CN104208056A - 盐酸左旋多巴甲酯在治疗假体周围骨溶解中的药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了盐酸左旋多巴甲酯（LDME）在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，盐酸左旋多巴甲酯化学结构式如下：。本发明提供的一种盐酸左旋多巴甲酯（LDME）在治疗TJA后PPO的药物用途，为预防和治疗假体周围骨溶解提供了一种新途径。

Description

盐酸左旋多巴甲酯在治疗假体周围骨溶解中的药物用途

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，涉及盐酸左旋多巴甲酯的药物用途，具体涉及盐酸左旋多巴甲酯在治疗假体周围骨溶解中的药物用途。 

背景技术

假体周围骨溶解（Peri-prosthetic osteolysis, PPO）是关节置换术（total joint arthroplasty, TJA）的重要并发症，是限制人工假体使用寿命的重要因素。有研究报道，在假体置换10-20年后，10%-15%的人工关节将发生假体失效，超过66%的髋关节翻修和近50%的膝关节翻修是由PPO引起。已知人工假体长期磨损产生微小颗粒引起的生物学反应是引起PPO的主要原因，但我们对于PPO发生的具体机制仍不明确，各种非手术治疗的疗效也并不显著，大多数患者需行翻修手术。由于翻修术的疗效低于初次手术，而且手术创伤大、价格昂贵，有些患者甚至需要经历2-3次翻修术，因此如何有效地防治PPO已成为骨科领域的一个重要课题。 

盐酸左旋多巴甲酯（LDME），化学名称为L-3,4-二羟基苯基丙氨酸甲酯盐酸，其分子式为C10H13NO4.HCL，分子量为247.68，CAS No. 是1421-65-4，结构如式（Ⅰ）所示： 

LDME是左旋多巴的前体药物，水解为左旋多巴后，通过血脑屏障进入中枢，经多巴脱羧酶作用转化成多巴胺，临床上用于改善帕金森病症状。LDME易溶于水，易制成各种口服剂型和注射剂给药，吸收快，7-8分钟血药浓度达峰值，比左旋多巴起效快，疗效肯定。近几年动物实验研究表明LDME对弱视也有治疗作用。目前尚无研究LDME与关节置换术后假体周围骨溶解的关系，本发明由此而来。

发明内容

要解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种盐酸左旋多巴甲酯（LDME）的新的药物用途，特别是治疗TJA后PPO的药物用途，为预防和治疗假体周围骨溶解提供了一种新途径。 

技术方案：针对上述问题，本发明公开了盐酸左旋多巴甲酯（LDME）在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，盐酸左旋多巴甲酯化学结构式如下： 

优选的，所述的假体周围骨溶解为人工关节置换术后发生的假体周围骨溶解。

优选的，所述药物组合物包含药学上有效剂量的盐酸左旋多巴甲酯和药学上可接受的载体。 

本发明中，可将本发明中的LDME采用本领域常规的方法制备成适用于胃肠道或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将LDME制备成适用于胃肠道的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊剂或控释、缓释制剂。在本发明中LDME药物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式或制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1%～99%，优选为10%～90%；本发明所述的药学上可接受的载体为组合物中制剂使用的辅料，可采用本领域常规的辅料，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。 

本发明中，组合物的制备方法没有限制，LDME直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成制剂，然后按照本领域常规的方式进行包装，与其它辅料混合制成制剂。本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。 

  

盐酸左旋多巴甲酯（LDME），其分子式为C₁₀H₁₃NO₄.HCL，化学名称为L-3,4-二羟基苯基丙氨酸甲酯盐酸，分子量为247.68，CAS No. 是1421-65-4，来源于Sigma-Aldrich Co.LLC.公司。

本发明技术方案通过腹腔注射给药法来研究LDME能否对磨损颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解有治疗作用，同时测定骨保护蛋白（OPG）、核因子κ B受体活化因子配体（RANKL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等炎症性破骨细胞活化指标来研究这种作用与炎症性破骨细胞活化的关系，以期为探讨人工假体置换术后假体周围骨溶解的作用机制及治疗提供更多的理论依据。 

