CN104195164A - 一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高效表达目的蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，包括如下步骤：(1)构建含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体；(2)将步骤(1)中所述含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体转化毕赤酵母，筛选出成功转化的毕赤酵母；(3)将步骤(2)中筛选出的成功转化的毕赤酵母在氯化钠浓度为1-8％、碳源为浓度1％-3％的甘油的酵母培养基中培养，表达目的蛋白。解决了现有技术中PGAPZaA载体中GAP启动子的下游目的基因表达产量低的问题。

Description

一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高效表达目的蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高效表达目的蛋白的方法。

背景技术

毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，毕赤酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。毕赤酵母表达系统的启动子主要有两种，一种是诱导性启动子-醇氧化酶启动子(AOX)，另一种是组成型启动子甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP)。

醇氧化酶启动子(AOX)可以利用甲醇为唯一碳源启动下游目的基因的表达，启动表达具有开关可控性，生长阶段可以利用甘油或是葡萄糖为碳源完成细胞数量的积累，生长细胞数量积累到一定量后换用甲醇为碳源的培养基进行诱导，一般换用甲醇为碳源的培养基诱导后细胞生长积累的速率相对甘油或是葡萄糖生长阶段低很多，所以诱导前用甘油或是葡萄糖作为碳源的原始细胞数量的积累过程是很有必要的。而换液的过程会增加培养基的成本且容易染菌。

编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子GAP已经被成功验证启动GAPDH在毕赤酵母中高水平表达，GAP启动子相比AOX启动子，GAP启动子是组成型表达的启动子，其表达过程不需要诱导，因此在工艺放大上是不需要换液的，这样会减少培养基的浪费，也会在很大程度上减少染菌的可能。但是GAP启动子在启动下游基因的表达强度上不及AOX启动子，因此采用GAP启动子时其表达产量会低于AOX启动子。

发明内容

本发明的内容是为了提供一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，解决了现有技术中PGAPZaA载体中GAP启动子的下游目的基因表达产量低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高效表达目的蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)构建含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体；

(2)将步骤(1)中所述含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体转化毕赤酵母，筛选出成功转化的毕赤酵母；

(3)将步骤(2)中筛选出的成功转化的毕赤酵母在氯化钠浓度为1-8％、碳源为浓度1％-3％的甘油的酵母培养基中培养，表达目的蛋白。

在上述技术方案中，所述氯化钠浓度为6％。

在上述技术方案中，所述甘油浓度为2％。

在上述技术方案中，所述培养基为YPD培养基。

本发明的利用毕赤酵母PGAPZaA载体高效表达目的蛋白的方法，采用毕赤酵母PGAPZaA载体表达系统相较于采用毕赤酵母AOX启动子载体系统培养工艺简单，节省培养基的成本且能降低染菌的风险；通过在酵母培养基中添加一定浓度的氯化钠提高培养基的渗透压力，由高渗的盐浓度培养环境诱导达到提高重组蛋白表达产量的目的；同时将酵母培养基中的碳源进行替换，避免葡萄糖高压灭菌过程中产生的糠醛对酵母发酵过程带来的毒性和不良影响，还可以使目的蛋白高效表达，弥补了GAP启动子在使用效果上的不足。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。

胱抑素C(Cystatin C)是一种由120个氨基酸残基组成的分子量为13KDa的低分子量分泌性蛋白质，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一。胱抑素C可由机体所有有核细胞产生，产率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物，而肾小球的滤过率是监测肾功能的一个重要的指标。鉴于胱抑素C有着良好的肾功能监测意义，开发胱抑素C的检测试剂盒及临床应用成为必然趋势。在胱抑素C检测试剂盒开发的过程中需要高特异性和高灵敏度的胱抑素C抗体，抗体的制备是通过胱抑素C免疫动物得到。传统的胱抑素C蛋白的获取是通过从肾病患者的尿液中分离纯化得到的，这样会受到原料来源的限制，而且制备的成本很高、产量也很低，目前多采用基因工程的手段和特定的表达系统制备重组胱抑素C蛋白用于试剂盒抗体原料的开发。在本实施例中采用毕赤酵母PGAPZaA载体表达系统，表达重组胱抑素C，具体涉及以下几个方面的内容：

