CN104292242A - 噻吩嘧啶类化合物和制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种噻吩嘧啶类化合物和制剂及其制备方法和应用，属于化学药物及其制剂技术领域。该噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，是HDAC(组蛋白脱乙酰酶)/PI3K(磷酸肌醇3-激酶)双靶点抑制剂，通过选择性抑制具有协同作用的肿瘤细胞信使核心蛋白激酶靶点PI3K和表观遗传靶点HDAC，破坏肿瘤细胞信使网络，从而对各种肿瘤细胞发挥强大的杀灭作用。该抑制剂在多种血液和实体异种移植肿瘤动物模型中，能够强力有效抑制肿瘤生长，尤其在各种血液B-细胞恶性肿瘤中效果显著，且安全评价实验显示具有良好安全性。可用于淋巴瘤，骨髓瘤和淋巴性白血病晚期复发等或耐药病人的有效治疗。

Description

噻吩嘧啶类化合物和制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学药物及其制剂技术领域，特别是涉及一种具有组蛋白脱乙酰酶和磷酸肌醇3-激酶抑制作用的噻吩嘧啶类化合物和制剂及其制备方法和应用。

背景技术

血液肿瘤发生率很高，仅美国每年就约有149,990新发血液肿瘤病人。其中：非霍奇金淋巴瘤42.8％，霍奇金淋巴瘤6.0％和骨髓瘤12.8％(Leukemia andLymphoma Society 2014)。中国抗癌协会的统计数据显示，我国每年新发淋巴瘤患者约8.4万人，死亡人数超过4.7万人，并以每年5％的速度上升。此外，我国每年新发骨髓瘤病人约为1-1.5万例和急慢性淋巴细胞性白血病约2万多例。目前，淋巴瘤﹑骨髓瘤和淋巴性白血病晚期复发或耐药病人缺少有效药物。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)是肿瘤细胞生存重要的靶点，HDAC抑制剂通过表观遗传调控机制，对肿瘤细胞信使多靶点产生抑制作用。PI3K抑制剂和HDAC抑制剂有显著抗癌效果，已经得到临床验证(参见下述文献：Liu P等Nat Rev Drug Discov 2009；8:627-644；Engelman JA等NatRev Cancer 2009；9:550-562；Stimson L等Annals of Oncology 2009；20:1293–1302；及Zain J等Invest New Drugs.2010；28Suppl 1:S58-78)。

几种已知的磷酸肌醇3-激酶和组蛋白脱乙酰酶抑制剂，包括2006年获美国FDA批准以商品名Zolinza上市的SAHA和GDC-0941等，但是其抗肿瘤活性较低。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种噻吩嘧啶类化合物和制剂及其制备方法和应用，可用于淋巴瘤，骨髓瘤和淋巴性白血病晚期复发或耐药病人的有效治疗。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种式I所示的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，

在其中一个实施例中，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐，硫酸盐，甲磺酸盐，酒石酸盐和钠盐。

在上述的其中一个实施例中，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。

在其中一个实施例中，所述药学上可接受的盐中，式I所示的噻吩嘧啶类化合物与酸或碱的摩尔比为1：X，其中：X＝1-3。

在上述的其中一个实施例中，X＝3。

本发明还公开一种上述的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，按照以下步骤合成：

(1)将3-氨基-2-噻吩羧酸甲酯(101)与氰酸盐反应后碱化生成噻吩嘧啶二酮中间体(102)；

(2)噻吩嘧啶二酮中间体(102)在氯化剂的作用下反应置换二酮为二氯化合物(103)；

(3)二氯化合物(103)与吗啉反应得到吗啉取代的噻吩嘧啶化合物(104)；

(4)噻吩嘧啶化合物(104)首先用有机锂试剂与噻吩的碳-2位质子交换，随后与N,N-二甲基甲酰胺反应生成醛类化合物(105)；

(5)醛类化合物(105)在还原胺化条件下反应得到甲胺类化合物(106)；

(6)甲胺类化合物(106)中的胺在碱性条件下取代2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯(301)中的氯生成中间体一化合物(107)；

(7)中间体一化合物(107)与6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐(204)耦合生成中间体二化合物(108)；

(8)中间体二化合物(108)与羟胺反应得到式I所示化合物(1)；反应路线如下：

其中：6‐甲胺基吡啶‐3‐硼酸盐酸盐(204)通过以下方法制备：

(A)将2,5‐二溴吡啶(201)与甲胺反应得到5‐溴‐2‐甲胺基吡啶(202)；该甲胺可用甲胺甲醇溶液或甲胺水溶液等，优选30％的甲胺甲醇溶液；

(B)5‐溴‐2‐甲胺基吡啶(202)中的氮用保护基保护得到氮被保护的中间体三化合物(203)；

(C)中间体三化合物(203)的溴先转化成硼酸酯，再水解后得到6‐甲胺基吡啶‐3‐硼酸盐酸盐(204)；

反应路线如下：

本发明的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，是一种可用于公斤级合成的可产业化合成方法，能适用于生产，具有操作简易，工艺稳定，产率及化合物纯度高等特点。

在其中的一个实施例中，步骤(1)中，所述氰酸盐为氰酸钾或氰酸钠；

步骤(2)中，所述氯化剂为三氯氧磷，五氯化磷，或氯化亚砜；

步骤(4)中，所述有机锂试剂为正丁基锂或二异丙基氨基锂；

步骤(8)中，所述羟胺为游离羟胺或盐酸羟胺；

步骤(B)中，所述保护基为叔丁基氧羰基；

步骤(C)中，所述中间体三化合物(203)与硼酸三异丙酯反应，将中间体三化合物(203)中的溴转化为硼酸酯。

在其中的一个实施例中，步骤(7)中，中间体一化合物(107)与6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐(204)反应时，还加入钯催化剂，所述钯催化剂为醋酸钯。

在其中的一个实施例中，步骤(8)中，中间体二化合物(108)与羟胺反应结束后，将反应体系的pH调至10.6-11.0，对得到的式I所示化合物(1)进行纯化。

在其中的一个实施例中，步骤(6)中，甲胺类化合物(106)反应生成中间体一化合物(107)的反应条件为：在20-30℃下以乙腈为溶剂，加入的碱为二异丙基乙胺，该二异丙基乙胺的加入量为反应所需理论量的5-8倍。

本发明还公开了权利要求1所述的噻吩嘧啶类化合物的药学上可接受的盐的制备方法，按照上述的制备方法得到I所示的噻吩嘧啶类化合物后，通过下述方法制备得到该噻吩嘧啶类化合物的药学上可接受的盐：

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与盐酸甲醇溶液反应生成其盐酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与硫酸甲醇溶液反应生成其硫酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与甲硫酸二氯甲烷溶液反应生成其甲硫酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与酒石酸的甲醇溶液反应生成其酒石酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与氢氧化钠水溶液反应生成其钠盐。反应路线如下：

本发明还公开了一种上述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述肿瘤包括结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌和恶性血液肿瘤。

在其中一个实施例中，所述恶性血液肿瘤包括急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病和淋巴瘤。

本发明还公开一种药物组合物，包括作为活性成份的上述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

在其中一个实施例中，该药物组合物的剂型为注射用冻干粉；所述药学上可接受的载体包括骨架形成剂和增溶剂。动物体内药代动力学研究表明，本发明的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐若作为口服给药，细胞的通透性较低和外排率较高，肠道吸收少，口服生物利用度低，此外，体外局部刺激性试验表明无刺激性、过敏性和溶血性等问题。因此，给药途径优先考虑静脉注射给药。而本发明的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在溶液中不稳定，为了保障疗效，优先考虑制成注射用冻干粉。

本发明的注射用冻干粉，以骨架形成剂和增溶剂配合主药(噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐)使用，在溶解过程中，骨架形成剂形成均匀细密的骨架结构，主药在增溶剂的作用下增大溶解度，并进入骨架形成剂所形成的骨架中，具有较好的复溶性和稳定性。

在其中一个实施例中，所述骨架形成剂为甘露醇，所述增溶剂为泊洛沙姆188。

在其中一个实施例中，所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐：骨架形成剂：增溶剂的重量比为25:300-700:11-15。

在其中一个实施例中，所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐：骨架形成剂：增溶剂的重量比为25:500-700:12-14。

本发明还公开了一种上述的注射用冻干粉的制备方法，包括以下步骤：

药液配制：称取处方量骨架形成剂，加入注射用水中搅拌溶解；再加入处方量的增溶剂搅拌溶解；随后在搅拌状态下加入所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，使其完全溶解；

活性炭吸附：加入活性炭搅拌吸附杂质后，除去活性炭；

冷冻干燥：将除去活性炭后得到的药液灌装，进行冷冻干燥，即得。

在其中一个实施例中，所述药液配制步骤中，加入的注射用水：所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐的重量比为5000-7000:25。

