CN104278026B - 斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用。首次分别通过化学诱导和morpholino敲除两种途径获得了斑马鱼造血干细胞缺陷模型，其可作为筛药模型，应用于筛选可改善造血干细胞缺陷的药物。本发明的方法操作方便，成本低，实验结果可靠准确。

Description

斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，更具体地，本发明涉及一种CCCTC结合因子基因功能缺失斑马鱼在造血缺陷方面的研究模型建立及应用。

背景技术

斑马鱼作为一个脊椎动物造血模型，既优于其它的动物模型，又与哺乳类造血具有高度保守性。斑马鱼造血系统的发生分为两波，原始造血和定向造血。原始造血产生一过性细胞群，主要是红细胞和一些髓系细胞，而定向造血产生能自我更新的造血干细胞，这些细胞生成所有造血系，包括淋巴细胞。在斑马鱼中，原始造血起源于两个胚外造血位点，前部侧板中胚层和尾部侧板中胚层，继而形成中间细胞团。前部侧板中胚层是原始巨噬细胞的初始位点，中间细胞团是多潜力血液祖细胞产生位点，主要产生红细胞和一些粒细胞。24hpf(受精后时间(小时))循环开始后，一过性的红髓祖细胞在后部血岛形成。定向造血出现于30hpf，这时造血干细胞在背部动脉内壁形成，这是一个类似于哺乳动物大血管-性腺-中肾的区域。随后干细胞迁移至尾部造血组织，从那里移于肾脏和胸腺。造血干细胞是唯一能产生髓红血小板和淋系的细胞，被认为维持成体造血，在成鱼的肾髓中。

CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC结合因子)是广泛存在于真核生物的多功能转录因子。其N端11个锌指结构可以形成不同的组合，使CTCF调控多种靶基因的表达。基于它的能力是结合大范围的不同序列，与特异的共调节蛋白通过不同锌指组合，ctcf起初被描述为多价因子。这一特异的结构提供了第一个线索，暗示其区别于大部分锌指在基因组调节中的功能。一系列的证据表明了ctcf在不同细胞过程的关键作用。Ctcf纯合敲除小鼠展现了早期胚胎着床前致死表型。母源性敲除卵母细胞中ctcf明显破坏了正常的进行囊胚阶段。目前的研究谱系绘制了基因组范围的占据，分布谱式在多细胞类型，进一步强化了概念，即细胞下游的影响是ctcf在基因组调控的结果。使用chip-seq，在人CD4+T细胞中发现了20,262个ctcf潜在的基因结合位点。然而，其对造血的影响还需要较好的模型研究予以阐明并应用于医药研究。

发明内容

本发明的目的在于提供斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用。

在本发明的第一方面，提供CCCTC结合因子下调剂的用途，用于制备构建斑马鱼造血干细胞缺陷模型的试剂。

在一个优选例中，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种CCCTC结合因子下调剂，其是核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的寡核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法，所述方法包括：在斑马鱼中下调CCCTC结合因子的表达(包括使之不表达)，从而获得斑马鱼造血干细胞缺陷模型；较佳地，通过化学诱变、基因定点突变及morpholine敲除下调CCCTC结合因子的表达。

在一个优选例中，所述的制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法中，应用所述的CCCTC结合因子下调剂来制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型。

在本发明的另一方面，提供一种斑马鱼模型，其中CCCTC结合因子不表达或低表达；如表达量仅为野生型正常斑马鱼的20%或更低。

在本发明的另一方面，提供一种筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物的方法，所述方法包括：

(1)提供斑马鱼CCCTC结合因子突变型(纯合体)胚胎；

(2)按照受精后时间计算，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；

(3)药物处理后(较佳地为处理24-48小时后)，检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位；

其中，若runx1和/或cmyb表达显著提高(如提高20%；更佳地提高40%；更佳地提高60%)，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。

在一个优选例中，应用原位杂交技术检测runx1和/或cmyb的表达和定位。

在另一优选两种，所述的筛选方法中，步骤(2)包括：在测试组中，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；和/或

步骤(3)包括：检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位，并与对照组比较，其中所述的对照组是不用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼CCCTC结合因子突变型(纯合体)胚胎；

若与对照组相比，测试组runx1和/或cmyb表达显著提高(如提高20%；更佳地提高40%；更佳地提高60%或更高)，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。

