CN104293816B - 猪肺炎支原体融合基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物基因工程领域。具体涉及一种人工合成的表达猪肺炎支原体的融合基因及应用。特征是，通过Linker将猪肺炎支原体P97R1基因与P36基因串联，缺失P36基因的终止密码子，在P36基因的C端通过Linker融合去除信号肽的P46基因，获得融合基因P97R1‑P36‑P46，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该融合基因包含在原核表达质质粒中，含有该质粒的大肠杆菌BL21/pET30a‑P97R1‑Linker‑P36‑Linker‑P46，保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M2014269。本发明还公开了该融合基因的免疫效力评价及在新型疫苗中的应用。
Description
技术领域
本发明属于动物传染病技术领域，与动物基因工程有关。具体涉及一种猪肺炎支原体的融合基因，其制备方法与应用。
背景技术
猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)引起的，以猪咳嗽和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病，具有慢性、接触性、高传染性、高发病率和低死亡率的特征。该病广泛分布于世界各地，国外常被称为猪地方流行性肺炎，而在我国常被称为猪气喘病(Maes D,Segales J,MeynsT,et al.Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs.Vet Microbiol,2008,126:297-309)。猪肺炎支原体感染导致猪的生长率下降12％-16％，饲料转化率降低13％-22％，体重相对减少10-25kg，商品猪的出栏时间延迟10-30天(邵国青，刘茂军，靳岷.检测猪肺炎支原体抗体间接ELISA方法的建立.江苏农业学报，2007，23:437-441)，同时还破坏猪的支气管和细支气管纤毛，进而损伤阻挡病原微生物入侵的物理屏障，破坏猪的巨噬细胞，降低机体的免疫清除能力，导致免疫抑制(叶宝宏，杨柳.猪肺炎支原体的免疫学研究现状.榆林学院学报，2009，192.2)。因此，在临床上猪肺炎支原体常常与猪蓝耳病病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌等病原混合感染，增加了当前猪病诊断和预防控制的难度(Ciprian A,Pijoan C,Cruz T,et al.Mycoplasmahyopneumoniae increases the susceptibility of pigs to experimentalPasteurella multocida pneumonia.Can J Vet Res,1988,52:434-438)。此外，由于猪肺炎支原体是缺少细胞壁的原核微生物，对常用的作用于细胞壁的抗生素(如β-内酰胺酶类抗生素等)不敏感，猪群一旦被猪肺炎支原体感染，控制和净化将十分困难。据初步统计,全球每年因猪肺炎支原体感染造成的直接经济损失高达2亿美元。可以说，猪肺炎支原体已成为当前严重影响养猪业经济效益的重大疫病，被喻为影响养猪业经济效益的“隐性杀手”。
目前针对猪肺炎支原体的防控主要采取疫苗免疫，隔离进化猪群，加强卫生环境监控等措施。我国广泛使用的猪肺炎支原体灭活疫苗主要由国外进口：如美国辉瑞制药有限公司研制了“瑞倍适”灭活苗；南京梅里亚动物保健有限公司以Algeldrate为免疫佐剂，制备了具有免疫保护功效的“猪克喘”商品疫苗；美国富道动物保健公司研制了一种以聚乙烯树脂为免疫佐剂的猪肺炎支原体疫苗；德国勃林格殷格翰公司研制了“茵格发”等。由于支原体培养困难，上述商品化疫苗的价格都相当昂贵。1999年全世界仅用于疫苗防治猪支原体肺炎这一项的费用就高达1.1亿英镑，约占1999年全世界在猪疫苗上花费的四分之一(Ross R F.Mycoplasmal Disease,Swine Diease,6th edi Iowa.1986:496-483)。基于此，利用基因工程方法研制出低成本的，安全、高效新型猪肺炎支原体疫苗将成为防制该病的重要方向。
猪肺炎支原体P97基因编码纤毛粘附素，是最早被证实具有粘附作用的粘附因子，其主要的抗原分布在P97的C端，C端存在一段由5个氨基酸(AAKPV/E)组成的串联重复的短肽序列，即Rl区。Minion(Minion F C,Adams C,Hsu T.R1 region of P97 mediatesadherence of Mycoplasma hyopneumoniae to swine cilia.Infect Immun,2000,68:3056-3060)指出P97R1中串联重复的短肽序列(AAKPV/E)必须达到8个以上才具有粘附纤毛细胞的能力。P36是一种细胞溶质蛋白，具有乳酸脱氢酶活性，研究证实在人工和天然感染的猪体内，P36能诱导早期的天然免疫应答(Frey J,Haldimann A,Kobisch M,etal.Immune response against the L-lactate dehydrogenase of Mycoplasmahyopneumoniae in enzootic pneumonia of swine.Microb Pathog,1994,17:313-322)，产生的特异性抗体能在体内维持较长的时间(Strasser M,Frey J,Bestetti G,etal.Cloning and expression of a species-specific early immunogenic 36-kilodalton protein of Mycoplasma hyopneumoniae in Escherichia coli.InfectImmun,1991,59:1217-1222)。