本发明人通过80只C57BL/J6小鼠被随机分为Control组（A组）、Ti组（B组）、LDME低剂量治疗组（C组）和LDME高剂量治疗组（D组），每组20只。各组动物均在全麻下行常规手术操作，Ti组和LDME治疗组的动物均在小鼠颅骨表面置入50μl 已配制的40%Ti颗粒PBS液（20mg/只），而Control组给予50μl的PBS。LDME治疗组从术后当天开始每天腹腔注射0.2ml LDME/生理盐水溶液（其中低剂量组和高剂量组给药剂量分别为25mg/kg和100mg/kg），Control组和Ti组每天注射0.2ml生理盐水。各组于术后14天处死动物取颅骨行micro-CT及组织学检测，测定颅骨骨密度、骨体积、骨体积分数、骨溶解面积、颅骨厚度、骨膜厚度以及成熟破骨细胞数量，分析颅骨骨溶解程度；同时应用ELISA方法检测RANKL、OPG、TNF-α和IL-1β的浓度。采用单因素方差分析对各组数据进行统计学分析。 

有益效果：本发明结果表明，Ti组与Control组相比，颅骨表面有较多的陷窝，骨密度、骨体积、骨体积分数明显减少（**p<0.01）；骨膜内细胞数量增多，骨膜明显增厚（**p<0.01），颅骨矢状缝边缘有明显的虫蚀样变化，骨溶解面积显著增加（**p<0.01）；颅骨厚度变薄（**p<0.01），成熟破骨细胞数量增多（**p<0.01）；LDME治疗组中颅骨表面陷窝数明显减少，骨密度、骨体积、骨体积分数明显增加，骨溶解程度明显减轻，骨膜增厚程度减轻，成熟破骨细胞数量减少，与Ti组比较差异有统计学意义（#p<0.05）；在高剂量治疗组作用更明显，与低剂量组相比，差异有统计学意义（$p<0.05）。ELISA结果显示，在Control组RANKL的浓度较低，OPG的含量很高；在Ti组，RANKL的含量急剧增加而OPG的含量下降明显，与Control组相比，**p<0.01；在LDME治疗组，RANKL的含量随着LDME浓度的增加显著下降，而OPG的含量明显增加。骨溶解后的LDME治疗降低了颅骨局部TNF-α和IL-1β的表达。Control组小鼠颅骨体外培养24h后，ELISA检测结果显示TNF-α和IL-1β的浓度低。相对于Control组，Ti加入后，小鼠颅骨上述两种炎症因子的含量显著增加（**p<0.01）；LDME治疗后，TNF-α和IL-1β的含量明显降低，与Ti组相比，#p<0.05；LDME高剂量与低剂量治疗组比较，炎症因子的含量进一步降低，$p<0.05，但含量仍高于Control组，*p<0.05。 

该动物实验证实盐酸左旋多巴甲酯（LDME）对人工假体置换术后假体周围骨溶解有一定的防治作用，可使磨损颗粒诱导的炎症性破骨细胞活化得到抑制，可作为人工假体置换术后假体周围骨溶解的药物干预的一种新手段。 

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：本发明通过应用钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型，观察盐酸左旋多巴甲酯（LDME）对磨损颗粒诱导骨溶解的治疗作用，并评估RANKL/OPG信号通路的改变，了解炎症因子TNF-α和IL-1β的表达，分析骨溶解的各项指标，从而阐明LDME干预人工假体置换术后假体周围骨溶解的作用机制。人工假体长期磨损产生的微小颗粒能上调RANKL的表达，降低OPG的含量，活化RANKL通路，激活炎症因子诱导炎症反应，引起破骨细胞活化，可能是引起假体周围骨溶解的重要机制，而LDME通过抑制此通路，减轻炎症反应，抑制破骨细胞活化，这可能是LDME对人工假体置换术后假体周围骨溶解防治作用的重要机制之一。 

