CN104212774A - 一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用 - Google Patents

一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用 Download PDF

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王如峰
邓琛
陈超
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Abstract

本发明公开了一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用，利用正向引物P1:5'ATGGATTTAGGGGTTCACT3'；反向引物P2:5'TCAGAATTTGATGTCATCTGCAG3'以竹节参cDNA文库为模板进行扩增，可获得竹节参鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQIDNO.1所示。通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，可提高竹节参中总皂苷的含量，为竹节参三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。

Description

一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及竹节参中鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase)基因的克隆和应用，
背景技术
竹节参(Panax japonicus C.A.Mey)属于五加科人参属(Panax L.)植物是传统的名贵中药材之一，具有较高的药用价值，如增强人体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保护心肌等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有少量达玛烷型四环三萜类皂苷。
竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值,目前中国竹节参的野生资源近于濒危，人工栽培药材生长周期长，造成目前市场供不应求的现状。通过研究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶，实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控，进一步实现三萜皂苷类化合物的规模生产，以提供医药市场的需求。
鲨烯环氧酶(Squalene epoxidase，SQE)基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用。SQE通过在C-C之间插入1个氧原子催化角鲨烯生成中间体单氧态角鲨烯，此中间体在强光和紫外线的作用下可生成2，3-氧化角鲨烯。而2，3-氧化角鲨烯是三萜类化合物——植物甾醇、达玛烯二醇、环阿乔醇的前体，其合成直接关系竹节参中三萜类皂苷的含量，目前，SQE被公认为是三萜类化合物生物合成途径中的关键酶之一。
本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000进行竹节参全株的转录组测序及De novo拼接。分析找到竹节参中编码鲨烯环氧酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能，为竹节参三萜皂苷化合物的生物合成提供理论基础。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参鲨烯环氧酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中三萜皂苷化合物的生物合成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控竹节参中三萜皂苷化合物生物合成的关键点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。该基因是人参属植物活性成分三萜皂苷合成的关键基因，进而为人参属植物中三萜皂苷含量的提高提供技术手段。
本发明的第二个目的是提供一种竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。
本发明的最后一个目在于提供一种竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因在提高竹节参中总皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，可提高竹节参中总皂苷的含量。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因(以下称为PJSQE基因)，其制备方法如下：
利用正向引物P1:5'ATGGATTTAGGGGTTCACT3'；反向引物P2:5'TCAGAATTTGATGTCATCTGCAG3'以竹节参cDNA文库为模板进行扩增，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸90s，40个循环后，72℃延伸10min。
最终获得了PJSQE基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。
一种竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因或竹节参鲨烯环氧酶在提高竹节参总皂苷含量中的应用，其应用过程如下：
将竹节参竹节参鲨烯环氧酶蛋白质(SEQ ID NO.2所示)对应的PJSQE基因(优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)通过农杆菌介导的遗传转化转入竹节参，可获得高总皂苷含量的的转基因植株。
本发明的所要保护的内容还包括：
编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；优选SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
含有本发明的竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于一些常用的植物表达载体，例如：pBI121，pCAMBIA1301。
含有本发明的竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因全序列或其ORF序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。包括但不限于烟草细胞大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参细胞或竹节参发根细胞。