P46是猪肺炎支原体的表面抗原蛋白，可引起宿主早期免疫应答反应。Conceicao将P97R1与大肠杆菌肠毒素的B亚基融合后免疫小鼠，发现小鼠的粘膜和系统免疫应答得到了明显激活(Conceicao F R,Moreira A N,Dellagostin O A.Arecombinant chimera composed of R1 repeat region of Mycoplasma hyopneumoniaeP97 adhesin with Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit elicitsimmune response in mice.Vaccine,2006,24:5734-5743)。Fagan将P97NrdF片段插入减毒的沙门氏菌，制备了沙门氏菌活载体疫苗，并在猪体内进行了免疫效果评价，结果发现这一疫苗可以减弱猪肺炎支原体感染引起的肺部损伤，提高感染猪的日增重(Fagan P K,Walker M J,Chin J,et al.Oral immunization of swine with attenuated Salmonellatyphimurium aroA SL3261 expressing a recombinant antigen of Mycoplasmahyopneumoniae(NrdF)primes the immune system for a NrdF specific secretory IgAresponse in the lungs.Microb Pathog,2001,30:101-110)。P97、P36和P46常常作为疫苗设计的首选目标基因，用于猪肺炎支原体基因工程疫苗的开发和研制。因此，我们构建了一种猪肺炎支原体融合基因(P97R1-P36-P46)，并比较了该融合基因与单个基因的免疫原性的差异，以求获得更好的成本更低的基因资源。
发明内容
本发明的一个任务在于克服现有技术的缺限，其目的是将猪肺炎支原体的基因如P97R1、P36和P46基因串联，从而获得一种免疫原性更好的融合基因P97R1-P36-P46。
本发明的另一个目的是评价所获得猪肺炎支原体融合基因P97R1-P36-P46的免疫原性及利用该融合基因研制新型猪肺炎支原体疫苗及应用。
本发明通过以下技术方案实施：
申请人通过基因工程的方法，得到一种人工合成的表达猪肺炎支原体融合基因P97R1-P36-P46，它是通过Linker方法(Linker的碱基序列为：GGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCAGC)将猪肺炎支原体P97R1基因与P36基因串联，并缺失其中P36基因的终止密码子(TAA)，在P36基因的C端通过Linker方法融合去除信号肽的P46基因而获得的。
上述融合基因P97R1-P36-P46的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明的融合基因是通过如下方法构建得到的：将上述的猪肺炎支原体融合基因P97R1-P36-P46插入原核表达载体pET-30a(+)的NcoI与XhoI位点，构建得到重组质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46，并将该重组质粒转化大肠杆菌，得到重组的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46，我们将该重组的大肠杆菌命名为大肠杆菌BL21/pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46，Escherichiacoli BL21/pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46，于2014年6月19日送至中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2014269。
本发明还包括上述P97R1-P36-P46融合基因在制备猪支原体肺炎疫苗中的应用。
进而还包括：保藏号为CCTCC NO：M2014269的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46在制备猪支原体肺炎疫苗中的应用
本发明的有益效果是：
1、获得了一种融合的P97R1-P36-P46基因，该融合基因的免疫原性显著高于单个基因的免疫原性，为研制新型猪肺炎支原体疫苗奠定了基础。
2、融合基因P97R1-P36-P46是成本较低的基因资源，基于P97R1-P36-P46融合基因的亚单位疫苗表达量高，易于纯化和制备。与常规的灭活疫苗和弱毒疫苗相比制备成本显著降低。
本发明更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是本发明人工合成的猪支原体融合基因P97R1-P36-P46的核苷酸序列，序列长度为2426bp。
序列表SEQ ID NO：2是以猪肺炎支原体168株基因组DNA为模板，PCR扩增得到的P97R1基因的核苷酸序列，序列长度为252bp。
序列表SEQ ID NO：3是以猪肺炎支原体168株基因组DNA为模板，PCR扩增得到的P36基因的核苷酸序列，序列长度为945bp。
序列表SEQ ID NO：4是以猪肺炎支原体168株基因组DNA为模板，PCR扩增得到的P46基因的核苷酸序列，序列长度为1146bp。
图1：是本发明的技术流程框图。