在其中一个实施例中，所述活性炭吸附步骤中，活性炭的加入量为药液重量百分比的0.05-0.10％，并且搅拌时间为15-30min。

在其中一个实施例中，所述活性炭吸附步骤中，以0.45μm滤膜初滤，再经0.22μm滤膜精滤除去活性炭。

在其中一个实施例中，所述由药液配制步骤开始至将药液开始进行冷冻干燥的时间不超过8小时。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，是全新化学结构的HDAC(组蛋白脱乙酰酶)/PI3K(磷酸肌醇3-激酶)双靶点抑制剂，通过选择性抑制具有协同作用的肿瘤细胞信使核心蛋白激酶靶点PI3K和表观遗传靶点HDAC，破坏肿瘤细胞信使网络，从而对各种肿瘤细胞发挥强大的杀灭作用，对几十种肿瘤细胞的杀灭作用均在pmol至低nmol水平，远远超出其它许多靶向抗癌药物。该抑制剂在多种血液和实体异种移植肿瘤动物模型中，能够强力有效抑制肿瘤生长，尤其在各种血液B-细胞恶性肿瘤效果显著，且安全评价实验显示具有良好安全性。可用于淋巴瘤，骨髓瘤和淋巴性白血病晚期复发或耐药病人的有效治疗。

本发明的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，以3-氨基-2-噻吩羧酸甲酯为原料，通过公斤级的合成方法制得式I的化合物或其药学上可接受的盐，该方法能够实现工业化生产，为临床广泛应用该噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐奠定了物质基础。特别是在以下几点做出了改进：

1)在所有反应的后处理中，反应体系简单，无需使用柱层析法分离即可达到纯化要求。具有简化操作，满足公斤级生产要求的特点。

2)开发了合适的条件，用还原胺化一步方法，将醛类化合物(105)反应生成甲胺类化合物(106)，取代了原来的先从醛类化合物(105)还原成醇，再将醇转化为溴，最后将溴转化成甲胺类化合物(106)的三步反应，简化了反应的过程；

3)减少不必要的过量试剂，既节约试剂且便于反应处理，如可在甲胺类化合物(106)生成中间体一化合物(107)的反应中，将原来35倍过量的二异丙基乙胺调至6倍过量，所得结果稳定；

4)在从化合物107反应生成108的过程中，对所用的催化剂进行了筛选和优化，用原来方法选用的催化剂双三苯基磷二氯化钯，发现副产物酸(由酯水解而得)的生成量难以控制，反应体系内酸的含量可多达15％左右，这对反应的纯化，收率和稳定性都有影响。经过对催化剂做了筛选，发现用醋酸钯，不仅可使反应顺利进行，并且可有效控制副产物酸的生成量在1％以下。从而使纯度和产率都得以稳定，适于放大生产；

5)在由中间体二化合物(108)转变为化合物1的反应中，发现在反应后处理时，体系的pH对去除副产物酸很重要。当将体系的pH调到10.6至11.0之间，可选择性的使副产物酸溶解而去除，从而使产物中酸的量得到控制。

本发明的药物组合物，当剂型选择为注射用冻干粉时，通过注射给药具有生物利用度高的特点，并且制为冻干粉能够提高制剂稳定性。

特别是选用式I所示的噻吩嘧啶类化合物的盐酸盐(化合物2)与甘露醇和泊洛沙姆188相配合，能够极大的提高制剂的稳定性，为该制剂用于临床的安全性和有效性提供了保障。

本发明的注射用冻干粉的制备方法，通过对工艺的考察和优化，得到稳定可靠的制备方法，适用于工业化生产。

附图说明

图1为实验例1中HDAC酶活性的典型量效关系图；

图2为实验例1中PI3Kα酶的活性和剂量关系曲线图；

图3为实验例1中化合物1对Daudi非霍奇金淋巴瘤移植模型肿瘤生长的抑制情况；

图4为实验例1中化合物1和Idelalisib在Daudi非霍奇金淋巴瘤模型中的抗癌作用情况；

图5为实验例1中化合物1抑制MM1R和OPM2多发性骨髓瘤移植肿瘤生长的情况；其中：A为MM1R多发性骨髓瘤；B为OPM2多发性骨髓瘤；

图6为实验例2中共熔点测定装置示意图；

其中：1、万用表；2、铜线；3、蓝液温度计；4、样品杯；

图7为实验例3中冻干粉制剂的制备工艺流程图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

1、本具体实施方式中所用主要原料如下：

化合物2：自制，执行注册标准。

甘露醇：青岛明月海藻集团有限公司，执行中国药典2010年版二部标准。

泊洛沙姆188：美国巴斯夫，执行F20080022标准。

活性炭：上海活性炭厂有限公司，执行中国药典2010年版二部标准。

注射用水：自制，执行中国药典2010年版二部标准。

2、本具体实施方式中所用主要设备如下：

灌装机：KYF H120，中牧南京实业公司。

冻干机：GZLY-5.5，中牧南京实业公司。

轧盖机：KYG 250，北京速原中天科技有限公司。

浓配罐：DYG-50，南京华星制药设备有限公司。

钛棒：20″(5μm)，南京华星制药设备有限公司。

折叠滤芯：20″(0.45μm)材质：聚醚砜，南京华星制药设备有限公司。

折叠滤芯：20″(0.22μm)材质：聚醚砜，南京华星制药设备有限公司。

脱炭过滤器：20″材质：316L，南京华星制药设备有限公司。

精密过滤器：20″材质：316L，南京华星制药设备有限公司。

除在文献中已知的或在实验室程序中例证的标准方法外，可采用如下列方案中显示的反应制备本发明化合物。因此，下列说明性方案是为说明的目的而不是局限于所列化合物或任何特定的取代基。

其中：中间体化合物204通过以下线路制备：

化合物1的药学上可接受的盐通过以下线路制备：

实施例1

N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲氨基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶--5-甲酰胺(化合物1)的制备。

(1)步骤1-a:5-溴-2-甲胺基吡啶(化合物202)的制备。

将2,5-二溴吡啶(60.0千克，253.3摩尔，1.0当量)溶解在30％甲胺甲醇(389.0千克，1728.8摩尔，6.8当量)溶液中。将该混合物在高压釜内加热到80～90摄氏度并在温度范围下搅拌40小时。之后再向反应液中补加30％甲胺甲醇(248.6千克，1104.5摩尔，4.3当量)，然后将反应液加热到80～90摄氏度延长反应时间48～54小时。用乙酸乙酯(810.0千克)将反应后溶液中的甲醇全部置换。置换后的溶液过滤，用330kg的7％碳酸氢钠溶液和331kg的25％氯化钠溶液洗涤，用四氢呋喃(1068.0千克)置换过滤所得的溶液中的乙酸乙酯，得5-溴-2-甲胺基吡啶的四氢呋喃溶液(329.0千克，收率：93.0％)。

该5-溴-2-甲胺基吡啶的表征数据为：LCMS:187.0[M+1]⁺。¹HNMR:(400MHz,CDCl₃)δ2.88(d,J＝4.8Hz,3H),4.70(br,1H),6.29(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),8.10(d,J＝2.0Hz,1H)。

(2)步骤1-b:6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐(化合物204)的制备。

在室温下，边搅拌边将二碳酸二叔丁酯(77.6千克,355.5摩尔,1.5当量)加入到化合物202(44.1千克,235.8摩尔,1.0当量)和4-二甲氨基吡啶(3.3千克,27.0摩尔,0.11当量)的四氢呋喃(412.9千克)溶液中。反应液在65～72摄氏度下搅拌2～4小时。反应液冷却至0～10摄氏度，然后用2M甲胺四氢呋喃溶液淬灭剩余的二碳酸二叔丁酯，反应液在10～20摄氏度下搅拌1小时。然后加入25％氯化钠溶液(253.0千克)，在20～30摄氏度下搅拌20～30分钟，接着静置分层，将水相分离出来。分离出来的水相再用乙酸乙酯(250.0千克)萃取一次。萃取出来的有机相和前面的有机层合并。然后依次用10％的柠檬酸溶液(261.0千克×3)，7％的碳酸氢钠溶液(262.0千克)和25％的氯化钠溶液(260.0千克)洗涤分层。经过几次洗涤的有机相减压浓缩。在上步浓缩完的产物(化合物203)中加入四氢呋喃(221.0千克)和硼酸三异丙酯(38.4千克，356.8摩尔，1.5当量)。接着将反应液降温至-70～-80摄氏度，然后缓慢滴加2.5M的正丁基锂正己烷溶液(79.0千克，282.1摩尔，1.2当量)。滴加完成后，反应液在-70～-80摄氏度下搅拌1～2小时。反应液缓慢升温至-20～-10摄氏度，然后将水(175千克)缓慢加到反应液中。滴加完之后的反应液在20～30摄氏度下搅拌2～3小时。将甲基叔丁基醚(166.0千克)加入到反应液，在20～30摄氏度下搅拌30分钟，然后静置将有机层分离。控制温度在35摄氏度以下，将35％盐酸溶液缓慢加入分离出的水相，滴加完成后在20～30摄氏度下搅拌2～3小时。之后再延长2～3小时反应时间。将反应液降温至0～5摄氏度并在0～5摄氏度下搅拌2～3小时。离心分离得类白色固体6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐(34.0千克，收率：63.4％)。