本发明的竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体。包括但不限于烟草、酵母、拟南芥、竹节参发根。
本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
利用本发明的竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所提供的竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因是首次从竹节参植物中克隆制备所得，利用本发明的技术可以对竹节参等含有同类化合物的药用植物进行基因工程改造，通过转基因来提高植物体内的三萜皂苷化合物的含量。竹节参鲨烯环氧酶(PJSQE)基因可参与竹节参三萜皂苷化合物的生物合成，因此本专利为竹节参三萜皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。
本发明利用转基因技术得到了总皂苷含量增加的高产株，为皂苷的的工业化生产提供了技术支撑。
附图说明
图1为竹节参总RNA电泳图。
图2为PJSQE功能域预测分析。
图3为PJSQE系统进化树。
图4为表达载体pYEUra3-PJSQE构建示意图。
图5为酶促反应产物薄层色谱分析示意图。
具体实施方式
本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。
实施例1：
竹节参转录组测序及数据分析
1、样品采集
竹节参植株来源于湖北恩施Panax japonicus C.A.Mey，分别取根茎、叶、花，果实置液氮中速冻后，在-80℃冰箱中冷冻保存备用。
2、竹节参总RNA的分离和检测
对-80℃保存的各类样本于液氮中充分研磨，然后采用优化的Trizol法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行，加入一定浓度的PVP溶液(聚乙烯吡咯烷酮)，并适当加大β-巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和β-巯基乙醇后，采用高浓度NaAc溶液析出RNA，DNase去除残留DNA完成RNA的纯化。用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性(图1),用Nanodrop2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度，RNA样本置于-80℃冰箱备用。
3、转录组测序(RNA-Seq)
用oligo(dT)的磁珠从总RNA中富集mRNA，接加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加poly(A)并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小，PCR扩增构建测序文库，利用第二代Solexa HiSeq2000进行RNA测序，及De novo拼接。
4、候选基因初步筛选
通过GO注释，Blast比对分析以及MEGA5.0构建系统发育树(图3)等软件分析初步筛选到竹节参中编码鲨烯环氧酶的候选基因。
实施例2：
竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆
利用正向引物P1:5'ATGGATTTAGGGGTTCACT3'；反向引物P2:5'TCAGAATTTGATGTCATCTGCAG3'以竹节参根茎cDNA文库为模板进行扩增，PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸90s，40个循环后，72℃延伸10min将扩增好的基因链接到克隆载体pMD18-T上并转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α中，步骤如下：
a)从-80℃超低温冰箱中取100μL感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；
b)加入5μL连接产物，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min；
c)42℃热激90s，迅速置冰上5min；
d)向EP管中加入1mL LB液体培养基(不含抗生素)，37℃200rpm45min；
e)摇菌后取100μL菌液涂布于含抗生素的平板上，37℃培养箱过夜；
f)挑取单菌落于4mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜选取阳性克隆送样测序。
至此获得了竹节参鲨烯环氧酶基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。
实施例3：
PJSQE基因的生物信息学分析
本发明涉及的竹节参鲨烯环氧酶(SQE)基因全长为1923bp，其序列为SEQ ID NO.1所示，其中开放读码框位于1～1923bp，编码的蛋白质序列为SEQ ID NO.2所示。将拼接分析好的鲨烯环氧酶全长序列在NCBI数据库中进行Blast。该基因在具有典型的SE superfamily结构域，如图2。
实施例4：
PJSQE基因功能的研究
1、表达载体的构建
依据竹节参SQE基因全长序列(SEQ ID NO.1)的ORF，设计扩增完整开放阅读框的引物，分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ，利用正向引物P1：5'GGATCCATGGATTTAGGGGTTCACTCACA3'；反向引物P2：5'CTCGAGTCAGAATTTGATGTCATCTGCAG3'进行PCR反应，进行琼脂糖凝胶电泳，30min后照相，观察胶图，扩增片段为1935bp，TA克隆，提取质粒。以BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切扩增产物2h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶在37℃下酶切pYEUra3载体2h，进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用试剂盒回收大小约6170bp的片段。
二者经连接酶在16℃连接过夜。转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒，进行限制性内切酶酶切电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒pYEUra3-PJSQE用于表达转化。该表达载体命名为pYEUra3-PJSQE(图4)。
2、蛋白的诱导表达
以pYEUra3-PJSQE质粒转化部分酶解酵母宿主菌AB1380，培养5d后筛选阳性酵母于2ml含2％葡萄糖的USM培养基上，4-5d后挑取单克隆2ml USM液体培养基中，30℃剧烈震荡培养过夜。5000rpm离心培养5min，弃上清，以含2％葡萄糖的USM液体培养基稀释20倍，30℃剧烈震荡培养24h。提取培养细胞总蛋白。选取高表达转化子以50ml含2％葡萄糖的USM液体培养基30℃剧烈震荡培养20h后，接种到1L不含葡萄糖的USM液体培养基30℃剧烈震荡培养40h，回收菌体，分离微粒体，纯化蛋白。