图2：是本发明中重组质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46的构建示意图。其中：图2A是总的构建示意图；图2B是质粒A(pET30a-P46)的物理图谱；图2C是质粒B(pET30a-P36-Linker-P46)的物理图谱；图2D是质粒C(pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46)的物理图谱。
图3：是本发明中的重组质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46的原核表达的胶图。图中标记说明：M：蛋白分子量；1：pET30a-p97R1-linker-p36-linker-p46(BL21)37℃IPTG诱导5h；2：pET30a-p97R1-linker-p36-linker-p46(BL21)未诱导；3：pET-30a(+)(BL21)37℃IPTG诱导5h。
图4：是本发明中pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46融合蛋白纯化后的胶图。图中标记说明：M：蛋白分子量；1-9泳道：pET30a-p97R1-linker-p36-linker-p46融合蛋白的纯化
图5：利用本发明制备的重组亚单位疫苗pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46、pET32a-P36、pET32a-P46、pET32a-P97R1以及对照磷酸盐缓冲液(PBS)免疫BALB/c小鼠后血清中的抗体水平的检测。图中标记说明：LP：pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46亚单位疫苗免疫组。
具体实施方式
实施例1：P97R1-P36-P46融合基因的构建
1、引物的设计(见表1所示)
表1 PCR引物
表1中引物序列中下划线部分是对应的酶切位点，P36引物和P46引物中粗体字表示的序列为Linker的核苷酸序列，表1的引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
2、P46、P36和P97R1基因的扩增
以猪肺炎支原体168株基因组DNA(Liu W,Feng Z X,Fang L R,et al.Completegenome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 168.Journal ofBacteriology.2011,193:1016-1017)为模板使用Prime STAR进行P97R1(GenBank登录号ADQ90328.1)、P36(GenBank登录号ADQ90382.1)和P46基因(GenBank登录号ADQ90718.1)进行扩增。
PCR扩增的体系见表2所述：
表2 PCR扩增体系
P97R1基因序列的扩增条件为：94.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：98.0℃10s，59.0℃15s，72.0℃30s，35个循环后72.0℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增得到长252bp的DNA片段(P97R1)(见序列表SEQ ID NO：2所示)。
P36基因序列的扩增条件为：94.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：98.0℃10s，59.0℃15s，72.0℃1min，35个循环后72.0℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增得到长945bp的DNA片段(缺失终止密码子TAA的P36基因)(除该基因的尾巴TAA外，其核苷酸序列与SEQ ID NO：3所示的序列对应)。
扩增得到的P36基因的核苷酸序列如下所示(含有下划线的序列为P36基因的终止密码子)：
ATGAAACCTATTAAAATAGCTCTAATTGGTGCTGGAAATGTCGGAAATTCCTTCCTTTATGCAGCAATGAATCAAGGACTTGCATCCGAGTATGGAATTATTGATATTAATCCTGATTTTGCCGATGGTAATGCTTTTGATTTTGAAGATGCCTCAGCTTCTTTGCCTTTTCCGATTAGTGTCTCCCGTTATGAATATAAAGATCTAAAAGATGCTGATTTTATTGTAATTACAGCGGGAAGACCACAAAAACCGGGTGAAACTCGGCTTGAATTAGTAGCTGATAACATCCGAATTATCCGGGAAATTGCACTAAAAGTCAAAGAAAGTGGCTTTAGTGGAATAAGTATTATTGTTGCTAATCCTGTTGATATAATTACAAGGGCTTACCGGGATGCATCTGGATTTTCCGATCAAAAAGTTATCGGTAGTGGAACTGTTTTAGATACAGCAAGGCTTCAATTTGCAATCGCAAAAAGAGCAAAAGTATCGCCTAATTCGGTTCAGGCCTACGTGATGGGTGAACATGGTGATTCATCTTTTGTTGCTTATTCAAATATTAAAATTGCCGGTGAATGTTTCTGTGCTTATTCTAAACTAACCGGAATTAATAGCTCAAATTACGAAAAAGAACTTGAATATCCAGTTTCTCGCCGGGCTTATGAAATTATTAATCGTAAAAGGGCAACATTTTATGGAATTGGTGCAGCTATTGCCAAAATAGTTTCTAATATTATCAAAGATACAAAAAATATTATGATTGCCGGAGCAAATTTACGAGGAGAATACGGATTTCACGGAGTAAATATCGGAGTTCCAGTTGTTTTAGGGGCAAACGGAATTGAAAAAATTATTGAGATTAGTCTTAATGATAAAGAAAAAGAAAAATTTGCCAAATCAGTTGCAATCATTGATAAAATTTATCAGGATGCAATTAAAAATATTTAA；