附图说明

图1为micro-CT扫描各实验组小鼠颅骨的二维图像，A为Control组，B为Ti组，C为LDME低剂量治疗组，D为LDME高剂量治疗组。 

图2为各实验组小鼠颅骨骨密度（BMD）、骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）的检测值。 

图3为各实验组小鼠颅骨HE染色结果，A为Control组，B为Ti组，C为LDME低剂量治疗组，D为LDME高剂量治疗组。 

图4为各实验组小鼠颅骨骨膜厚度（PT）、颅骨厚度（BT）、颅骨骨溶解面积（ESR）的检测值。 

图5为各实验组小鼠颅骨TRAP染色结果和各实验组小鼠颅骨TRAP染色阳性细胞计数结果，A为Control组，B为Ti组，C为LDME低剂量治疗组，D为LDME高剂量治疗组。 

  

具体实施方式

一、            材料与方法 

1、  材料

1.1    试剂及实验设备

1.1.1        主要药品及试剂

盐酸左旋多巴甲酯（LDME），TRAP染色试剂盒，购自Sigma，美国；多聚甲醛、PBS、DAB显色剂、苏木素、伊红、无水乙醇、蒸馏水、10%水合氯醛。钛颗粒购自美国Johnson Matthey chemicals公司 ( catalog #00681; Ward Hill, Massachusetts )；RANKL、OPG、TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附试验检测试剂盒，购自Biosource，美国； 

1.1.2        主要仪器

Micro-CT（SkyScan 1176，比利时）、石蜡切片机（Leica 2135，德国）、烤片机（Leica 1120，德国）、石蜡包埋机（BMJ-Ⅱ，中国，常州）、Axiovert 40C光学显微镜（Zeiss，德国）、酶标仪（Biotec，美国）、手术器械一套等。

1.2    实验动物 

健康C57BL/J6小鼠80只，雄性，体重19～22g，8～10周龄，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。喂养条件如下：五只一笼，室温18～20℃，湿度50～60%，通风良好，自由摄食进水。

2、  实验方法 

2.1 Ti颗粒的处理

93%的颗粒直径<20μm。为去除内毒素，将颗粒溶于体积分数75%乙醇，常温下振荡1h，共4次，100%乙醇浸泡过夜，等渗盐水洗涤3次，4℃保存备用。

2.2 实验动物分组 

C57BL/J6小鼠80只，随机分为以下4组：

（1）    Control组：20只，操作与Ti组相同，仅将置入的钛颗粒改为等量的生理盐水，术后每天腹腔注射0.2ml生理盐水，2周后处死；

（2）    Ti组：20只，在小鼠颅骨表面置入20mg钛颗粒，术后每天腹腔注射0.2ml生理盐水，2周后处死；

（3）    L组：20只，为LDME低剂量治疗组，在小鼠颅骨表面置入20mg钛颗粒后，每天腹腔注射LDME（0.2ml，25mg/kg），2周后处死；

（4）    H组：20只，为LDME高剂量治疗组，：在小鼠颅骨表面置入20mg钛颗粒后，每天腹腔注射LDME（0.2ml，100mg/kg），2周后处死。

2.2 小鼠颅骨骨溶解模型的制备 

本发明采用钛颗粒（Ti）诱导的小鼠颅骨骨溶解模型来模拟TJA术后假体周围骨溶解发生的病理过程（Kaar SG, et al. Rapid repair of titanium particle-induced osteolysis is dramatically reduced in aged mice. J Orthop Res. 2001; 19(2):171-8.）。实验小鼠用10%水合氯醛500mg/kg腹腔内注射麻醉。颅顶皮肤去毛、安尔碘消毒3遍后, 在颅顶处作一约1cm正中矢状切口，暴露1.0cm×1.0cm骨膜， 植入准备好的50μl 已配制的40%Ti颗粒PBS液（20mg/只）。皮肤以4-0缝线缝合。所有手术均在在同一天完成, 手术期间使用无菌润滑剂眼药膏保护小鼠眼睛。