3、酶促反应鉴定
体外酶促反应体系总体积为300ul，其中含有67mM Tris-HCL(pH7.5)，1mM EDTA，1mM NADPH，0.1mM FAD，0.1％Triton X-100，0.075％Tween80和[3H]鲨烯(20000dpm)加入纯化的表达蛋白，然后置于75℃孵育60min，添加0.3ml10％的甲醇氢氧化钾终止反应，用2ml的环己烷萃取2次后在氮气流下使反应物浓缩。用硅胶薄层色谱法进行分析(Art558.Merck，Darmstadt，Germany)，然后在苯：乙酸乙酯99.5:0.5中展开。用液体闪烁计数器计量放射性活度(TRI-CARB2500RT，Packard Instrument Co，Downers Grove，IL)。如图5，第一条泳道为空白组，第二条没有添加鲨烯环氧酶抑制剂AM01618，第三条添加了30mM的鲨烯环氧酶抑制剂AM01618，第四条泳道为标准品。空白组和添加了鲨烯环氧酶抑制剂的泳道都没有检测出2,3-氧化鲨烯，只有第三天泳道有2,3-氧化鲨烯，说明此基因编码的蛋白质发挥了催化作用。
实施例5：
PJSQE在竹节参中进行真核表达及转基因竹节参发根中总皂苷含量的测定：
转基因用的受体材料采自湖北恩施Panax japonicus C.A.Mey。
含目的基因(竹节参鲨烯环氧酶基因)的表达载体的构建：根据竹节参鲨烯环氧酶基因的全长cDNA序列(SEQ ID NO.1)，在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点(视选用的载体而定)，以便构建植物表达载体。
具体步骤如下：
以实施例2中获得的含有PJSQE基因编码区的pMD18-T质粒为模版，在上述构建的正向引物前引入BamH I酶切位点，在反向引物前引入Sac I酶切位点，正向引物P1：5'GGATCCATGGATTTAGGGGTTCACTCACA3'；反向引物P2：5'GAGCTCTCAGAATTTGATGTCATCTGCAG3'进行PCR扩增后，TA克隆，提取质粒。以BamH I和Sac I酶切扩增产物4h，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和SacI酶在37℃下酶切pBI121载体4h，在16℃下利用T4连接酶连接产物过夜，在保证阅读框正确的前提下将竹节参PJSQE基因的编码区克隆到植物表达载体pBI121上，获得表达载体pBI-PJSQE。将酶切鉴定好的表达载体pBI-PJSQE转入农杆菌中，遗传转化竹节参。
利用发根农杆菌介导的人参的遗传转化，所需的材料和操作步骤如下：
1)发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出，用YEB培养基传代2次，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，28℃培养过夜。
2)取竹节参细嫩叶片，洗净后置于70％酒精中浸泡1min，弃酒精，加入2％次氯酸钠消毒10min，期间摇动数次，弃去消毒液，用无菌水漂洗4～5次，置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将竹节参叶片切成5mm×5mm小片，置于预培养固体培养基上，在(23±1)℃暗箱培养箱中预培养2d。
3)经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬，置于4℃中2h后取出。将预培养过的竹节参叶片浸泡于1/2MS重悬的菌液中5min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中，(23±1)℃黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养，每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素1/2MS培养基中培养。
4)把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ml无激素1/2MS液体培养基的500ml三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养25d后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存-80℃中备用。
阳性株利用常规real-time PCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如下：
提取具有卡那霉素抗性的转化珠节参植株的总RNA，利用Takara反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，半定量所用引物为珠节参鲨烯环氧酶基因特异引物(正向引物5’-GCTCCCTATCCTACTCCC-3’；反向引物5’-AATCTAACTCCAGCCCAC-3’)，反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸45秒，25个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。用植物beta-actin基因做为内参基因(正向引物5'-GGAAAAGATTTGGCATC-3'，反向引物5'-GGGCGTAACCCTCATA-3’)。对竹节参的野生型和转化系在相同生长状态下进行目的基因表达水平的分析。最终选择相对于野生型植株，基因表达量的Fold-change值高于4倍以上(P<0.01)的转化植株作为阳性株进行后续的实验。
5)含竹节参鲨烯环氧酶基因的转基因发根的总皂苷类化合物含量测定
根据2010版《中华人民共和国药典》，人参属植物中的皂苷都为三萜皂苷。
竹节参发根中总皂苷含量的检测可使用本领域的常规技术，本发明具体采用以下步骤：
参考袁丁等(华西药学杂志，2008,23(6)：692-694)的总皂苷待测溶液处理方法及检测方法，采用香草醛-高氯酸比色法，对表达竹节参PJSQE基因的转基因发根系进行竹节参总皂苷的含量测定，以非转基因的竹节参发根系为对照。标准品为人参皂苷Re，购自中国药品生物制品检定所(批号：110754-200421)。对照组和转基因组各检测20株，测定结果发现，在过表达竹节参PJSQE基因的转基因竹节参发根中竹节参总皂苷含量比非转基因对照组提高了1.8倍(P<0.05)。由此证明，竹节参鲨烯环氧酶基因对促进竹节参总皂苷含量的提高有显著作用，竹节参鲨烯环氧酶基因可用于利用转基因技术提高竹节参总皂苷含量的研究和产业化中，具有一定的应用前景。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>   张绍鹏 陈平 杨涛 朱闻君 宋佳 孙巧 伍翀 王如峰 邓琛 陈超 郑用琏
 