1、胱抑素C的毕赤酵母PGAPZaA载体表达系统构建

(1)扩增胱抑素C的cDNA片段

以PET28a-CysC为模板，设计除去信号肽序列的CysC编码区，用下列引物对进行扩增：

P1：ATGCGAATTCTCCAGTCCTGGCAAGCC

P2：CGTAGCGGCCGCTTAGGCGTCCTGACAGGTGG

两条引物对中分别引入EcoRI和NotI酶切位点，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系中的组分按照以下顺序依次加入：

PCR反应过程及条件为：94℃维持2min；反映流程为：94℃(30S)，52℃(30S)72℃(30S)，反应过程共计30个循环；72℃维持10min。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)构建重组PGAPZaA-CysC表达载体

将正确的PCR扩增产物经过试剂盒回收(回收试剂盒购自TAKARA公司，操作步骤参见试剂盒说明书)，回收的PCR产物用EcoRI和NotI进行双酶切，并将PGAPZaA空载质粒(购自TAKARA公司)进行EcoRI和NotI双酶切以获得线性化的PGAPZaA空载质粒，PCR产物双酶切反应体系以及PGAPZaA空载质粒双酶切反应体系分别如下：

PCR产物EcoRI和NotI双酶切反应体系及反应条件，如下：

将上述各组分按照相应的量加入反应体系中，并于37℃水浴反应30min，既得经经过酶切的PCR产物。

PGAPZaA空载质粒EcoRI和NotI双酶切反应体系及反应条件，如下：

将上述各组分按照相应的量加入反应体系中，并于37℃水浴反应30min，既得经过酶切的质粒片段。

将经过双酶切的PCR产物和PGAPZaA空载质粒进行连接，重组构建PGAPZaA-CysC表达载体，连接反应体系如下：

将上述反应体系中各种组分依次加入反应容器中，混匀，并于16℃连接过夜，次日将连接完成的反应体系转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将转化完成的大肠杆菌转化菌液涂布Zeocin浓度为25μg/mL的LLB平板。次日挑取PGAPZaA-CysC单克隆于2mL LLB(含25μg/mL的Zeocin)液体培养基中，并于37℃ 220rpm条件下培养过夜，之后用碱裂解法提取质粒，并通过双酶切鉴定和PCR鉴定得到正确的菌株，然后将经过验证的正确的菌株进行基因测序，并进行Blast分析，确认构建的PGAPZaA-CysC表达载体正确且无突变，并将正确的质粒保存备用。

(3)重组PGAPZaA-CysC质粒转化毕赤酵母GS115

PGAPZaA-CysC质粒线性化：将(2)步得到的正确的PGAPZaA-CysC质粒用BspHI线性化酶切并用琼脂糖凝胶电泳回收。

毕赤酵母GS115感受态细胞制备：首先接种毕赤酵母GS115单菌落至10mL YPD培养基中，并于250rpm 30℃培养24h左右，待YOD培养基的OD600值在1.3-1.5时取100μL菌液接种至500mL三角瓶中，其中装液量为100mL的YPD培养基，并于250rpm 30℃培养12-16h，直到OD600值在0.8-1.2时将菌液转入两个预冷的离心管中，并于4000g离心力于4℃条件下离心5min，弃上清；然后每管用25mL冰无菌水重悬，并于4000g离心力于4℃条件下离心5min，弃上清；然后每管再用5mL冷藏的1mol/L山梨醇重悬，并于4000g离心力于4℃条件下离心5min，弃上清；然后每管再用200μL冷藏的1mol/L山梨醇重悬，后用1mL预冷的EP管分装，每管80μL；最后将分装完的感受态细胞于-80℃冰箱保存，备用。

重组PGAPZaA-CysC质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞：取80μL制备完成的感受态细胞，后向感受态细胞溶液中加入16μL线性化PGAPZaA-CysC重组质粒，轻轻混匀，并转入预冷的0.2cm Eppendorf电转杯中冰浴5min，后于1.5kV，5mS做指数衰减脉冲转化，后向转化体系中加入1mL冷藏的1mol/L山梨醇至电转杯中，后将溶液转移至1.5mL灭菌离心管中。用1mL枪头轻柔取300μL涂布Zeocin浓度为100μg/mL的YPD平板。将涂布好的平板于30℃倒置培养2-3d，观察平板上转化子的出现情况，并通过PCR鉴定重组毕赤酵母。