2.3 标本采集 

各组动物均与术后2周，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧外固定于小鼠操作架上，开胸暴露心脏，经心尖向左心室插管灌注，剪开右心耳，结扎降主动脉后开放生理盐水冲洗至右心耳流出清凉液体，再以4%中性多聚甲醛200～300ml灌注，至动物四肢抽搐、变硬。灌注完毕后迅速取出颅骨，剔除颅底附着软组织。每组中10个颅骨置于4%多聚甲醛固定24h后，先行micro-CT检测，再以10%EDTA脱钙2周，石蜡包埋，行组织学检测；另外10个颅骨冷冻保存，行分子生物学检测。

2.4 micro-CT检测 

小鼠颅骨固定24h后，行micro-CT扫描。扫描参数：分辨率18μm，电压80kV；电流100μA；每次曝光时间为100ms；0.9°/8 images。采用Wedemeyer C方法（Wedemeyer C, et al. Particle-induced osteolysis in three-dimensional micro-computed tomography. Calcif Tissue Int. 2007; 81(5): 394-402.），选定一圆柱形感兴趣区域（ROI；直径3mm，高度1mm），应用Micro-CT图像分析软件对图像进行3D分析，记录ROI颅骨的骨密度(BMD, mg/mm²)，骨体积（BV, mm³），骨体积与组织体积比值(BV/TV)。

2.5组织学染色 

颅骨经10%EDTA脱钙后，常规石蜡包埋。取颅骨水平位，于颅骨矢状缝处连续切片，片厚5μm。分别行HE和TRAP染色。

2.5.1 HE染色步骤： 

（1）    石蜡切片经二甲苯（10min×2次）脱蜡后，依次经过100%、100%、95%、90%，85%的乙醇至水，每道10min；

（2）    蒸馏水冲洗3min，苏木素溶液染色5min，自来水冲洗2min；

（3）    1％盐酸酒精溶液分化30s，自来水冲洗1min；

（4）    10％氨水溶液中反蓝30s，自来水冲洗1min；

（5）    l％伊红溶液复染5min，自来水冲洗1min；

（6）    常规脱水、透明、封片。

光镜下观察颅骨的形态学变化。用显微镜计算机图像分析系统（Image-Proplus 6.0），参照von Knoch M法（von Knoch M, et al. Decrease in particle-induced osteolysis in obese (ob/ob) mice. Biomaterials. 2004; 25: 4675-81），计算骨膜厚度（Periosteum thickness, PT）、颅骨厚度（Calvarial bone thickness, BT）以及骨溶解面积（Bone eroded surface，BES）。 

2.5.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色： 

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)为破骨细胞所特有，分布于破骨细胞胞浆。在含酒石酸盐的酸性条件下，TRAP能将萘酚ASBI磷酸盐水解，产生萘酚ASB1，后者立即与染液中的六偶氮副品红结合，在酶活性部位形成不溶性红色染料。通过观察这种染料可间接了解酸性磷酸酶活性。TRAP染色被用来鉴别破骨样细胞。染色采用TRAP染色试剂盒(Sigma 387A) 。

2.5.2.1试剂配制： 

备2个试管，一个加0.5ml fast Garnet GBC Base Solution(副品红)，另一个加0.5ml Sodium Nitrite Solution(亚硝酸钠)，混合30s，静置2min；备2个100ml烧杯，标记A，B，配制TRAP染液(pH5.2)：

	A ml	B ml
			37度蒸馏水	45	45
重氮化的副品红	1.0	1.0
			萘酚AS-BI磷酸盐溶液	0.5	0.5
醋酸溶液	2.0	2.0
			酒石酸溶液	-	1.0

2.5.2.2 染色步骤：

（1）    石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次3min

（2）    将准备好的标本切片在丙酮溶液中固定30s；

（3）    蒸馏水冲洗，不让其干；

（4）    TRAP染液37度孵育1 h，避光；

（5）    蒸馏水冲洗3次，苏木素复染2min，PBS冲洗反蓝。

TRAP染色阳性结果为紫红色点、片状区域，参照Nich C法（Nich C, et al. Role of direct estrogen receptor signaling in wear particle-induced osteolysis. Biomaterials. 2013; 34(3): 641-50.），以颅骨矢状缝为中心，20×光镜视野下计数成熟破骨细胞数量。 