在另一优选例中，所述对照组仅包括候选药物的溶剂；较佳地，所述的溶剂是DMSO。

在另一优选例中，所述的筛选方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗造血干细胞缺陷疾病有用的物质。

在另一优选例中，所述的筛选方法中，所述的候选药物包括(但不限于)：小分子化合物、肽。

在本发明的另一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗造血干细胞缺陷疾病的药物组合物中的用途，所述化合物选自：

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、ctcf基因在第18号染色体的位置，及在该实例中其突变位点位置。

图2、该实施例中runx1所代表的造血表型。

上图为同批胚胎中的野生型。

下图为突变体，其中runx1表达下降。

箭头表示runx1原位杂交染色情况。

图3、ctcf mo构建敲除模型所致runx1所代表的造血表型。

上图为未以Morpholino(MO)寡核苷酸片段敲除的同批胚胎对照。

下图为敲除模型，其中runx1表达下降。

箭头表示runx1原位杂交染色情况。

图4、该实施例中cmyb所代表的造血表型。

左图为同批胚胎中的野生型。

右图为突变体，其中cmyb表达下降。

箭头表示cmyb原位杂交染色情况。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次分别通过化学诱导和morpholino敲除两种途径获得了斑马鱼造血干细胞缺陷模型，其可作为筛药模型，应用于筛选可改善造血干细胞缺陷的药物。本发明的方法操作方便，成本低，实验结果可靠准确。

如本文所用，所述的“显著”是指在发生统计学上的变化。如“显著提高”，是指提高20%或更多。

本发明通过化学诱导和morpholino敲除两种途径获得该模型，并评价了其对造血方面的影响。作为本发明的优选方式，所述缺陷模型可通过以下方式构建：

(a)通过ENU(乙烷亚硝基脲)化学诱变，筛选获得ctcf的突变鱼，ctcf基因分子很大，易于被突变。通过定位克隆技术或测序技术可以快速的得到ctcf突变基因鱼。ctcf定位克隆由3步组成。第一阶段包括确认DNA片段(marker，标记物)，通过连锁分析确定突变所在区域。第二阶段，marker被用于从基因组文库分离克隆。如果marker和突变位点紧密连锁，第一个分离出的克隆可能包含突变基因，否则检测其临近的基因，直到确定为止。第三阶段通过挽救及特异敲减来验证突变的基因。通过上述技术，本发明人获得了CTCF基因的突变鱼。

(b)本发明的斑马鱼造血干细胞缺陷模型的另一种构建方法是利用morpholino技术在模式生物体斑马鱼早期胚胎发育过程中将SEQ ID NO:1所示的morpholino寡核苷酸片段显微注射入单细胞期的斑马鱼卵中沉默ctcf亚型基因的表达而建立。

对于造血缺陷表型的评价是使用runx1和/或cmyb作为造血干细胞标志物，通过检测runx1和/或cmyb的表达来评价造血缺陷情况。较佳地，检测runx1和/或cmyb的表达可应用原位杂交技术，该技术可同时实现runx1和/或cmyb的定位，以确定ctcf基因缺陷后造血表型的改变。

在获得了本发明的筛药模型后，可以应用该模型来筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在治疗药物。

因此，本发明提供一种筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：(1)提供斑马鱼CCCTC结合因子突变型(纯合体)胚胎；(2)按照受精后时间计算，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；(3)药物处理后(较佳地为处理24-48小时后)，检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位；其中，若runx1和/或cmyb表达显著提高，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。较佳地，应用原位杂交技术检测runx1和/或cmyb的表达和定位。。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到疾病状况的变化，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选药物的疾病模型。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于治疗造血干细胞缺陷疾病真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于治疗造血干细胞缺陷疾病有用的物质。

作为本发明的优选实施例，使用本发明的疾病模型的药物筛选方法如下：使ctcf突变株纯合子和morpholino方法构建的模型胚胎，培养至外包期后，将胚胎转移至培养板中，每孔置入适量胚胎，同时加入不同小分子化合物的胚胎培养液，DMSO作为空白对照组，对胚胎进行runx1和/或cmyb原位杂交染色，观察干细胞的多少。最后对实验结果进行初步判定，分析各个小分子化合物对ctcf造成的造血干细胞形成的治疗作用。

本发明还提供了CCCTC结合因子下调剂的用途，用于制备构建斑马鱼造血干细胞缺陷模型的试剂。优选地，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸。