该6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐的表征数据为：LCMS:153.1[M+1]⁺。¹HNMR:(400MHz,DMSO-d6/D₂O)δ2.79(s,3H),6.44(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),8.33(s,1H)。

(3)步骤1-c:噻吩骈[3,2-d]嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮(化合物102)的制备。

将3-氨基-2-噻吩羧酸甲酯(化合物101)(18.0千克,114.5摩尔，1.0当量),醋酸(113.6千克，2224.8摩尔，19.4当量)和水(110千克)缓慢加入到氰酸钾(27.31千克，336.5摩尔，2.94当量)的水溶液(59千克)中。混合物在室温下搅拌10～12个小时。湿品用水(27千克)漂洗。将氢氧化钠(23.3千克)在20～40摄氏度下分批缓慢加入到水(146千克)中，搅拌至固体全部溶解。将离心得到的固体加入氢氧化钠的溶液中。混合物在20～30摄氏度下搅拌4～6小时。混合物冷却至10～15摄氏度。用2M盐酸溶液(285千克)调节混合物的pH到6～8。混合物在10～15摄氏度下搅拌1个小时。离心，滤饼用水(33千克)漂洗。真空下在55～60摄氏度烘干。得类白色产品噻吩骈[3,2-d]嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮(17.2千克，收率：89.3％)。

该噻吩骈[3,2-d]嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮的表征数据为：LCMS：169.1[M+1]⁺。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ6.92(d,J＝5.2Hz,1H),8.04(d,J＝5.2Hz,1H),11.14(s,1H),11.51(s,1H)。

(4)步骤1-d:2,4-二氯噻吩骈[3,2-d]嘧啶(化合物103)的制备。

将化合物102(16.7千克，99.41摩尔，1.0当量)和N，N-二甲基苯胺(9.4千克,77.57摩尔，0.78当量)加入无水乙腈(138千克)中。混合物降温至0～10摄氏度，将三氯氧磷(111.2千克，725.4摩尔，7.3当量)在50摄氏度下缓慢加入混合物中。混合物升温至80～85摄氏度，在此温摄氏度下搅拌16～20小时后，继续在80～85摄氏度下搅拌3～4个小时。将混合物降温至20～30摄氏度，然后在40摄氏度以下缓慢加入冰水(441千克)。混合物冷却至0～10摄氏度，在此温度下搅拌1小时。离心，滤饼用冰水漂洗(36千克)。湿品在55～60摄氏度真空条件下烘干，得到类白色产品2,4-二氯噻吩骈[3,2-d]嘧啶(18.2千克，收率：79.6％)。

该2,4-二氯噻吩骈[3,2-d]嘧啶的表征数据为：LCMS(m/z):205.0[M+1]⁺。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.75(d,J＝5.2Hz,1H),8.71(d,J＝5.2Hz,1H)。

(5)步骤1-e:4-(2-氯噻吩骈[3,2-d]嘧啶-4-基吗啉(化合物104)的制备。

将化合物103(16.2千克，79.2摩尔，1.0当量)和吗啉(17.45千克，200.3摩尔，2.53当量)在20～30摄氏度下缓慢加入四氢呋喃(271千克)溶液中。混合物在20～30摄氏度下搅拌3～4小时。将水(284千克)加入混合物中。混合物在45摄氏度下浓缩至182升～273升，降温至15～35摄氏度。离心，滤饼用水(55千克)漂洗。湿品在40～50摄氏度真空条件下烘干，得淡黄色固体产品4-(2-氯噻吩骈[3,2-d]嘧啶-4-基吗啉(21.7千克，收率：104.4％)。

该4-(2-氯噻吩骈[3,2-d]嘧啶-4-基吗啉的表征数据为：LCMS(m/z):256.0[M+1]⁺。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.76(t,J＝5.2Hz,4H),3.92(t,J＝5.2Hz,4H),7.42(d,J＝5.2Hz,1H),8.32(d,J＝5.2Hz,1H)。

(6)步骤1-f:2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-醛(化合物105)的制备。

将化合物104(21.1千克，82.51摩尔，1.0当量)加入到无水四氢呋喃(201千克)中，降温到-80～-70摄氏度。在氮气保护下，将2.5M正丁基锂正己烷溶液(35.7千克，127.5摩尔，1.54当量)在-80～-70摄氏度下缓慢滴加到混合物中。滴完后升温至-65～-60摄氏度搅拌1～2小时。将反应物的温度降至-80～-70摄氏度，将N,N-二甲基甲酰胺(9.5千克，130摩尔，1.57当量)缓慢的滴加至反应物中。反应物在-80～-70摄氏度下搅拌1～2个小时。延长反应时间1～2个小时。样品用0.5M的稀盐酸溶液淬灭。反应无进展。反应物升温至-30～-20摄氏度，将反应物加入0.5M稀盐酸溶液(570千克)中，在0～10摄氏度下搅拌1个小时。离心，滤饼用水(50千克)漂洗。湿品在50～60摄氏度真空条件下烘干，得到黄色固体产品2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-醛(24.5千克，收率：87.9％)。

该2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-醛盐的表征数据为：LCMS(m/z):284.0[M+1]⁺。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.77(t,J＝5.2Hz,4H),3.96(t,J＝5.2Hz,4H),8.30(s,1H),10.21(s,1H)。

(7)步骤1-g:N-(2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6甲基)-甲胺(化合物106)的制备。

将30％的甲胺醇溶液(60.5千克，584.35摩尔，8.0当量)加入到化合物105(20.6千克，72.7摩尔，1当量)的甲醇(115千克)溶液中。该反应混合物在20～30摄氏度下搅拌10～12小时。混合物减压浓缩除水。将甲醇(405千克)和四氢呋喃(185千克)加入到浓缩后的混合物中，然后加入无水硫酸镁(20.6千克)以保证整个反应过程中反应体系是干燥的。分批将硼氢化钠(10千克，264.34摩尔，3.64当量)加入到混合物中，将混合物在20～30摄氏度下搅拌6～7小时。将水(110千克)加入到反应结束的混合物中，在20～30摄氏度下搅拌30分钟。将混合物在真空下减压浓缩。浓缩完后，加入6M的盐酸溶液(222千克)和二氯甲烷(181千克)。反应混合物在20～30摄氏度下搅拌30～40分钟，静置，将有机相分离出。水相用4M的氢氧化钠溶液(316.0千克)调节pH至9～10。混合物在20～30摄氏度下搅拌1～2小时。沉淀出来的固体离心分离，在40～50摄氏度下干燥60小时，得黄色固体状的N-(2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6甲基)-甲胺(29.5千克，收率：90.9％)。

该N-(2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6甲基)-甲胺的表征数据为：LCMS(m/z):299[M+1]⁺。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.32(s,3H),3.74(t,J＝5.2Hz,4H),3.88(t,J＝5.2Hz,4H),3.96(s,2H),7.24(s,1H)。

(8)步骤1-h:2-(甲基((2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物107)的制备。

在20-30摄氏度下，将二异丙基乙胺(41.0千克，317.24摩尔，6.0当量)滴加至化合物106(15.7千克，52.55摩尔，1.0当量)、2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯(10.9千克，58.41摩尔，1.1当量)及乙腈(247千克)的混合物中，滴加完成后在20-30摄氏度搅拌12-14小时。反应液在55摄氏度以下减压浓缩至31升-47升，加入二氯甲烷(413千克)和纯化水(166千克)，搅拌30分钟后分液。有机相用水(84千克)洗涤一遍，分层后将有机相在40摄氏度以下减压浓缩至16升-47升，加入乙酸乙酯(56千克)，继续浓缩至16升-47升，加入正庚烷(61千克)，降温至0-5摄氏度。混合物在0-5摄氏度搅拌1-2小时，离心，所得固体用乙酸乙酯(25千克)淋洗得湿品，该湿产品在40-50摄氏度下真空干燥40小时得到固体产品2-(甲基((2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(22.7千克，收率：80.9％)。

该2-(甲基((2-氯-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯的表征数据为：¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.30(t,J＝7.2Hz,3H),3.25(s,3H),3.71(t,J＝4.4Hz,4H),3.83(t,J＝5Hz,4H),4.29(q,J＝7.2Hz,2H),5.21(s,2H),7.39(s,1H),8.87(s,2H)。