2.6 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测RANKL、OPG、TNF-α和IL-1β 

将颅骨以1个/孔放于6板中培养，每孔加入2mLDMEM培养基，含青霉素/链霉素各100U，放入CO--₂培养箱37℃、5%CO--₂、95%湿度条件下，浸泡24h后收集培养液，4℃条件下，以3000 r／min离心培养液 5min，取上清液置于-80℃冰箱用备用。ELISA检测上清液中RANKL、OPG、TNF-α和IL-1β。

参照ELISA试剂盒说明书，具体步骤如下： 

（1）    设立标准孔8孔,每孔中先各加入样品稀释液100 ul,第一孔再加标准品100 ul,混匀后用移液器吸出100 ul,移至第二孔，如此反复作对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔中吸出100 ul弃去,使之体积均为100 ul。第8孔为空白对照。

（2）    加样:待测样品孔中每孔各加入上清液100ul，将反应板置于37℃×120 min； 

（3）    用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上扣干，每孔中加入第一抗体工作液50ul，将反应板充分混匀后置37 ℃×60 min。

（4）    用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上扣干，每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置于37 ℃ 120 min； 

（5）    用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次,向滤纸上扣干，每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗处反应5~10 min；

（6）    每孔中加入50ul终止液混匀，用酶标仪在450nM处测吸光值；

（7）    以标准品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线；根据标准曲线公式换算出上清液中检测指标含量。

2.7 统计学分析 

结果数据采用SPSS11.0统计软件分析，数据用均数±标准差（）表示，多组比较选用单因素方差分析（one-way ANOVA 检验），两两比较在总体方差齐的条件下，选用LSD及Dunnett-t法进行分析。p<0.05为差异有统计学意义。

二、            结果 

1.      实验动物一般情况

各组动物均在术后30～60min内苏醒，可在笼内自由活动，正常进食，精神状态无明显变化。无切口无红肿、渗液等炎性反应，均一期愈合。实验过程中无动物死亡。

2.       micro-CT检测 

运用micro-CT扫描实验小鼠颅骨的二维图像，并进行图像重建及定量分析，可以较为准确的描述骨量和骨微结构，从而判定骨溶解的程度。其中，A为Control组，B为Ti组，C为L组（Ti颗粒+25mg/kg LDME），D为H组（Ti颗粒+100mg/kg LDME）。二维图像显示，与Control组比较，Ti组颅骨表面有较多的陷窝，骨溶解明显，给予LDME后，颅骨表面的陷窝明显减少，骨溶解减轻（图1）。

骨密度（BMD）变化：Ti加入后，小鼠颅骨骨密度明显降低，与Control组比较，差异有统计学意义（**p<0.01）；与Ti组比较，治疗组小鼠颅骨骨密度显著增加，其中LDME低浓度治疗组与Ti组比较，#p<0.05，LDME高剂量治疗组与Ti组比较，##p<0.01。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，小鼠颅骨骨密度进一步增加，$p<0.05，但仍较Control组低，*p<0.05。见图2。 

骨体积（BV）变化：与Control组（1.68±0.10mm³）相比，Ti组骨体积（1.17±0.12mm³）明显减少，**p<0.01，骨量丢失明显。LDME低剂量和高剂量治疗组小鼠颅骨骨密度分别为1.28±0.09mm³，1.63±0.08mm³，与Ti组比较，骨体积明显增加，其中L组与Ti组比较，#p<0.05；H组与Ti组比较，##p<0.01。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，骨量丢失程度进一步减轻，$p<0.05，但骨体积仍少于Control组，*p<0.05。见图2。 

骨体积分数（BV/TV）：Ti组骨体积分数明显降低，与Control组比较，**p<0.01。而LDME治疗后，骨体积分数明显增加，与Ti组比较，#p<0.05。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，骨体积分数进一步增加，两者相比，$p<0.05，但仍较Control组低，两者相比*p<0.05。见图2。 

