CN104263349B - 一种水溶性的荧光-磁性双标记微球制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种水溶性的荧光磁性微球的制备新方法。该方法以油溶性的荧光纳米粒和超顺磁性纳米粒为原料，通过羟乙基淀粉的包裹，形成一种水溶性的荧光-磁性双标记微球。该微球具有良好的水溶性、稳定性以及生物标记活性，同时具有良好的超顺磁性和荧光特性，可广泛用于生物分析、环境分析、食品安全检测、样品分离纯化、医学检验与成像以及生物医药研究等领域。
Description
技术领域
本发明属于化学与材料领域，具体涉及一种新型的水溶性荧光磁性微球的制备方法。
背景技术
磁性标记和荧光标记技术在生物分析、分离纯化、医学检验以及生物医药研究等领域有着广泛的应用。基于超顺磁性纳米材料的磁性标记技术使得标记物在外加磁场作用下具有良好的磁响应性能，一方面可以作为磁分离的介质，另一方面也为磁信号检测(如核磁共振检测)提供了可能。而以量子点、上转换荧光材料、闪烁晶体等为代表的荧光纳米材料标记技术，在荧光示踪、定量荧光分析等领域有着广泛的应用。制备荧光-磁性双标记微球，将这两种标记技术的优势合二为一，一直是各国科研工作者共同关注的研究热点。
无论是超顺磁性氧化铁纳米粒，还是量子点、荧光纳米晶体等荧光纳米材料，目前较为成熟的制备方法所获得的大部分都是易溶于有机溶剂的油溶性纳米粒，水溶性差。为了满足生物医药领域对水溶性微球的要求，常常需要经过较复杂的高分子包裹与化学修饰过程，以增强这些磁性/荧光纳米材料的水溶性、稳定性以及偶联标记活性。如何通过简单易行的方法实现水溶性磁性/荧光微球的规模化制备，是需要解决的技术难题。
羟乙基淀粉(HES，HydroxyethylStarch)是用化学方法在淀粉分子上引入亲水基团羟乙基而得到的变性淀粉，其突出优点是醚健的稳定性高。由于具有非常优异的生物相容性，羟乙基淀粉静脉注射剂在医药领域被广泛用作血液容量扩充剂，是一种用于重症科、麻醉科的临床常用药。
发明内容
本发明的目的是提供一种水溶性的荧光磁性微球的制备新方法。该方法以油溶性的荧光纳米粒和超顺磁性纳米粒为原料，通过羟乙基淀粉的包裹，形成一种水溶性的荧光磁性微球。该微球具有良好的水溶性、稳定性以及生物标记活性，同时具有良好的超顺磁性和荧光特性，可广泛用于生物分析、环境分析、食品安全检测、样品分离纯化、医学检验与成像以及生物医药研究等领域。
本发明的目的之一是提供一种水溶性的荧光-磁性双标记微球制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将油溶性的超顺磁性纳米粒与荧光纳米晶体的固体粉末混合物、柠檬酸以及DMF(N,N-dimethyl-Formamide,二甲基甲酰胺)在N2保护下加热至75℃，搅拌至全部溶解；冷却到室温，离心取上清，得到溶解有纳米粒的溶液。固体粉末混合物与柠檬酸的质量比为1:0.1~1:1之间，固体粉末混合物与DMF的质量比为1:10~1:100之间。
(2)将步骤(1)所制得的溶解有纳米粒的溶液、HES溶液、DMF按1:0.1:5~1:1:20的质量比搅拌混匀，在N2保护下85℃反应2小时。冷却至室温后加入过量的MTBE(methyltert-butylether,甲基叔丁基醚)，搅拌混匀后离心，弃上清液；
(3)用中性缓冲溶液将步骤(2)所得沉淀物重悬，透析去除残留的有机溶剂，即得水溶性的荧光-磁性双标记微球。
其中，步骤(1)中所述超顺磁性纳米氧化铁纳米粒优先以乙酰丙酮铁为前驱体，采用高温有机分解法合成超顺磁性纳米Fe304，通过旋转蒸发去除有机溶剂后得到的固体粉末。
其中，步骤(1)中所述固体粉末混合物中，超顺磁性纳米粒与荧光纳米晶体的质量比为1:2~10:1之间。
其中，步骤(2)中所述HES溶液的配制方法是将HES与超纯水水按1:10质量比混合，并搅拌至完全溶解。
其中，步骤(3)中所述中性缓冲溶液优先为pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液，每升缓冲液中含有8克氯化钠、0.2克氯化钾、1.78克二水合磷酸二氢钠和0.27克磷酸氢钾。