(9)步骤1-i:2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(化合物108)的制备。

向碳酸钾(17.5千克，126.62摩尔，3.0当量)的水(40千克)和1,4-二氧六环(475千克)混合溶液中，加入化合物107(19.1千克，42.55摩尔，1.0当量)、化合物204(16.2千克，85.96摩尔，2.0当量)、醋酸钯(0.148千克，0.66摩尔，0.015当量)和2-双环己基膦-2',6'-二甲氧基联苯(0.380千克，0.86摩尔，0.020当量)，上述反应液用氮气置换两次后在90-95摄氏度下搅拌12-14小时。将反应液降温至50-60摄氏度过滤，滤液加入纯化水(410千克)后，在20-25摄氏度搅拌3-4小时。离心，所得固体用纯化水(38千克)淋洗得到湿品(31.45千克)。将上述湿品悬浮于二氯甲烷(266千克)，加入1M的盐酸(396千克)，反应液在20-30摄氏度搅拌30-40分钟。静止分层，水层用二氯甲烷(233千克)萃取一遍，除去有机层，将水层加入二氯甲烷(445千克)后，用4M的碳酸钾水溶液(93千克)调节pH至7-8。静止分层，除去水层，将有机层用纯化水(94千克)洗涤一遍后，在50摄氏度以下减压浓缩至19升-38升。加入甲基叔丁基醚(95千克)，在50摄氏度以下减压浓缩至19升-38升。加入甲基叔丁基醚(95千克)，在50摄氏度以下减压浓缩至19升-38升。加入甲基叔丁基醚(94千克)，在50摄氏度以下减压浓缩至19升-38升。反复操作至钯残留符合要求(<20ppm)。该湿产品在55-60摄氏度下真空干燥16-20小时得到产品2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯(11.35千克，收率：51.2％)。

该2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)嘧啶-5-羧酸乙酯的表征数据为：¹HNMR:(400MHz,CDCl₃)δ1.38(t,J＝7.2,3H),2.98(d,J＝5.2Hz,3H),3.30(s,3H),3.84(t,J＝4.4Hz,4H),3.97(t,J＝4.4Hz,4H),4.36(q,J＝7.2Hz,2H),5.18(s,2H),6.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.33(s,1H),8.44(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),8.92(s,2H),9.16(d,J＝2.0Hz,1H)。

(10)步骤1-j:N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺(化合物1)的制备。

将盐酸羟胺(38.8千克，558.4摩尔，25.6当量)的甲醇(122.2千克)悬浮液冷却至0-10摄氏度，在此温度下搅拌30分钟，然后在20摄氏度以下，滴加预先制备好的氢氧化钾甲醇溶液(183千克，制备：55.3千克氢氧化钾溶于160千克的甲醇)，滴加完成后在10-20摄氏度下搅拌30-60分钟。过滤上述混合物，所得的滤液直接用于下步的反应。在10-20摄氏度下，将上述滤液加入搅拌着的化合物108(11.35千克，21.8摩尔，1.0当量)在二氯甲烷(150千克)的悬浮液中，该反应液在10-20摄氏度下搅拌2小时，在10-20摄氏度下用冰醋酸(26kg)将反应液的pH值调节至10.55后，加入纯化水(11.6千克)，反应混合物在10-20摄氏度下搅拌8小时。用氢氧化钾的的甲醇溶液(6.3千克，3.0千克氢氧化钾溶于17.0千克的甲醇)调节pH到10.91。该反应混合物在10-20摄氏度再搅拌3小时，将混合物离心，所得固体用甲醇(19千克)淋洗得到湿品(46千克)。将上述所得湿品悬浮于甲醇(216千克)和纯化水(56千克)中，在10-20摄氏度下用冰醋酸将反应液的pH值调节至6.65，反应混合物在此温度下继续搅拌4小时。离心，所得固体用纯化水(40千克)淋洗得到湿品(23.3千克)。该湿产品在40-60摄氏度下真空干燥40小时得类白色的固体产品N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺(化合物1)(9.48千克，收率：83.9％)。

该N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)-N-羟基嘧啶-5-甲酰胺的表征数据为：LCMS:508.3[M+1]⁺.¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.84(d,J＝4.8Hz,3H),3.24(s,3H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.89(t,J＝4.8Hz,4H),5.18(s,2H),6.50(d,J＝8.8Hz,1H),6.81-6.85(m,1H),7.37(s,1H),8.27(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),8.75(s,2H),9.00-9.02(m,2H),11.07(s,1H)。

实施例2

N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲氨基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶--5-甲酰胺盐酸盐(化合物2)的制备。

将化合物1(8.78千克，17.3摩尔，1.0当量)在甲醇(126千克)和二氯甲烷(290千克)的悬浊液降温到0-10摄氏度后，在10摄氏度以下加入盐酸甲醇溶液(2.2M，32千克，86.5摩尔，5.0当量)。加完后搅拌至固体完全溶解，然后过滤将滤液转移至洁净间。搅拌状态下在5-10摄氏度滴加甲基叔丁基醚(140千克)，滴加完成后继续在此温度下搅拌6-8小时。过滤后，将所得的固体用甲基叔丁基醚(44千克)淋洗得到湿产品(11.34kg)，该湿产品在40-50摄氏度下真空干燥20小时后，再在50-60摄氏度下真空干燥30小时得到淡黄色固体N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺盐酸盐(化合物2)(10.04千克，收率：94.1％)。

该N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺盐酸盐的表征数据为：LCMS:508.3[M+1]⁺.¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.01(s,3H),3.25(s,3H),3.79(t,J＝4.4Hz,4H),4.04(t,J＝4.4Hz,4H),5.25(s,2H),7.23(d,J＝9.6Hz,1H),7.74(s,1H),8.70(br,1H),8.79(s,2H),9.02(br,1H),9.90(br,1H),11.30(br,1H)。

实施例3

N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲氨基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶--5-甲酰胺硫酸盐(化合物3)的制备。

将化合物1(200毫克，0.39毫摩尔，1.0当量)在甲醇(12毫升)和二氯甲烷(16毫升)的溶液降温到0-10摄氏度后，在10摄氏度以下加入硫酸甲醇溶液(77毫克，0.79毫摩尔，1毫升甲醇)。反应混合物在室温下搅拌过夜。浓缩除去约10毫升溶剂后缓慢加入20毫升甲基叔丁基醚。此混合物继续在室温搅拌1小时。过滤得固体产品，干燥后得到白色固体N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺硫酸盐(230毫克，收率：97％)。

该N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺硫酸盐的表征数据为：LCMS:508.4[M+1]⁺.¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.02(s,3H),3.25(s,3H),3.38(s,1H),3.77(t,J＝5.2Hz,4H),3.98(t,J＝4.8Hz,4H),5.22(s,2H),7.11(d,J＝9.6Hz,1H),7.47(s,1H),8.64(d,J＝9.6Hz,1H),8.73-8.75(m,3H)。

实施例4

N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲氨基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶--5-甲酰胺甲硫酸盐(化合物4)的制备。

将化合物1(930毫克，1.83毫摩尔，1.0当量)在甲醇(24毫升)和二氯甲烷(32毫升)的混悬液降温到0摄氏度后，在0摄氏度加入甲硫酸二氯甲烷溶液(211毫克，2.20毫摩尔，2.5毫升二氯甲烷)。反应混合物在室温下搅拌3小时可观察到沉淀生成。反应混合物继续在室温搅拌18小时后过滤得固体产品，干燥后得到白色固体N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺甲硫酸盐(600毫克，收率：54％)。

该N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺甲硫酸盐的表征数据为：LCMS:508.4[M+1]⁺。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6) 2.33(s,3H),3.00(s,3H),3.24(s,3H),3.76(t,J＝4.4Hz,4H),3.94(t,J＝4.4Hz,4H),5.21(s,2H),7.07(d,J＝9.2Hz,1H),7.46(s,1H),8.64(d,J＝7.6Hz,1H),8.71(s,1H),8.75(s,2H),11.13(br,1H)。

实施例5

N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲氨基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶--5-甲酰胺酒石酸盐(化合物5)的制备。

将化合物1(200毫克，0.39毫摩尔，1.0当量)溶解在甲醇(12毫升)和二氯甲烷(16毫升)中。在上述溶液中加入酒石酸的甲醇溶液(59毫克，0.39毫摩尔，1.0当量，1毫升甲醇)。反应混合物在室温下搅拌过夜。收集生成的固体，干燥后得到白色固体N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺酒石酸盐(200毫克，收率：81％)。