P46基因序列的扩增条件为：95.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：98.0℃10s，59.0℃15s，72.0℃1.5min，35个循环后72.0℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增得到长1146bp的DNA片段(缺失信号肽：ATGAAAAAAATGCTTAGAAAAAAATTTTTGTATTCATCAGCTATTTATGCAACTTCGCTTGCATCAATTATTGCATT TGTTGCAGCAGGTTGTGGACAGACAGAATCAGGTTCG的P46基因)(除该基因的前面114bp信号肽序列外，其核苷酸序列与SEQ ID NO：4所示的序列对应)。
扩增得到的P46基因的核苷酸序列如下所示(含有下划线的序列为P46的信号肽区域)：
ATGAAAAAAATGCTTAGAAAAAAATTTTTGTATTCATCAGCTATTTATGCAACTTCGCTTGCATCAATTATTGCATT TGTTGCAGCAGGTTGTGGACAGACAGAATCAGGTTCGACTTCTGATTCTAAACCACAAGCCGAGACTCTAAAACATAAAGTAAGTAATGATTCTATTCGAATAGCACTAACCGATCCGGATAATCCTCGATGAATTAGTGCCCAAAAAGATATTATTTCTTATGTTGATGAAACAGAGGCAGCAACTTCAACAATTACAAAAAACCAGGATGCACAAAATAACTGACTCACTCAGCAAGCTAATTTAAGTCCAGCACCAAAAGGATTTATTATTGCCCCTGAAAATGGAAGTGGAGTTGGAACTGCTGTTAATACAATTGCTGATAAAGGAATTCCGATTGTTGCCTATGATCGACTAATTACTGGATCTGATAAATATGATTGGTATGTTTCTTTTGATAATGAAAAAGTTGGCGAATTACAAGGTCTTTCACTTGCTGCGGGTCTATTAGGAAAAGAAGATGGTGCTTTTGATTCAATTGATCAAATGAATGAATATCTAAAATCACATATGCCCCAAGAGACAATTTCTTTTTATACAATCGCGGGTTCCCAAGATGATAATAATTCCCAATATTTTTATAATGGTGCAATGAAAGTACTTAAAGAATTAATGAAAAATTCGGAAAATAAAATAATTGATTTATCTCCTGATGGCGAAAATGCTGTTTATGTCCCAGGATGAAATTATGGAACTGCTGGTCAAAGAATCCAATCTTTTCTAACAATTAATAAAGATCCAGCAGGTGGTAATAAAATCAAAGCTGTTGGTTCAAAACCAGCTTCTATTTTCAAAGGATTTCTTGCCCCAAATGATGGAATGGCCGAACAAGCAATCACCAAATTAAAACTTGAAGGATTTGATACCCAAAAAATCTTTGTAACCGGTCAAGATTATAATGATAAAGCCAAAACTTTTATCAAAGACGGCGATCAAAATATGACAATTTATAAACCTGATAAAGTTTTAGGAAAAGTTGCTGTTGAAGTTCTTCGGGTTTTAATTGCAAAGAAAAATAAAGCATCTAGATCAGAAGTCGAAAACGAACTAAAAGCAAAGCTACCAAATATTTCATTTAAATATGATAATCAAACATATAAAGTACAAGGTAAAAATATTAATACAATTTTAGTAAGTCCAGTAATTGTTACAAAAGCTAATGTTGATAATCCTGATGCCTAA
3、重组质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46的构建
利用引物P46-F、P46-R对P46基因进行PCR扩增，获得缺失P46 N端信号肽的P46基因，回收该基因片段并用Not I和Xho I双酶切后，插入到pET-30a(+)(Novagen，德国)的NotI和Xho I位点之间，获得重组质粒pET30a-P46。进一步利用P36-F、P36-R引物扩增P36基因(去除终止密码子)，将获得的PCR产物用Not I和Sal I双酶切后，与经过Not I和SalI酶切的pET30a-P46质粒连接，获得重组质粒pET30a-P36-Linker-P46。利用P97-F、P97-R引物扩增P97基因的R1区域，将获得的PCR产物用Nco I和Sal I双酶切后，与经过Nco I和Sal I酶切的pET30a-P36-Linker-P46质粒连接，获得P97R1-P36-P46融合基因和表达该融合基因的原核表达质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46。经酶切与测序鉴定证实重组质粒构建正确。重组质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46结构图如图2所示。
4、重组质粒pET32a-P97R1、pET32a-P36、pET32a-P46的构建(用于对比试验中与单个基因的免疫效果对比)