本发明的目的之一是提供一种用于制备荧光磁性微球的荧光纳米晶体的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将含有0.025mol/LTb3+和0.1mol/LLa3+的水溶液、乙醇、油酸按1:1:0.035的体积比进行混合，并搅拌均匀。
(2)配制0.52mol/L的NH4F水溶液，逐滴滴加到步骤(1)所得溶液中，最终使F-与Tb3+的摩尔比为15:1；70℃反应1小时后冷却至室温。
(3)离心去上清，用过量乙醇和水交替洗涤3次后，真空干燥后得到荧光纳米晶体La0.8Tb0.2F3。
有益效果
本发明所提供水溶性的荧光磁性微球的制备方法简单，反应条件温和，制备的微球同时具有良好的超顺磁性和荧光特性，可广泛用于生物分析、环境分析、食品安全检测、样品分离纯化、医学检验与成像以及生物医药研究等领域。
由于采用天然生物分子改性而来的HES替代传统的化学合成高分子材料，该微球具有非常优异的生物相容性，使得微球表面标记的抗体蛋白等生物大分子不易失活，非常适于免疫分析、蛋白质分离纯化、体内示踪成像以及生物医药研究等对生物相容性有特殊要求的领域。此外，HES微球表面带有大量羟基，增强了微球的水溶性和稳定性，并为抗体等生物分子的偶联标记提供了充足的可反应活性基团。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：本发明提供的荧光纳米晶体的透射电子显微镜图
图2：本发明提供的荧光纳米晶体的荧光发射光谱图
图3：本发明提供的荧光纳米晶体的X射线衍射图谱
图4：本发明提供的水溶性荧光磁性微球的透射电子显微镜图
图5：本发明提供的水溶性荧光磁性微球的DLS(动态光散射)粒径分布图
图6：本发明提供的水溶性荧光磁性微球的荧光发射光谱图
图7：本发明提供的水溶性荧光磁性微球的荧光寿命谱图
图8：本发明提供的水溶性荧光磁性微球的VSM(振动样品磁强计)磁滞豫率回归线图
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1 荧光纳米晶体La0.8Tb0.2F3的制备
(1)用1mol/LHCl加热溶解Tb2O3固体，用超纯水稀释得到0.05mol/L的Tb3+溶液；用1mol/LHCl加热溶解La2O3固体，用超纯水稀释得到0.2mol/L的La3+溶液。取3mL0.05mol/L的Tb3+溶液、3mL0.2mol/L的La3+溶液、6mL乙醇、0.21mL油酸，室温下1000rpm机械搅拌至完全混合均匀。
(2)用超纯水配制4.3mL0.52mol/L的NH4F溶液，机械搅拌下以2mL/min速度逐滴滴加到步骤(1)所得溶液中，70℃反应1小时后，冷却至室温。
(3)6000g离心10分钟，弃上清。用25mL乙醇和25mL水交替洗涤3次后，真空干燥后得到荧光纳米晶体。
实施例2 超顺磁性纳米氧化铁的制备
(1)称取乙酰丙酮铁0.7克、1,2-十二烷二醇2.0克、油酸1.83克、油胺1.68克、二苯醚20.1克，混合均匀，在N2保护下搅拌加热至200℃，恒温30分钟后再加热至220℃，反应30分钟后，停止加热冷却至室温。
(2)向反应液中加入45毫升乙醇，搅拌，沉淀，6000g离心10分钟，弃上清，收集沉淀；所得固体复溶于的20毫升正己烷中，然后再用乙醇沉淀一次，所得固体溶于正己烷中，除去残留固体后，旋转蒸发正己烷，得到黑色粉末，为超顺磁性Fe3O4纳米粒。
实施例3 水溶性的荧光-磁性双标记微球的制备
(1)将实施例1中制备的荧光纳米晶体和实施例2中制备的超顺磁性纳米粒按质量比1:2、10:9或10:1的比例混合均匀，得到固体粉末混合物。
将上述固体粉末混合物、柠檬酸、DMF按质量比为1:0.1:10、1:0.3:50或1:1:100，配制成40毫升溶液，在N2保护下搅拌加热至75℃，待固体粉末溶解后，冷却到室温，6000g离心10分钟后取上清，得到溶解有纳米粒的溶液。
(2)称取HES固体10克，加入90克超纯水配制成HES溶液。
将步骤(1)所制得的溶解有纳米粒的溶液、上述HES溶液、DMF按1:0.1:5，1:0.5:15或1:1:20的质量比混合均匀得到100毫升溶液，在N2保护下搅拌加热至85℃并反应2小时。冷却至室温后，加入300mLMTBE搅拌混匀进行沉淀，5000g离心10分钟，弃上清收集沉淀物。