该N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺酒石酸盐的表征数据为：LCMS:508.3[M+1]⁺.¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.84(d,J＝4.4Hz,3H),3.24(s,3H),3.75(t,J＝5.2Hz,4H),3.89(t,J＝4.8Hz,4H),4.32(s,2H),5.18(s,2H),6.50(d,J＝8.8Hz,1H),6.83-6.84(m,1H),7.37(s,1H),8.28(dd,J＝8.8Hz,2.0Hz,1H),8.75(s,2H),9.01(d,J＝2.0Hz,1H),11.06(br,1H)。

实施例6

N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲氨基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶--5-甲酰胺钠盐(化合物6)的制备。

将化合物1(400毫克，0.789毫摩尔，1.0当量)在四氢呋喃(6.4毫升)的混悬液降温至0摄氏度后，在0摄氏度下在20分钟内完成滴加0.5摩尔的氢氧化钠溶液(1.72毫升，8.868毫摩尔，1.1当量)。反应混合物快速过滤，滤液继续在0摄氏度搅拌30分钟。在此混合物中再加入8毫升四氢呋喃并继续在0摄氏度搅拌2小时。过滤得固体产品，干燥后得到黄色固体N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺钠盐(190毫克，收率：45％)。

该N-羟基-2-(甲基((2-(6-甲胺基吡啶-3-基)-4-吗啉噻吩骈[3,2-d]嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺钠盐的表征数据为：LCMS:508.3[M+1]⁺.¹HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.84(d,J＝4.8Hz,3H),3.16(s,3H),3.74(t,J＝4.8Hz,4H),3.88(t,J＝4.8Hz,4H),5.14(s,2H),6.49(d,J＝8.8Hz,1H),6.81-6.83(m,1H),7.35(s,1H),8.27(dd,J＝8.8Hz,2.4Hz,1H),8.40(br,1H),8.64(s,2H),9.01(d,J＝2.0Hz,1H)。

实施例7

一种注射用冻干粉，封装于西林瓶中，每瓶含有25mg化合物2(实施例2制备得到),600mg甘露醇，13mg泊洛沙姆188。该注射用冻干粉通过以下方法制备得到：

(1)药液配制：称取处方量甘露醇，加入注射用水中搅拌溶解，所述注射用水：化合物2的重量比为6000:25；再加入处方量的泊洛沙姆188搅拌溶解；随后在搅拌状态下加入化合物2，使其完全溶解；搅拌速度以能使加入物料完全混悬为度。

(2)活性炭吸附：按药液重量百分比为0.10％的量加入针用活性炭，搅拌15min，除去活性炭，经0.45μm滤膜初滤，再经0.22μm滤膜精滤。搅拌速度以能使活性炭完全混悬为度。

(3)冷冻干燥：将上述过滤后的药液经检查中间体含量、pH值，并计算每瓶装量后灌装，半加塞，进行冷冻干燥，且由上述药液配制步骤开始至将药液开始进行冷冻干燥的时间不超过8小时。

(4)封装：将冷冻干燥后的样品全压塞，轧盖。

实施例8

一种注射用冻干粉，封装于西林瓶中，每瓶含有25mg化合物2,300mg甘露醇，11mg泊洛沙姆188。该注射用冻干粉通过以下方法制备得到：

(1)药液配制：称取处方量甘露醇，加入注射用水中搅拌溶解，所述注射用水：化合物2的重量比为5000:25；再加入处方量的泊洛沙姆188搅拌溶解；随后在搅拌状态下加入化合物2，使其完全溶解；搅拌速度以能使加入物料完全混悬为度。

(2)活性炭吸附：按药液重量百分比为0.05％的量加入针用活性炭，搅拌30min，除去活性炭，经0.45μm滤膜初滤，再经0.22μm滤膜精滤。搅拌速度以能使活性炭完全混悬为度。

(3)冷冻干燥：将上述过滤后的药液经检查中间体含量、pH值，并计算每瓶装量后灌装，半加塞，进行冷冻干燥，且由上述药液配制步骤开始至将药液开始进行冷冻干燥的时间不超过8小时。

(4)封装：将冷冻干燥后的样品全压塞，轧盖。

实施例9

一种注射用冻干粉，封装于西林瓶中，每瓶含有25mg化合物2,700mg甘露醇，15mg泊洛沙姆188。该注射用冻干粉通过以下方法制备得到：

(1)药液配制：称取处方量甘露醇，加入注射用水中搅拌溶解，所述注射用水：化合物2的重量比为7000:25；再加入处方量的泊洛沙姆188搅拌溶解；随后在搅拌状态下加入化合物2，使其完全溶解；搅拌速度以能使加入物料完全混悬为度。

(2)活性炭吸附：按药液重量百分比为0.10％的量加入针用活性炭，搅拌15min，除去活性炭，经0.45μm滤膜初滤，再经0.22μm滤膜精滤。搅拌速度以能使活性炭完全混悬为度。

(3)冷冻干燥：将上述过滤后的药液经检查中间体含量、pH值，并计算每瓶装量后灌装，半加塞，进行冷冻干燥，且由上述药液配制步骤开始至将药液开始进行冷冻干燥的时间不超过8小时。

(4)封装：将冷冻干燥后的样品全压塞，轧盖。

实验例1生物活性实验

一、对HDAC和PI3K的抑制作用。

1、对HDAC的抑制作用。

使用Biomol Color De Lys方法分析组蛋白脱乙酰基转移酶(HDAC)活性。简单地说，HeLa细胞的核提取物用来测定HDAC酶的活性。HeLa细胞的核提取物中在比色分析人工底物的存在下，加入不同浓度的药物。培养结束时，加入显影剂，使用Wallac Victor II 1420酶标仪，在405nm测定酶的活性。该HDAC酶活性的典型量效关系如图1所示。其中，化合物1对总的HDAC抑制IC₅₀(半数抑制浓度)为9.24nM。本研究中，以HDAC抑制剂Vorinostat(化学名：suberoylanilide hydroxamic acid，即SAHA)用作参照物；该抑制剂Vorinostat 2006年获美国FDA批准以商品名Zolinza上市，用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤，该抑制剂Vorinostat抑制HDAC的IC₅₀为57.55nM。

2、对PI3K的抑制作用。

ADP-Glo发光激酶法测定PI3Kα的活性(Promega Corporation，Madison,WI)。该PI3Kα酶的活性和剂量关系曲线如图2所示。其中，化合物1对PI3Kα的抑制IC₅₀为9.3nM，本研究中，PI3Kα/δ抑制剂GDC-0941(二期临床开发阶段)作为参照物。该PI3Kα/δ抑制剂GDC-0941的IC₅₀为16nM。

二、对肿瘤细胞株的杀伤作用。

采用CellTiter-Glo发光细胞活力试剂盒(Promega,Madison,WI)测定ATP的含量，定量分析化合物1﹑参照物SAHA(HADC抑制剂)和参照物GDC-0941(PI3K抑制剂)对各种肿瘤细胞生长的抑制作用。

实验方法：

肿瘤细胞株购买自美国菌种保藏中心：非小细胞(型)肺癌细胞株包括Calu-6,H358,A549,H292,H460,H2122,H1975,H1993；胰腺癌细胞株包括MiaPaca-2,CFPAC-1,Capan-2,PANC-1和SW1990；乳腺癌细胞株包括Sk-Br3,BT-474,MCF-7,HCC1806,MDA-MB-361,MDA-MB-453,T47D和ZR-75-1；结肠癌细胞株HCT-116,WiDr,SW403,SW620,SW-116和T-84；血液系统肿瘤细胞株包括MOLT4,Daudi,Raji,Pfeiffer,HH,MJ,Hut78,HL60,U937,THP-1,MV-4-11,K562,MEG-01,RPMI8226,OPM-2和ARH-77(1-22)。

将肿瘤细胞种植在96-孔板，每孔5,000到10,000个细胞并加入不同浓度的化合物1﹑参照药物(SAHA,GDC-0941)或两药联合。细胞在0.5％或10％胎牛血清存在下与化合物一起培养72小时。使用Perkin Elmer ATPlite kit(见厂家说明书)测定三磷酸腺苷(ATP)的含量来评估生长抑制。简要来讲，每个孔中加入25μl的哺乳动物细胞裂解液到50μl的无酚红培养基中，裂解细胞和稳定ATP。加入25μl的底物溶液到孔中，随后在TopCount液体闪烁谱仪(PerkinElmer)检测发光。数值用一个百分比表示，以未处理的对照组获得的数值作参照。使用PRISM软件(GraphPad Software,San Diego,CA)，通过S形剂量-反应曲线拟合计算IC50值。