在本发明的提示下，本领域技术人员可以制备出CCCTC结合因子的其它下调剂、拮抗剂或阻滞剂，这些均应涵盖在本发明的范围内。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、模型筛选

为了研究ctcf各个锌指各自及组合的基因调控功能，本发明运用化学突变技术，诱导并筛选得到了模式生物斑马鱼ctcf上第7锌指的组氨酸(GenBank登录号BX088593的氨基酸序列中第500位)变为酪氨酸的突变体，该突变体呈现造血缺陷的表型，可用以作为造血研究模型以及该锌指功能异常的相关药物筛选的动物模型。研究使用来自多态性制图的1660个突变胚胎，分析最终确定为第18染色体上ZH18-14及CR933-1两个标识片段之间为突变点位于区域，其中包括fam65a，ctcf，tmem170a等基因。通过提取cDNA测序，确定了ctcf是突变基因(图1)。其造血干细胞缺陷的主要表型为runx1下降(图2)，另外还可观察到cmyb下降(图4)，胸腺缺失，而其他各系无变化。所述缺失模型可作为药物筛选的动物模型。

实施例2、敲除ctcf的模型的构建

斑马鱼的饲养、繁殖与分龄依照常规方法进行。用于敲除ctcf的Morpholino(MO)寡核苷酸片段序列如下：

SEQ ID NO:1：5’-CATGGGTAATACCTACATTGGTTAA-3’。

将MO寡核苷酸片段溶于超纯水中，以4ng/胚胎显微注射剂量，注射入单细胞期的斑马鱼卵中。显微注射后即将胚胎培养于胚胎溶液中，配方：1升水，0.06克海盐，10微升0.2%(w/v)亚甲基蓝，置于28.5℃恒温培养箱中持续培养，于体视显微镜下观察表型，结果，与实施例1中筛选得到的ctcf突变体表型一致(图3)。

实施例3、药物筛选

对从药物库中取出的各种不同结构的小分子化合物，用DMSO(二甲亚矾)作为助溶剂，配成2mM的储存液；在表型筛选时，将每种化合物用胚胎培养液稀释成1-200uM。使ctcf突变株杂合子(实施例1中筛选得到的)进行交配，得到纯合体，获得胚胎，培养至50%外包期(受精后5小时)；然后将胚胎转移至培养板(如96孔板)中，每孔置入适量胚胎(如6枚胚胎)，同时加入不同小分子化合物的胚胎培养液，在20-30℃胚胎培养箱进行培养。

同时，设置DMSO对照组，作为空白对照组。该对照组是仅给予溶剂而为给予候选化合物处理的ctcf的纯合突变株。

在胚胎发育不同阶段(例如培养至24小时及48小时等不同阶段)，对胚胎进行runx1及cmyb原位杂交染色，观察干细胞的多少。公知地，runx1及cmyb是造血干细胞标志物，通过原位杂交技术检测其表达量和定位以确定ctcf基因缺陷后造血表型的改变，若是runx1及cmyb表达量相对于未给予候选药物的对照组相比，染色显著恢复(表达量显著提高)，则表明候选药物是潜在的造血干细胞促进药物。

最后对实验结果进行判定，分析各个小分子化合物对造血干细胞形成的影响。筛选到的小分子化合物如下：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.CCCTC结合因子下调剂的用途，用于制备构建斑马鱼造血干细胞缺陷模型的试剂，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的Morpholino寡核苷酸。

2.一种制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法，其特征在于，所述方法包括：在斑马鱼中下调CCCTC结合因子的表达，从而获得斑马鱼造血干细胞缺陷模型；应用CCCTC结合因子下调剂来制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的Morpholino寡核苷酸。

3.一种筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供斑马鱼CCCTC结合因子突变型胚胎；

(2)按照受精后时间计算，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；

(3)药物处理后，检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位；

其中，若runx1和/或cmyb表达显著提高，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：在测试组中，从受精后5±0.5小时起，用候选药物处理(1)的胚胎；和/或

步骤(3)包括：检测斑马鱼胚胎中runx1和/或cmyb的表达和定位，并与对照组比较，其中所述的对照组是不用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼CCCTC结合因子突变型胚胎；

若与对照组相比，测试组runx1和/或cmyb表达显著提高，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的细胞实验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗造血干细胞缺陷疾病有用的物质。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的候选药物包括：小分子化合物、肽。