<120>  一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用
 
<130>  一种竹节参鲨烯环氧酶基因及其应用
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
<210>  1
<211>  1923
<212>  DNA
<213>  竹节参
 
<400>  1
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atcagcagca ctgaggtacg ttgtttggtc gatgtacctg gtcaaaagct tccttctctt   1200
 
gctaatggtg atttggccaa ctatttgaag accatggtag ctccccagat tccacccgag   1260
 
cttcatgatg ccttcatagc cgccattgat aaagggaata taagaacaat gccgaataga   1320
 
agcatgccgg ctgctcccta tcctactccc ggagccctat taatgggtga tgctttcaat   1380
 
atgcgtcacc ctttaactgg gggaggaatg acagtagcac tgtctgacat tgtagtgttg   1440
 
cggaatcttc ttaagcccct cggtgacatg aatgatgcag attctctttg caaatatctt   1500
 
gagtccttct acacattgcg taagccagtg gcatctacaa taaatactct ggcaggggct   1560
 
ttatacaagg tgttttgtgc ttctcccgat caagcaagga aagaaatgcg tgaagcatgt   1620
 
tttgactatt tgagcctcgg aggtgtttgt tcaacaggac ccgtggctct actctctggt   1680
 
cttaaccctc ggccactgag cttagtcctc catttctttg cagtggctat atatggagtt   1740
 
ggtcgtatgt tattaccatt tccaacacct aaacgcttgt gggctggagt tagattaata   1800
 
tcagctgctt caggaataat ctttcccatc atacaggcag aaggtgtaag gcaaatgttt   1860
 
tttcctgcaa ctgtaccagc atattattat cgagctcctc ctgcagatga catcaaattc   1920
 
tga                                                                 1923
 
 
<210>  2
<211>  640
<212>  PRT
<213>  竹节参
 
<400>  2
 
Met Asp Leu Gly Val His Ser Thr Gln Ile Lys Ile Lys Ile Lys Met
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Leu Gly Leu Gly Val Arg Ser Pro Thr Tyr Pro Ser Phe Ser Phe
            20                  25                  30         
 
 
His Pro Thr Phe Leu Lys Pro Thr Lys Ser Arg Pro Pro Arg Ala Arg
        35                  40                  45             
 
 
Ile Arg Ala Gly His Thr Lys Leu Asn Lys Ser Thr Asn Thr Ile Thr
    50                  55                  60                 
 
 
Ile Asn Asn Asn Ser Thr Glu Val Glu Arg Lys Arg Gln Gln His Gln
65                  70                  75                  80 
 
 
Asp Leu Thr Val Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Thr Gln Phe
                85                  90                  95     
 
 
Tyr Ser Tyr Thr Asn Lys Met Gly Met Met Met Asp Tyr Ile Ala Gly
            100                 105                 110        
 
 
Thr Leu Phe Ala Phe Leu Leu Gly Phe Ser Phe Leu Tyr Ile Leu Gly
        115                 120                 125             
 
 
His Arg Asn Tyr Thr Ile Ala Asn Ser Lys Lys Lys Asn Gln Lys Gln
    130                 135                 140                
 
 
Lys Ala Thr Ala Cys Thr Ser Phe Glu Thr Arg Asn Asp Leu Asn His
145                 150                 155                 160
 
 
Gly Asp Asn Pro Arg Ala Asn Gln Ser Asp Ala Asp Val Ile Ile Val
                165                 170                 175    
 
 
Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Ala His Thr Leu Gly Lys Asp
            180                 185                 190        
 
 
Gly Arg Arg Val His Val Ile Glu Arg Asp Leu Thr Glu Pro Asp Arg
        195                 200                 205            
 
 
Ile Val Gly Glu Leu Leu Gln Pro Gly Gly Tyr Leu Lys Leu Ile Glu
    210                 215                 220                
 
 
Leu Gly Leu Glu Asp Cys Val Glu Glu Ile Asp Ala Gln Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
 