结果如下表1-2所示。

表1化合物1对KRAS突变或原型PI3K实体瘤细胞生长抑制作用

^aKRAS突变细胞株^b PIK3CA突变细胞株c PTEN缺失细胞株。

表2化合物1对血液肿瘤细胞生长抑制作用

^cPTEN缺失细胞株。

由上表结果可以看出，在同类型的肿瘤细胞中，化合物1比SAHA和GDC-0941以及它们联合用药更加有效，这些肿瘤类型包括了非小细胞肺癌，胰腺癌，结肠癌和乳腺癌以及恶性血液肿瘤。化合物1在25个实体瘤细胞株和14个血液肿瘤细胞株的IC₅₀值范围在0.7nM到40nM之间。在这些实验中，HDAC抑制剂SAHA和PI3K抑制剂GDC-904的IC₅₀范围分别为300nM到>20μM和140nM到＞20μM。在实体肿瘤如非小细胞(型)肺癌、胰腺癌和结肠癌中KRAS是一种发生最频繁的突变基因。KRAS突变的癌症对包括表皮生长因子受体或PI3K的抑制剂在内的标准治疗方法有耐药性。重要的是，化合物1对携带KRAS基因突变或野生型PI3K的肿瘤是有效的(见表1)。PI3K抑制剂已经通过临床证实其对淋巴血液癌症的患者是有效的。化合物1对淋巴血液癌细胞株非常有效(见表2)。例如，化合物1在Daudi伯基特淋巴瘤的肿瘤细胞系的IC₅₀值为9nM。伯基特淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的一种类型，与弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)密切相关，转移性极强，典型分布于结外部位如中枢神经系统(CNS)和骨髓，并耐标准疗法。在Daudi细胞的增殖试验中，SAHA和GDC-0941的IC₅₀为＞20μM。远远大于化合物19nM的IC₅₀。

三、在Daudi非霍奇金淋巴瘤移植模型中的抗癌药效学研究。

Daudi细胞株起源于伯基特非霍奇金淋巴瘤。伯基特淋巴瘤是一种高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤。肿瘤模型方法参照(Qian C.et al:Clin Cancer Res2012；18:4104-4113)。Beige/SCID小鼠接种Daudi细胞株和肿瘤生成后，带瘤小鼠随机分成四组，对照组和化合物1的三个不同剂量组(25，50和100mg/kg)。隔日静脉给药。最后一次肿瘤测定值用于计算相对肿瘤增殖率(T/C值)。如果ΔT>0，T/C值计算公式如下：T/C％＝100×ΔT/ΔC。然而在肿瘤缩小发生(ΔT<0)的情况下，公式则是：T/T％＝100×ΔT/T0。据美国国家癌症研究所的标准，T/C％≤42％时，被认为有抗癌活性。当T/C％<10％被认为是一种高度活性。如图3所示，化合物1以25和50mg/kg单独给药时导致肿瘤生长停滞，在100mg/kg时引起肿瘤缩小。25mg/kg组的T/C值为-6.3％，50mg/kg组的T/C值计算为0％。100mg/kg组肿瘤缩小的T/C计算值为-78.4％。化合物1的三个剂量组均没有观察到体重减少或其它副作用。

并将化合物1与PI3K抑制剂Idelalisib(Cal-101)进行比较，该PI3K抑制剂Idelalisib(Cal-101)已经于2014年7月由美国FDA批准，用于复发慢性淋巴细胞白血病、滤泡淋巴瘤和小淋巴细胞性淋巴瘤的治疗。与Idelalisib相比较，在最大耐受量下，静脉给药化合物1和参照物Idelalisib在Daudi非霍奇金淋巴瘤模型中的抗肿瘤作用。给药前肿瘤体积达到363±41mm³。化合物1单独给药，在Daudi皮下肿瘤模型中抑制肿瘤生长，并导致Daudi皮下肿瘤模型的肿瘤缩小，T/C计算为-37.42％。而Idelalisib在这种肿瘤模型没有明显抗癌活性，其T/C值＝64.5％。结果表明，化合物1在Daudi非霍奇金淋巴瘤的抗癌作用比参照物Idelalisib更强，如图4所示。并且，化合物1给药的治疗组没有观察到体重减少或其他副作用。

四、在MM1R多发性骨髓瘤移植模型中的抗癌药效学研究。

本实验采用MM1R和OPM2两种多发性骨髓细胞株移植模型研究化合物1对多发性骨髓瘤抗癌抗癌作用。实验方法参照文献(Qian C.et al:Clin Cancer Res2012；18:4104-4113)，结果显示，在MM1R和OPM2两种移植Beige/SCID小鼠模型中，化合物1能够抑制肿瘤生长，T/C值分别为为8.2％(图5A)和29.5％(图5B)。与赋形剂组比较p值<0.001，具有统计学意义上的显著性差别。并且给药化合物1的治疗组没有观察到体重减少或其他的副作用。

实验例2制剂考察实验

化合物2的性状特征如下：

中文化学名称为：N-羟基-2-(甲基((2-(6-(甲胺基)吡啶-3-基)4-吗啉代噻吩并[3，2-d]-嘧啶-6-基)甲基)氨基)嘧啶-5-甲酰胺盐酸盐

英文化学名称：

N-Hydroxy-2-(methyl-((2-(6-(methylamino)-pyridin-3-yl)-4-morpholinothiophene[3,2-d]-pyrimidin-6-yl)methyl)amino)pyrimidin-5-carboxamide hydrochloric salt

分子式：C₂₃H₂₈Cl₃N₉O₃S

结构式：

分子量：616.95

熔点：227.55℃

性状：本品为类白色至淡黄色粉末，有微弱气味。

溶解度：略溶于水、5％葡萄糖溶液(D5W)，不溶于生理盐水。pH值越低，越容易溶解。随着浓度增加，溶液流动性变差，最终呈凝胶状。

引湿性：易吸水，需要防潮保存。

酸碱离解常数：pKa(计算值):1.09,1.33,7.38,7.88

分配系数：LogP(计算值)1.81

稳定性：原料药结构中含有多个氮原子，对光照、高温不稳定；同时结构中还含有羟酰胺，可水解，对湿不稳定。

一、溶解性。

将化合物1-6置于纯水中，测定化合物1-6的水溶性，结果如下。

表3化合物1-6的水溶性

化合物	水溶性
		游离化合物(化合物1)	0.02mg/mL
盐酸盐(化合物2)	20mg/mL
		硫酸盐(化合物3)	5mg/mL
甲磺酸盐(化合物4)	2mg/mL
		酒石酸盐(化合物5)	<1mg/mL
钠盐(化合物6)	<1mg/mL

通过上述结果可以看出，式I所示的噻吩嘧啶类化合物水溶性极差，将其制备为不同的盐后，以盐酸盐的水溶性最佳。

将上述结果显示水溶性较好的盐酸盐(化合物2)和硫酸盐(化合物3)在不同温度下放置4周，进行稳定性考察，结果如下。

表4化合物2和化合物3的稳定性(以化合物％含量表示)

化合物	起始点含量	-20℃	25℃	40℃
					盐酸盐(化合物2)	98.41％	98.41％	98.39％	98.38％
硫酸盐(化合物3)	99.60％	99.60％	99.50％	99.10％

从上述不同温度下放置四周的稳定性数据分析，盐酸盐(化合物2)在测试的三个温度(-2℃，25℃，40℃)下都稳定，而硫酸盐(化合物3)在25℃和40℃下有不稳定的趋势。

而对于一个药物制剂来说，无论是考虑其制剂因素或吸收效果，均需要具有较好的溶解性和稳定性，因此综合考虑，以盐酸盐(化合物2)进行后续研究。

二、化合物2溶液的稳定性。

1、在不同溶剂中的稳定性。

将化合物2溶于不同溶剂中，考察其溶解时间、pH值、稳定性和溶解性，结果如下表所示。

表5化合物2在各种溶剂中的溶解度

注^[1]：物理稳定性仅指溶液保持澄清的时间

通过上述结果可以看出，化合物2以盐酸盐的形式存在，其水溶液呈酸性，随着浓度增高，溶液pH值降低。该化合物2微溶于水，5％葡萄糖(D5W)及甘露醇溶液中，但不溶于生理盐水中。且pH值越低，其溶液越稳定，然而，过低的pH值与临床要求是相悖的。

2、在不同pH值下的稳定性。

将化合物2的水溶液以pH调节剂调节，结果如下表所示。

表6化合物2在不同pH值下的性状

上述结果可以看出，pH值对溶液的物理稳定性影响较大，并且无法利用调节pH值的方法满足临床对注射制剂的要求。

3、梯度稀释高浓度溶液到低浓度溶液的稳定性。

由于低浓度的溶液pH值相对较高，更符合注射剂对pH值的要求，因此，除了直接配制此浓度的溶液外，我们还测试了从高浓度配方溶液稀释到低浓度配方溶液的可能性，并测量了他们的pH值同时确定其物理稳定性。其结果如下：