以猪肺炎支原体168株基因组DNA(Liu W,Feng Z X,Fang L R,et al.Completegenome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 168.Journal ofBacteriology.2011,193:1016-1017)为模版，用引物P1和P2 PCR扩增得到P46的DNA片段，用引物P3和P4扩增得到P36的DNA片段，用引物P5和P6扩增得到P97R1的DNA片段。PCR扩增体系参照表2，P97R1基因序列的扩增条件为：94.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：98.0℃10s，52.0℃15s，72.0℃30s，35个循环后72.0℃延伸10min；P36基因序列的扩增条件为：94.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：98.0℃10s，52.0℃15s，72.0℃1min，35个循环后72.0℃延伸10min；P46基因序列的扩增条件为：94.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：98.0℃10s，52.0℃15s，72.0℃1.5min，35个循环后72.0℃延伸10min。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，纯化回收目的片段，纯化的扩增产物经BamH I、Xho I双酶切后，分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)(Novagen，德国)的相应位点(BamH I和Xho I)，获得分别表达P46、P36和P97R1基因的重组质粒pET32a-P46、pET32a-P36、pET32a-P97R1，经酶切与PCR鉴定证实质粒构建正确，测序证实无碱基误配。
实施例2：重组质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46的原核表达
1、质粒的转化
将含有猪肺炎支原体P97R1-P36-P46融合基因的表达质粒pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46(卡那抗性)转化大肠杆菌BL21感受态细胞。
具体操作如下：
1)取100μL大肠杆菌BL21感受态细胞悬液转移到无菌的1.5ml EP管中，加入3μL连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min。
2)将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒。
3)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。
4)每管加400μL LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育45min，使细菌复苏。为达到有效转化，复苏时转速不宜超过225转/分。
5)取100μL转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂平皿上，用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均匀地涂布到琼脂平板表面。
6)将平皿置37℃培养，直至液体被吸收，然后倒置平皿培养，12～16h可出现菌落。
2、原核表达
挑取单菌落扩大培养，使用质粒小量提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取其质粒进行酶切鉴定并保存菌液。鉴定正确后，将保存的菌液按照1：1000的体积比进行复苏。次日，按照1：100的体积比进行诱导。在终浓度为0.8mM IPTG、37℃和180r/min的条件下进行诱导。分别在诱导前和诱导后3h、4h、5h和6h取样1mL，并以转化pET-30a载体的E.coli BL21(DE3)的细菌诱导产物作为空白对照。12000r/min离心1min后，加入100μLddH2O重悬菌液后，加入25μL 5×Loading Buffer，在100℃的沸水中煮沸10min，冰浴10min后，通过12％SDS-PAGE进行样品分析，确定重组的原核蛋白是否表达。在进行SDS-PAGE检测时，上样前，将所有的样品10000r/min离心1min，抽取位于样品液面上层的样品上样。另外，以P46的单抗作为抗体进行Western Blotting分析，验证重组蛋白是否表达。在确定原核重组蛋白可以稳定表达后，再次诱导100mL重组菌，通过高压破碎仪破碎后，12000r/min离心10min，将上清和沉淀分别煮样，进行12％SDS-PAGE检测，确定重组蛋白的表达形式，pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46以可溶性形式表达在上清中。试验结果如图3所示。
实施例3：pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46融合蛋白的纯化
以可溶性形式表达的pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46融合蛋白用AKTAFPLC(Amersham Biosciences UPC-900)进行纯化，纯化步骤如下：
(1)将诱导5h后的菌液200mL，12000r/min离心1min，弃掉上清，将沉淀用BindingBuffer(1/10)重悬，置于-80℃冰箱，反复冻融三次后，用超高压波破碎仪将其破碎至清亮，12000r/min离心30min，取上清，将上清用0.22μm滤膜过滤，置于冰上备用。
(2)打开分析仪，再打开电脑，选择UNICORNS.1.0，选default，点击OK。