3 组织学检测 

3.1 HE染色结果：

光镜下，Control组骨组织表面平整，骨膜厚度均匀，骨膜内细胞数量少，排列整齐；Ti组骨组织有虫蚀样变化，骨膜明显增厚，骨膜内细胞数量增多，且多为炎性细胞；LDME治疗组，骨组织有破坏，但程度较轻；骨膜有轻度增厚，有少量炎性细胞，成纤维细胞排列尚规则。见图3，其中A为Control组，B为Ti组，C为L组（Ti颗粒+25mg/kg LDME），D为H组（Ti颗粒+100mg/kg LDME）。

骨膜厚度（PT）：Image-Pro plus 6.0软件测量结果显示Ti组骨膜明显增厚（0.265±0.047mm），与Control组（0.110±0.021mm）比较，差异有统计学意义（**p<0.01）；LDME治疗后，骨膜增厚程度明显受到抑制，LDME高剂量和低剂量治疗组骨膜厚度分别为0.145±0.032mm，0.207±0.021mm，与Ti组相比，差异有统计学意义（#p<0.05）。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，骨膜增厚程度进一步减轻，$p<0.05，但仍较Control组厚，*p<0.05。 

骨厚度（BT）：与Control组（0.247±0.072mm）比较，Ti组（0.153±0.039mm）颅骨厚度明显变薄，差异有统计学意义（**p<0.01）。LDME治疗后，颅骨厚度分别为0.185±0.028mm（L组），0.212±0.036mm（H组），与Ti组相比，差异有统计学意义（#p<0.05）。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，颅骨进一步增厚，差异有统计学意义（$p<0.05），但厚度仍较Control组薄，*p<0.05。见图4。 

骨溶解面积（BES）：Ti组骨溶解面积为（0.094±0.014mm²），与Control组（0.025±0.010mm²）相比，差异有统计学意义（**p<0.01），表明Ti颗粒能引起明显的骨溶解；LDME加入后，骨溶解面积分别为（L组，0.066±0.018 mm²；H组，0.034±0.011 mm²），骨溶解较Ti组明显减轻，差异有统计学意义（#p<0.05）。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，骨溶解面积进一步减少，$p<0.05，但与Control组相比，骨溶解现象仍较明显，差异有统计学意义（*p<0.05）。见图4。 

3.2 TRAP染色结果 

TRAP染色阳性区域为紫红色，Control组可见点状的阳性改变，且主要集中于髓腔边缘；Ti组颅骨溶解侧可见大片紫红色区域，表明颅骨溶解侧有大量的成熟的破骨细胞存在；LDME治疗组仅在在颅骨溶解边缘有少量阳性区域。见图5。光镜下计数结果显示Ti组TRAP阳性细胞为39±5，与Control组（2±1）相比， **p<0.01；而LDME低浓度和高浓度治疗组TRAP细胞数分别为27±6，16±6，与Ti组相比，成熟破骨细胞数量明显减少，#p<0.05。LDME高剂量治疗组与低剂量治疗组相比，TRAP阳性细胞数进一步减少，$p<0.05，但仍多于Control组，*p<0.05。见图5。

4 ELISA检测 

ELISA结果显示，颅骨体外培养24h后，Control组RANKL和OPG的含量分别为12.4±1.4pg/ml，2517.8±420.4pg/ml，与Ti组（20.1±2.7pg/ml，1561.5±226.6pg/ml）比较，**p<0.01；LDME低剂量和高剂量治疗组RANKL和OPG的含量分别为18.1±2.5pg/ml，1870±241.4pg/ml；14.1±3.0pg/ml，2275.8±265.3 pg/ml，与Ti组比较，差异有统计学意义（#p<0.05）（表1）。上述结果提示LDME能上调OPG，下调RANKL，影响RANKL/OPG比值。

骨溶解后的LDME治疗降低了颅骨局部TNF-α和IL-1β的表达。Control组小鼠颅骨体外培养24h后，ELISA检测结果显示TNF-α和IL-1β的浓度低。相对于Control组，Ti加入后，小鼠颅骨上述两种炎症因子的含量显著增加（**p<0.01）；LDME治疗后，TNF-α和IL-1β的含量明显降低，与Ti组相比，#p<0.05；LDME高剂量与低剂量治疗组比较，炎症因子的含量进一步降低，$p<0.05，但含量仍高于Control组，*p<0.05。见表1。 