表7高浓度溶液稀释到低浓度溶液的有关数据

注¹：溶剂为5％葡萄糖溶液

通过上述结果可以看出，通过高浓度溶液稀释所生成的溶液的物理稳定性比直接制备的同浓度溶液要低。以该方法提高溶液稳定性也不可行。

综上所述，化合物2的浓度≤4mg/ml时，溶液澄清且无明显的凝胶倾向，能够满足注射剂配液和过滤的工艺需要。如果降低浓度，溶液的物理稳定性下降，同时灌装量增加，这样不仅没有益处，反而增加了不利因素。如果浓度>4mg/ml，溶液稠度增加，凝胶倾向明显，不能满足注射剂配液和过滤的工艺需要。因此将药液配制浓度设为4mg/ml。

而化合物2的毒理学研究提示临床一期研究起始剂量为10mg/m²体表面积，以60kg体重病人为例，体表面积(S)＝1.63m²，计算用药量为16.3mg，考虑到冷冻干燥时，每瓶制剂的灌装量和冷冻干燥效果，将每瓶灌装量设为6ml，则每瓶制剂中化合物2为25mg，能满足临床对起始剂量及剂量递增的需要。综合考虑后，将每瓶冻干粉针制剂的规格设为25mg。

三、注射用冻干粉的考察。

1、不同处方的考察：

按下表8的处方配置药液，药液灌装于20ml西林瓶中，-40℃预冷冻4小时，然后转移至冷冻干燥机中进行干燥，冷阱温度-50℃，真空度大约维持在50帕左右。

表8不同处方

注：药液灌装后，每瓶体积约为6.3ml。

表9处方考察结果

编号	外观	复溶
			1	有一定程度萎缩	振摇后仍有少量颗粒物存在
2	良好	溶液澄清，仍有小块或颗粒
			3	膨胀，含大量空洞	溶液有轻微乳光，有明显的药物颗粒
4	良好	有大量不溶物，溶液较粘稠
			5	良好	有少量颗粒
6	良好	有极少量颗粒
			7	良好	可完全溶解，振摇约需3分钟
8	良好	可完全溶解，振摇约需3分钟
			9	良好	可完全溶解，振摇约需2.5分钟
10	良好	可完全溶解，振摇约需1.5分钟

从上表中可以看出，在处方中仅辅以甘露醇、乳糖、葡萄糖和右旋糖酐-40，得到的冻干粉外观和/或复溶性均不佳，而以甘露醇配合泊洛沙姆188后，当甘露醇或泊洛沙姆188的用量过小时，复溶时间偏长，对临床使用造成不利影响。并且，当甘露醇用量较小时，溶解过程中会出现块状物表面出现凝胶化的现象，发明人发现，这可能是由于冷冻时甘露醇形成的骨架结构不够均匀细密，主药有可能形成较大的晶体颗粒，溶解时如果局部浓度过高(≥4mg/ml)就有可能出现明显的凝胶化倾向，这与本品主药的物理化学性质有关。

而增加甘露醇和泊洛沙姆188的用量，能显著改善冻干粉的复溶性，但如继续增加用量，其他弊端会逐渐显现，如溶液中固体物浓度过高，造成冻干块状物过于致密，内部水分不易散发出去等等问题。并且，根据FDA非活性成分数据库信息，泊洛沙姆188在静脉注射用冻干粉中的最大用量为0.22％，当采用上述编号10的处方时，泊洛沙姆188用量为0.20％，符合要求。

所以，当主药为250mg/10瓶时，甘露醇用量为6.0g/10瓶，并同时配合泊洛沙姆188用量为0.13g/10瓶时为最佳，既改善了制剂性能，又规避了有关弊端。

2、药液配制方法的考察。

以上述编号10的处方配制药液，并改变加料顺序，考察加料顺序对溶解性的影响。方法一为：首先将甘露醇溶于水中，其次加入泊洛沙姆，最后加入主药。方法二为：先加主药，再加泊洛沙姆和甘露醇。实验显示，第一种配制方法能很好的溶解主药，且溶解速度较第二种配制方法快。

并且，配药时物料溶解的搅拌速度以物料完全混悬为度。过慢的话，主药局部浓度过高，易发生表面凝胶化，从而阻碍进一步溶解。过快的话，由于泊洛沙姆的存在易产生泡沫。

3、原辅料相容性的考察。

以上述编号10的处方量，按照下表配制药液，并制成冻干粉，考察不同条件下产生的有关物质含量。

表10原辅料相容性试验结果

其中：k-acid为：

k-ester为：

总杂包括：K-acid,K-ester和其他未知杂质。

通过上表结果，我们可以看出，主药(化合物2)与甘露醇和泊洛沙姆188之间的相容性较好，可以在处方中使用。

四、活性炭用量的考察。

按照上述编号10处方配制药液，过滤后加入不同量的活性炭，搅拌，过滤除去活性炭后测定药液中有关物质、杂质和化合物2的含量。结果如下表所示。

表11活性炭用量考察

从上表中可以看出，0.15％活性炭搅拌15min和30min时含量损失相对较大，应予以排除。活性炭0.05％，搅拌15min和活性炭0.10％，搅拌15min，含量损失均较小，但是活性炭0.10％，搅拌15min对热源的吸附效果更佳。综合考虑，选择活性炭用量为0.10％，搅拌时间15min为最佳工艺参数。

并且，一般来说活性炭在混悬状态下吸附效果较好，因此搅拌速率应能保证活性炭完全混悬。又因本品中含有表面活性剂泊洛沙姆，搅拌速率过高易产生泡沫，所以，搅拌速率只能以活性炭刚好完全混悬为适宜标准。

五、药液稳定性的考察。

以上述编号10的处方配制药液，随后在正常室内光照的条件下敞口常温(22±4℃)放置，于不同时间取样，考察其中的有关物质和总杂含量，结果如下表所示。

表12药液稳定性考察

从上表中可以看出，常温(22±4℃)条件下，药液敞口放置8小时有关物质的单杂和总杂均无明显增长，也就是说本品的制剂工艺操作时间(从加入主药到预冷冻开始前)控制在考察时间以内是安全可靠的。所以，将本品的配液可维持时间(从加入主药到预冷冻开始前)定在≤8小时。

六、共熔点测定。

1、测定方法：

利用溶液在冷却到最低共熔点时，电阻突然增大的原理，采用电阻法测定本品共熔点。具体方法见图6，图6装置中除万用表电表外，样品杯放入-15℃冰柜中冷冻24小试，取出后将导线两头分别连接在万用表2个测量端上，在室温条件下观测冰冻样品杯，杯中的结晶因温度回升而融化，观察测定电阻突然变小时的温度，此时为编号10处方药液的共熔点。结果见下表。

表13共熔点测定数据

以上结果表明样品杯中编号10的处方药液结晶因温度回升而融化，电阻突然变小时，温度在-10℃，此时为编号10的处方药液的共熔点。

实验例3冻干粉制剂处方和工艺验证

一、小试产品试制。

1、小试处方：

2、制备工艺：

(1)物料准备：按上述处方称取或量取物料，备用。

(2)药液配制：将甘露醇加入常温(22±4℃)的注射用水中搅拌溶解，然后加入泊洛沙姆188搅拌溶解，最后在搅拌状态下缓慢加入化合物2使完全溶解。搅拌速度以物料能完全混悬为度。

(3)活性炭吸附除热原：溶液保持在常温(22±4℃)下加入0.10％(w/w)的针用活性炭，搅拌15min，脱炭，经0.45μm滤膜初滤，再经0.22μm滤膜精滤。搅拌速度以活性炭刚好完全混悬为度。

(4)药液灌装：检查中间体含量、pH值，并计算每瓶装量、灌装、半加塞。从加入主药到预冷冻开始前的工艺操作时间≤8小时。

(5)冷冻干燥：溶液灌装于20ml西林瓶中，-40℃预冷冻4小时，然后转移至冷冻干燥机中进行干燥，冷阱温度-50℃，真空度大约维持在50帕左右。

(6)压胶塞，轧盖，并储存。

3、制剂性能考察。

(1)、基本性能。

表14小试样品成品检测

从上表中可以看出，上述处方和工艺稳定可靠，各项指标均符合要求。

(2)、制剂影响因素及胶塞相容性实验

表15高温考察

注：“/”表示未检出，“RRT”表示未知杂质的液相色谱相对保留时间。

表16光照考察

注：“/”表示未检出，“RRT”表示未知杂质的液相色谱相对保留时间。

从上表中可以看出，光照和高温对本品稳定性均有一定影响，光照更明显，且在光照条件下胶塞与本品相容性相对较差，故应避光低温保存。

(3)、配伍试验。

取小试样品2支，溶于100ml 5％葡萄糖溶液(D5W)中，在正常室内光照和常温(22±4℃)条件下考察本品与5％葡萄糖溶液(D5W)的配伍稳定性情况。

方法：取小试样品2支，每支加5％葡萄糖注射液20ml，沿瓶壁缓缓注入，轻微晃动药瓶直至完全溶解，静置至气泡消失，转移至葡萄糖注射液中混匀，考察8小时内的稳定性。结果如下表所示。

