SEQ ID NO:2）
反义引物1：                     AGATTTACCCTGTACAAACT（SEQ ID NO:3）
有义引物2-1：                ACACTCCATGATCCCAGCAG（SEQ ID NO:4）
有义引物2-2：                     ACACTCCATGATCCCAGCAT（SEQ ID NO:5）
反义引物2：                    TGGTAAGCAGAGCTCAGTGT（SEQ ID NO:6）
有义引物3-1：              GTTCAAGTCAGAAAAGGGTC（SEQ ID NO:7）
有义引物3-2：              GTTCAAGTCAGAAAAGGGTG（SEQ ID NO:8）
反义引物3：               GCCTGCACGGTCACGAACTT（SEQ ID NO:9）
有义引物4-1：              GGTGGAGACGAGCCACTTGA（SEQ ID NO:10）
有义引物4-2：              GGTGGAGACGAGCCACTTGG（SEQ ID NO:11）
反义引物4：               GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG（SEQ ID NO:12）
有义引物5-1：              GGTGGAGACGAGCCACTTGA（SEQ ID NO:13）
有义引物5-2：              GGTGGAGACGAGCCACTTGG（SEQ ID NO:14）
反义引物5：               GCTGGGGAGAAGAGGCCAAG（SEQ ID NO:15）
有义引物1-1、有义引物1-2、反义引物1特异地针对检测CFH基因上rs1061170号SNP位点多态性；
有义引物2-1、有义引物2-2、反义引物2特异地针对检测ARMS2基因上rs10490924号SNP位点多态性；
有义引物3-1、有义引物3-2、反义引物3特异地针对检测C3基因上rs2230199号SNP位点多态性；
有义引物4-1、有义引物4-2、反义引物4特异地针对检测SKIV2L基因上rs429608号SNP位点多态性；
有义引物5-1、有义引物5-2、反义引物5特异地针对检测TIMP3基因上rs9621532号SNP位点多态性；
将反应管放入仪器上进行热学反应，反应过程94℃、2min，94℃、45sec，60℃、45sec，72℃、45sec，40循环。
62℃~92℃缓慢升温，产生熔点曲线（melting curve，或称解离曲线，dissociation curve）。
步骤5：SNP基因型分析
熟悉实时定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识实时定量PCR仪上显示的荧光定量曲线，根据不同序列引物和SYBR荧光染料结合的信号强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
 
实施例2. 对受检者进行黄斑变性基因位点检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师对被检者进行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因组DNA。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检者基因组DNA的CFH基因上rs1061170号SNP位点、ARMS2基因上rs10490924号SNP位点、C3基因上rs2230199号SNP位点、SKIV2L基因上rs429608号SNP位点、TIMP3基因上rs9621532号SNP位点分别进行实时定量PCR检测，确定这五个SNPs位点的基因型。
步骤3：个体罹患黄斑变性风险性的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体发生黄斑变性风险性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者的基因状况，并由医师向被检测者详细说明和解读个体发生黄斑变性风险性的分析报告单。

Claims (3)

1.一种用荧光SYBR方法检测黄斑变性基因位点的试剂盒，其特征在于：包括同时检测CFH基因上rs1061170号SNP位点、ARMS2基因上rs10490924号SNP位点、C3基因上rs2230199号SNP位点、SKIV2L基因上rs429608号SNP位点、TIMP3基因上rs9621532号SNP位点的特异性引物对及SYBR GreenⅠ荧光染料、ddH2O、Buffer、MgCl2溶液、dNTPs、Taq酶。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1、2、3，SEQ ID NO：4、5、6，SEQ ID NO：7、8、9，SEQ ID NO：10、11、12，SEQ ID NO：13、14、15所示序列的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包括30.2μl的ddH2O、5μl的Buffer、浓度1×4μl的MgCl2溶液、浓度200nM each 4μl的 dNTPs、浓度0.4uM each 1μl+1μl的Primer（SP+AP）、浓度1.5U in all 0.3μl的Taq酶、浓度1×2.5μl的SYBR GreenⅠ荧光染料，本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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