(3)用100mLpH7.4的PBS缓冲溶液将步骤(2)所得沉淀物重悬，装入MD77(8000-14000)透析袋在PBS中透析24小时，去除残留的有机溶剂后，即得水溶性的荧光磁性微球。
本发明提供的荧光纳米晶体的分析表征：
将实施例1制备的荧光纳米晶体制样后用透射电子显微镜电镜TEM进行观察(图1)，可知荧光纳米晶体的粒径在5-9nm，粒子之间没有聚集现象。使用荧光分光光度计测量发射光谱(图2)可知，荧光纳米晶体在490nm和545nm具有两个强荧光峰(激发波长EX=280nm)。根据投料比和XRD(X射线衍射)数据(图3)推测荧光纳米晶体的分子式为La0.8Tb0.2F3。
本发明提供的水溶性荧光磁性微球的分析表征：
将实施例3制备的水溶性荧光磁性微球制样后用透射电子显微镜电镜TEM进行观察(图4)，可知荧光磁性微球的粒径在170-190nm左右，HES包裹在纳米粒子外层，微球之间没有聚集现象。使用激光粒度仪测量其水溶中粒径分布(DLS动态光散射法)，由图5可知其平均水合粒径约为210nm。使用荧光分光光度计测量微球的发射光谱(图6)可知，微球在490nm和545nm左右具有两个强荧光峰(激发波长EX=280nm)，且荧光强度与制备过程中荧光纳米晶体的投加量正相关。从荧光寿命谱图(图7)可知，荧光磁性微球的荧光寿命τ≥2.4ms，是一种非常优秀的时间分辨荧光材料。使用震动样品磁强计测量微球的磁滞回线(图8)可知微球无剩磁现象，具有超顺磁性。
Claims (5)
1.一种水溶性的荧光磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将油溶性的超顺磁性纳米粒与荧光纳米晶体La0.8Tb0.2F3的固体粉末混合物、柠檬酸以及DMF在N2保护下加热至75℃，搅拌完成溶解后，冷却到室温，离心取上清，得到溶解有纳米粒的溶液;固体粉末混合物与柠檬酸的质量比为1:0.1~1:1之间，固体粉末混合物与DMF的质量比为1:10~1:100之间；
(2)将步骤(1)所制得的溶解有纳米粒的溶液与HES溶液、DMF按1:0.1:5~1:1:20的质量比搅拌混匀，在N2保护下85℃反应2小时;冷却至室温后加入过量的MTBE，搅拌混匀后离心，弃上清液；
(3)用中性缓冲溶液将步骤(2)所得沉淀物重悬，得到水溶性的荧光磁性微球。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中所述超顺磁性纳米粒是以乙酰丙酮铁为前驱体，采用高温有机分解法合成的超顺磁性纳米Fe3O4固体粉末。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中所述固体粉末混合物中，超顺磁性纳米粒与荧光纳米晶体的质量比为1:2~10:1之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中所述HES溶液的配制方法是将HES与超纯水按1:10质量比混合，搅拌至完全溶解即可。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述荧光纳米晶体La0.8Tb0.2F3的制备方法包括以下步骤：
(1)将含有0.025mol/LTb3+和0.1mol/LLa3+的水溶液、乙醇、油酸按1:1:0.035的体积比进行混合，并搅拌均匀;
(2)配制0.52mol/L的NH4F水溶液，逐滴滴加到步骤(1)所得溶液中，最终使F-与Tb3+的摩尔比为15:1；70℃反应1小时后冷却至室温;
(3)离心去上清，用过量乙醇和水交替洗涤3次后，真空干燥后得到荧光纳米晶体La0.8Tb0.2F3。
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| 稀土掺杂氟化物多色发光颗粒的制备及其性质研究;张丹丹等;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20120415;第17页第3-9行 * |
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