 
Gly Tyr Ala Leu Phe Lys Asp Gly Arg Asn Thr Lys Leu Ser Tyr Pro
                245                 250                 255    
 
 
Leu Glu Lys Phe His Ser Asp Val Ser Gly Arg Ser Phe His Asn Gly
            260                 265                 270        
 
 
Arg Phe Ile Gln Arg Met Arg Glu Lys Ala Ala Thr Leu Ser Asn Val
        275                 280                 285            
 
 
His Leu Glu Gln Gly Thr Val Ser Ser Leu Leu Glu Glu Asn Gly Thr
    290                 295                 300                
 
 
Ile Lys Gly Val Gln Tyr Lys Thr Lys Thr Gly Gln Asp Val Lys Ala
305                 310                 315                 320
 
 
Tyr Ala Pro Leu Thr Ile Val Cys Asp Gly Cys Phe Ser Asn Leu Arg
                325                 330                 335    
 
 
Arg Ser Leu Phe Lys Pro Lys Val Asp Val Pro Ser Cys Phe Val Gly
            340                 345                 350        
 
 
Leu Ile Leu Glu Asn Cys Lys Leu Pro His Pro Asn His Gly His Val
        355                 360                 365            
 
 
Ile Leu Ala Asp Pro Ser Pro Ile Leu Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Thr
    370                 375                 380                
 
 
Glu Val Arg Cys Leu Val Asp Val Pro Gly Gln Lys Leu Pro Ser Leu
385                 390                 395                 400
 
 
Ala Asn Gly Asp Leu Ala Asn Tyr Leu Lys Thr Met Val Ala Pro Gln
                405                 410                 415    
 
 
Ile Pro Pro Glu Leu His Asp Ala Phe Ile Ala Ala Ile Asp Lys Gly
            420                 425                 430        
 
 
Asn Ile Arg Thr Met Pro Asn Arg Ser Met Pro Ala Ala Pro Tyr Pro
        435                 440                 445            
 
 
Thr Pro Gly Ala Leu Leu Met Gly Asp Ala Phe Asn Met Arg His Pro
    450                 455                 460                
 
 
Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Leu Ser Asp Ile Val Val Leu
465                 470                 475                 480
 
 
Arg Asn Leu Leu Lys Pro Leu Gly Asp Met Asn Asp Ala Asp Ser Leu
                485                 490                 495    
 
 
Cys Lys Tyr Leu Glu Ser Phe Tyr Thr Leu Arg Lys Pro Val Ala Ser
            500                 505                 510        
 
 
Thr Ile Asn Thr Leu Ala Gly Ala Leu Tyr Lys Val Phe Cys Ala Ser
        515                 520                 525            
 
 
Pro Asp Gln Ala Arg Lys Glu Met Arg Glu Ala Cys Phe Asp Tyr Leu
    530                 535                 540                
 
 
Ser Leu Gly Gly Val Cys Ser Thr Gly Pro Val Ala Leu Leu Ser Gly
545                 550                 555                 560
 
 
Leu Asn Pro Arg Pro Leu Ser Leu Val Leu His Phe Phe Ala Val Ala
                565                 570                 575    
 
 
Ile Tyr Gly Val Gly Arg Met Leu Leu Pro Phe Pro Thr Pro Lys Arg
            580                 585                 590        
 
 
Leu Trp Ala Gly Val Arg Leu Ile Ser Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe
        595                 600                 605            
 
 
Pro Ile Ile Gln Ala Glu Gly Val Arg Gln Met Phe Phe Pro Ala Thr
    610                 615                 620                
 
 
Val Pro Ala Tyr Tyr Tyr Arg Ala Pro Pro Ala Asp Asp Ile Lys Phe
625                 630                 635                 640
 
 

Claims (7)

1.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
4.含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体。
5.含有权利要求4所述植物表达载体的转基因植株。
6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植物总皂苷含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高竹节参总皂苷含量中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1676608A (zh) * 2004-03-30 2005-10-05 上海人类基因组研究中心 一种新的马尔尼菲青霉菌erg1基因、其编码蛋白及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL: "ACESSION NO.KC337054", 《EMBL》 *
UNIPROT: "KB-M4WS60(M4WS60_9APIA),", 《UNIPROT》 *
胡薇等: "人参鲨烯环氧酶基因的克隆与原核表达", 《西北农林科技大学学报 自然科学版》 *

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