(4)筛选高效表达的重组毕赤酵母

将鉴定正确的重组毕赤酵母接种到Zeocin浓度为100μg/mL的YPD平板上，30℃培养2天，然后从平板上挑取菌落形态饱满且颜色洁白的单菌落至装有1mL YPD液体培养基中，并于250rpm30℃培养3天后取培养液上清并用SDS检测上清液的结果，选取目的表达条带最亮的菌株作为优势表达菌株，并对该菌株进行保存，保存的操作为：将高表达量的菌株接种至100mL摇瓶中，摇瓶装液量为10mL，培养基为YPD液体培养基；接种完成后于250rpm30℃培养24h；然后吸取500μL的培养液加入到500μL50％的甘油溶液中，并于-80℃保存备用。

2、胱抑素C的毕赤酵母PGAPZaA载体表达系统高产表达胱抑素C的发酵工艺优化

2.1通过钠离子诱导提高胱抑素C的表达量

在YPD培养基的配制过程中，分别添加1％、3％、5％、6％、8％、9％六种不同浓度的氯化钠，并与对照组(不添加氯化钠的培养基)同步的培养处理，培养3天后，取发酵培养液检测各种情况下胱抑素C的表达量。检测是用Lowery法对发酵液中的胱抑素C蛋白进行定量，结果如表1所示，从表1中可以看出，培养基中添加6％浓度的氯化钠时胱抑素C的表达量是最好的，在后续的生产过程中可以采用该浓度的氯化钠以提高胱抑素C的表达量。

表1 不同浓度的氯化钠对胱抑素C表达量的影响

氯化钠浓度(％)	胱抑素C表达量(mg/L)
		0	0.68
1	3.8
		3	9.6

5	15.3
		6	20.1
8	12.5
		9	4.3

2.2培养基中C源的替换

在YPD培养基的配制过程中分别用甘油和可溶性淀粉替代原发酵培养基中的葡萄糖，同时向各培养基中添加6％浓度的氯化钠，各培养基中碳源用量均为2％。培养3天后，取发酵培养液检测各种碳源对胱抑素C表达量的影响，胱抑素C的检测是用Lowery法对发酵液中的胱抑素C蛋白进行定量，结果如表2所示，从表2中可以看出，采用甘油为碳源时胱抑素C的表达量最高，在后续的生产过程中可以采用甘油替代YPD中的葡萄糖作为碳源。进一步的优化甘油的浓度，分别采用1％、2％、3％、4％、5％和6％浓度的甘油作为优化培养基中的碳源，培养3天后，取发酵培养液检测各种浓度的甘油对胱抑素C表达产量的影响，检测胱抑素C的产量是用Lowery法对发酵液中的胱抑素C蛋白进行定量，结果如表3所示，从表3中可以看出，培养基中采用2％浓度的甘油时胱抑素C的表达量是最好的，在后续的生产过程中可以采用2％浓度的甘油作为碳源，提高该表达系统表达胱抑素C的产量。

表2 不同碳源对胱抑素C表达量的影响

培养基中碳源种类	胱抑素C表达量(mg/L)
		葡萄糖	19.8
可溶性淀粉	3.5
		甘油	23.6

表3 不同浓度的甘油对胱抑素C表达量的影响

甘油浓度(％)	胱抑素C表达量(mg/L)
		1	15.4
2	23.5
		3	17.9
4	11.8

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术实施方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)构建含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体；

(2)将步骤(1)中所述含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体转化毕赤酵母，筛选出成功转化的毕赤酵母；

(3)将步骤(2)中筛选出的成功转化的毕赤酵母在氯化钠浓度为1-8％、碳源为浓度1％-3％的甘油的酵母培养基中培养，表达目的蛋白。

2.如权利要求1所述的利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，其特征在于：所述氯化钠浓度为6％。

3.如权利要求1所述的利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，其特征在于：所述甘油浓度为2％。

4.如权利要求1所述的利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，其特征在于：所述培养基为YPD培养基。