表17与5％葡萄糖溶液配伍实验结果

注：5-羟基糠醛含量测定方法同有关物质测定方法。

“/”表示未检出。

从上表中可以看出，在8小时内有关物质和含量均无明显变化，说明本品与5％葡萄糖溶液(D5W)配伍稳定性良好，能够满足临床用药要求。

二、中试产品试制。

1、中试处方：按上述实施例7的处方和工艺进行四批放大，批量：4000瓶，具体见下表。

表18四批放大样品试制信息

2、制备工艺(工艺流程如图7所示)：

(1)物料准备：按处方称取或量取物料，备用。

(2)药液配制：将甘露醇加入22±4℃的注射用水中搅拌溶解，然后加入泊洛沙姆188搅拌溶解，最后在搅拌状态下缓慢加入化合物2使完全溶解。搅拌速度以能使加入物料完全混悬为度。

(3)活性炭吸附除热原：将溶液温度保持在22±4℃内，加入0.10％(w/w)的针用活性炭，搅拌15min，脱炭，经0.45μm滤膜初滤，再经0.22μm滤膜精滤。搅拌速度以活性炭完全混悬为度。

(4)药液灌装：检查中间体含量、pH值，并计算每瓶装量、灌装、半加塞。从加入主药到预冷冻开始前的工艺操作时间≤8小时。

(5)预冻：将瓶装溶液放入冷冻干燥机中，使隔板温度降至-45℃，维持4h～6h时，使制品完全冻结。

(6)升华干燥：对冷凝器迅速降温，待其温度降至-70℃以下时，启动真空泵组，当冷阱真空度小于40Pa时，打开中隔阀，并逐渐升高隔板温度至-16℃，保温数小时，至产品冰层消失。

(7)解析干燥：逐渐升高隔板温度至25℃，保温数小时，至产品完全干燥，冻干过程结束。

(8)压胶塞，轧盖，包装成成品。

3、制剂性能考察。

(1)、中间体检测。

外观：目视法，应为微黄色澄清溶液。

pH值：照中国药典2010年版二部附录VI H，pH值应为2.0～3.0。

含量测定：照含量测定法(中国药典2010年版二部附录ⅤD)测定。

色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶(Agilent ZorbaxSB-C18柱，150mm×4.6mm，5um)为填充剂；以0.05％三氟乙酸水溶液为流动相A，以0.05％三氟乙酸乙腈溶液为流动相B，按下表梯度进行洗脱；检测波长为250nm。

表19含量测定检测条件

取本品5ml，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取水分测定的化合物2对照品适量，加溶剂制成每1ml含0.3mg的溶液，同法测定，按外表法以峰面积计算，即得。结果如下表所示。

表20四批放大样品中间体检测结果

(2)、四批成品全检结果。

四批样品有关物质、含量、pH、无菌检查、细菌内毒素结果均符合规定。

结论：优选的活性炭用量及工艺参数可有效控制产品的内毒素水平。说明优选的活性炭用量及工艺参数可满足实际生产的要求。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (23)

1.一种式I所示的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，

2.根据权利要求1所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐，硫酸盐，甲磺酸盐，酒石酸盐和钠盐。

3.根据权利要求2所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐为盐酸盐。

4.根据权利要求2或3所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐中，式I所示的噻吩嘧啶类化合物与酸或碱的摩尔比为1：X，其中：X＝1-3。

5.根据权利要求4所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，X＝3。

6.权利要求1所述的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，按照以下步骤合成：

(1)将3-氨基-2-噻吩羧酸甲酯(101)与氰酸盐反应后碱化生成噻吩嘧啶二酮中间体(102)；

(2)噻吩嘧啶二酮中间体(102)在氯化剂的作用下反应置换二酮为二氯化合物(103)；

(3)二氯化合物(103)与吗啉反应得到吗啉取代的噻吩嘧啶化合物(104)；

(4)噻吩嘧啶化合物(104)首先用有机锂试剂与噻吩的碳-2位质子交换，随后与N,N-二甲基甲酰胺反应生成醛类化合物(105)；

(5)醛类化合物(105)在还原胺化条件下反应得到甲胺类化合物(106)；

(6)甲胺类化合物(106)中的胺在碱性条件下取代2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯(301)中的氯生成中间体一化合物(107)；

(7)中间体一化合物(107)与6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐(204)耦合生成中间体二化合物(108)；

(8)中间体二化合物(108)与羟胺反应得到式I所示化合物(1)；

反应路线如下：

其中：6‐甲胺基吡啶‐3‐硼酸盐酸盐(204)通过以下方法制备：

(A)将2,5‐二溴吡啶(201)与甲胺反应得到5‐溴‐2‐甲胺基吡啶(202)；

(B)5‐溴‐2‐甲胺基吡啶(202)中的氮用保护基保护得到氮被保护的中间体三化合物(203)；

(C)中间体三化合物(203)的溴先转化成硼酸酯，再水解后得到6‐甲胺基吡啶‐3‐硼酸盐酸盐(204)；

反应路线如下：

7.根据权利要求6所述的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氰酸盐为氰酸钾或氰酸钠；

步骤(2)中，所述氯化剂为三氯氧磷，五氯化磷，或氯化亚砜；

步骤(4)中，所述有机锂试剂为正丁基锂或二异丙基氨基锂；

步骤(8)中，所述羟胺为游离羟胺或盐酸羟胺；

步骤(B)中，所述保护基为叔丁基氧羰基；

步骤(C)中，所述中间体三化合物(203)与硼酸三异丙酯反应，将中间体三化合物(203)中的溴转化为硼酸酯。

8.根据权利要求6所述的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，中间体一化合物(107)与6-甲胺基吡啶-3-硼酸盐酸盐(204)反应时，还加入钯催化剂，所述钯催化剂为醋酸钯。

9.根据权利要求6所述的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，中间体二化合物(108)与羟胺反应结束后，将反应体系的pH调至10.6-11.0，对得到的式I所示化合物(1)进行纯化。

10.根据权利要求6所述的噻吩嘧啶类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，甲胺类化合物(106)反应生成中间体一化合物(107)的反应条件为：在20-30℃下以乙腈为溶剂，加入的碱为二异丙基乙胺，该二异丙基乙胺的加入量为反应所需理论量的5-8倍。

11.权利要求1所述的噻吩嘧啶类化合物的药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，按照权利要求6-10任一项的制备方法得到式I所示的噻吩嘧啶类化合物后，通过下述方法制备得到该噻吩嘧啶类化合物的药学上可接受的盐：

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与盐酸甲醇溶液反应生成其盐酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与硫酸甲醇溶液反应生成其硫酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与甲硫酸二氯甲烷溶液反应生成其甲硫酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与酒石酸的甲醇溶液反应生成其酒石酸盐；

式I所示的噻吩嘧啶类化合物与氢氧化钠水溶液反应生成其钠盐。

12.权利要求1-5任一项所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

13.根据权利要求12所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌和恶性血液肿瘤。

14.根据权利要求13所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述恶性血液肿瘤包括急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病和淋巴瘤。

15.一种药物组合物，其特征在于，包括作为活性成份的权利要求1-5任一项所述的噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物的剂型为注射用冻干粉；所述药学上可接受的载体包括骨架形成剂和增溶剂。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述骨架形成剂为甘露醇，所述增溶剂为泊洛沙姆188。

18.根据权利要求16或17所述的药物组合物，其特征在于，所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐：骨架形成剂：增溶剂的重量比为25:300-700:11-15。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐：骨架形成剂：增溶剂的重量比为25:500-700:12-14。

20.权利要求16-19任一项所述的注射用冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

药液配制：称取处方量骨架形成剂，加入注射用水中搅拌溶解；再加入处方量的增溶剂搅拌溶解；随后在搅拌状态下加入所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，使其完全溶解；

活性炭吸附：加入活性炭搅拌吸附杂质后，除去活性炭；

冷冻干燥：将除去活性炭后得到的药液灌装，进行冷冻干燥，即得。

21.根据权利要求20所述的注射用冻干粉的制备方法，其特征在于，所述药液配制步骤中，加入的注射用水：所述噻吩嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐的重量比为5000-7000:25。

22.根据权利要求20所述的注射用冻干粉的制备方法，其特征在于，所述活性炭吸附步骤中，活性炭的加入量为药液重量百分比的0.05-0.10％，并且搅拌时间为15-30min。

23.根据权利要求20所述的注射用冻干粉的制备方法，其特征在于，所述由药液配制步骤开始至将药液开始进行冷冻干燥的时间不超过8小时。