(3)选择System control，将A，B两个探头放入20％无水乙醇中，依次打开：Manual→Pump→Pump Wash→A：ON，B：ON→Execute；Flow→Flow Rate 1.0mL/min，开始吸泵，直到系统自动清洗结束后为止。
(4)在无水乙醇流动的状态下，将蛋白纯化柱装入指定位置，继续流动无水乙醇清洗纯化柱，约30mL。
(5)Pause→蒸馏水清洗清洗探头(A，B泵)后，将A泵放入Binding Buffer中，B泵放入Elution Buffer中→Continue。Gradient 0.0％不需要调节。
(6)约60mL以后，待红、蓝线平行后，Pause，清洗A泵，放入样品中，Continue，0.5mL/min，上样完成后，Pause，清洗A泵，放入Binding Buffer中，Continue，直到红线下降到最低为止，再流10mL，开始洗脱，Flow rate 1.0mL/min。
(7)从10％开始，可使用不同的洗脱浓度进行洗脱，每更换一次不同的洗脱浓度，必须是红、蓝线保持平行时才能更换，最终为100％，每个洗脱浓度的峰值处全部收集样品。
(8)Pause，清洗A，B泵，都放入无水乙醇中，Continue，直到红、蓝线均降至最低切平行为止,End。拆下纯化柱，关闭所有操作窗口，关掉分析仪和计算机。
(9)利用分光光度计测定纯化蛋白的浓度，并通过SDS-PAGE检测其纯度，用磷酸盐缓冲液(PBS pH7.4)将其稀释到0.4μg/μL，即可用于动物注射。试验结果如图4所示。
实施例4：本发明的亚单位疫苗和对照疫苗对小鼠免疫效力的生物学实验
1、BALB/c小鼠的免疫程序
50只5-6周龄雌性BALB/c小鼠分为5组，分别为PBS对照组、pET32a-P36、pET32a-P46、pET32a-P97R1和pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46免疫组，每组5只，采用后腿肌肉注射，按照表3所示进行免疫，共免疫2次，首免21d后进行二免。于首次免疫后2、3、5、6周经尾静脉负压采血，分离血清，检测血清中抗体水平。
表3：猪肺炎支原体重组亚单位疫苗的小鼠实验分组
2、小鼠血清中抗体水平
利用猪肺炎支原体168株全菌蛋白包被酶标板(4μg/mL)，检测首次免疫后第2、3、5、6周血清中抗体水平，结果表明pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46免疫组在首免后第3周即可产生较高水平的特异性抗体。加强免疫后，除磷酸盐缓冲液(PBS，配方：称取8gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，溶于800mL ddH2O中，调pH至7.2，定容至1000mL，高压蒸气灭菌，室温保存备用)组外，其它免疫组抗体水平都呈显著上升趋势，pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46免疫组产生的特异性抗体上升迅速，达到较高水平，与单基因免疫组相比差异极显著(P<0.01,t-test)，试验结果如图5所示。
Claims (4)
1.一种人工合成的表达猪肺炎支原体的融合基因P97R1-P36-P46，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.包含猪肺炎支原体融合基因的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：M2014269，所述的猪肺炎支原体融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。
3.权利要求1所述的猪肺炎支原体融合基因P97R1-P36-P46在制备猪支原体肺炎疫苗中的应用。
4.权利要求2所述的保藏号为CCTCC NO：M2014269的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET30a-P97R1-Linker-P36-Linker-P46在制备猪支原体肺炎疫苗中的应用。
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| CN201410527845.6A CN104293816B (zh) | 2014-07-04 | 2014-10-09 | 猪肺炎支原体融合基因及应用 |
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| Evaluation of immune response to recombinant potential protective antigens of Mycoplasma hyopneumoniae delivered as cocktail DNA and/or recombinant protein vaccines in mice;Austen Y. Chen等;《Vaccine》;20080620;第26卷;第4372–4378页 * |
| immunisation of mice with Mycoplasma hyopneumoniae antigens P37, P42, P46 and P95 delivered as recombinant subunit or DNA vaccines;V.Galli等;《Vaccine》;20121105;第31卷;第135-140页 * |
| 猪肺炎支原体主要抗原蛋白的研究进展;张悦等;《中国农学通报》;20130120;第29卷(第2期);第16-22页 * |
| 猪肺炎支原体的免疫原蛋白及疫苗的研究进展;崔娟娟等;《家畜生态学报》;20130331;第34卷(第3期);第82-87页 * |
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