表1：ELISA检测RANKL、OPG、TNF-α和IL-1β的含量（n=10, pg/ml） 

Groups	RANKL	OPG	TNF-α	IL-1β
					Control	12.4±1.4	2517.8±420.4	105.6±10.5	89.4±9.9
Ti	20.1±2.7**	1561.5±226.6**	237.1±25.8**	163.5±13.4**
					L	18.1±2.5*#	1870±241.4*#	180.0±15.6*#	142.9±9.6*#
H	14.1±3.0*#$	2275.8±265.3*#$	137.8±24.4*##$	117.9±16.1*##$

注：*与Control组比较，*p<0.05，**p<0.01；#与Ti组比较，#p<0.05，##p<0.01；$与L组比较，$p<0.05。L：LDME低剂量治疗组，H：LDME高剂量治疗组。

本实验通过LDME干预小鼠颅骨骨溶解模型，结果表明低剂量组颅骨骨量丢失程度稍减轻，炎症性骨破坏程度稍减轻，成熟破骨细胞数稍减少，RANKL、OPG、TNF-α和IL-1β在颅骨的表达减弱；在高剂量组作用更为明显，可以明显减少成熟破骨细胞数量，抑制磨损颗粒引起的骨溶解并降低RANKL、OPG、TNF-α和IL-1β在颅骨的表达。证明LDME对磨损颗粒引起的骨溶解有一定的治疗作用，且高剂量的作用较为明显。 

本发明人推测LDME对磨损颗粒引起骨溶解的作用机制可能与其抑制炎症性破骨细胞活化有关。RANKL/OPG是调控破骨细胞活化的关键通路。在本实验中，LDME治疗后，小鼠颅骨局部RANKL含量减少，而OPG的浓度明显增加；而且，与Ti组比较，成熟破骨细胞数明显减少，说明LDME通过干预RANKL/OPG通路抑制破骨细胞活化。TNF-α和IL-1β是磨损颗粒诱导炎症性骨溶解中重要的细胞因子，这些因子可以导致破骨细胞过度活化，加剧骨溶解。发明人发现药物治疗组TNF-α和IL-1β的表达明显受到抑制，与Ti组比较，差异有统计学意义（p<0.05）；而且，组织学染色结果证实LDME治疗后，小鼠颅骨局部骨膜增厚及炎症性骨破坏程度受到抑制，说明LDME对磨损颗粒诱导骨溶解的治疗作用与降低TNF-α和IL-1β的表达有关。 

Claims (9)

1.盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，盐酸左旋多巴甲酯化学结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于所述的假体周围骨溶解为人工关节置换术后发生的假体周围骨溶解。

3.根据权利要求1所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于所述的药物组合物包含药学上有效剂量的盐酸左旋多巴甲酯和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求1所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于将盐酸左旋多巴甲酯制备成适用于胃肠道或非胃肠道给药的药物制剂。

5.根据权利要求1所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于将盐酸左旋多巴甲酯制备成适用于胃肠道的药物制剂，其制剂形式为常规片剂或胶囊剂或控释、缓释制剂。

6.根据权利要求4所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于盐酸左旋多巴甲酯的药物制剂中，盐酸左旋多巴甲酯在制剂中的含量为1wt%～99wt%。

7.根据权利要求6所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于盐酸左旋多巴甲酯的药物制剂中，盐酸左旋多巴甲酯在制剂中的含量为10wt%～90wt%。

8.根据权利要求4所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于药物制剂的制备方法为将盐酸左旋多巴甲酯直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成制剂，然后按照本领域常规的方式进行包装，与其它辅料混合制成制剂。

9.根据权利要求1所述的盐酸左旋多巴甲酯在制备用于治疗假体周围骨溶解的药物组合物中的用途，其特征在于所述的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同进行变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。