CN104189959B

CN104189959B - 含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法

Info

Publication number: CN104189959B
Application number: CN201410087968.2A
Authority: CN
Inventors: 崔翔; 刘铭汉; 王加旭; 黄博; 向强; 周跃
Original assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Second Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: CN104189959A

Abstract

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法。本发明要解决的技术问题是为治疗下腰痛提供一种组织工程支架。本发明的技术方案是含生长因子的椎间盘组织支架，为采用同轴静电纺丝技术制备得到的同轴电纺支架；所述的生长因子为TGF‑β1。本发明还提供了所述的椎间盘组织支架的制备方法。本发明可用于下腰痛的治疗。

Description

含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及含生长因子的椎间盘组织支架及其制备方法。

背景技术

下腰痛是一种临床常见疾病，严重影响人们的生活质量。研究表明，椎间盘退变及髓核钙化与下腰痛密切相关。保守治疗只能缓解症状，椎间盘髓核摘除术或脊柱节段融合内固定等手术虽然能解除神经压迫症状，但术后椎间关节强硬高发及椎间盘突出复发等问题。目前，生物治疗的方式包括基因治疗，生长因子治疗，细胞和组织工程等。

组织工程是把细胞和支架结合起来，对损伤部分进行替代治疗的一种方法。然而，目前仍面临许多问题，如缺少能够维持种子细胞生长、分化、增殖及基质合成的理想支架。间充质干细胞是目前应用广泛的一种细胞，但其分化需要一定的物理、化学、生物刺激。生长因子作为生物刺激的一种经常用于刺激干细胞的增殖和分化。若组织工程支架能长时间稳定释放生长因子，将会是对细胞的增殖分化起到良好的作用。之前的研究多使用水凝胶作为承载生长因子的载体，但其缺点有水凝胶内部的细胞容易死亡、水凝胶力学性能差、用途局限等。静电纺丝技术在1934年由Formalas发明。主要指聚合物熔体或者溶液在高压静电场作用下形成纤维的过程。目前，静电纺丝已经成为一种用于生产不同功能多聚纳米纤维的新技术，并已经发展成为一种传递生物活性材料的工具。纳米纤维表面的小孔用于释放存放在纤维中的药剂。与传统的药物传递系统相比，这个方法极大的增加了作用时间。这个方法也具有质量小，伤口闭合率高的优越性，从而有效的辅助伤口复原。特别是，含有血小板源生长因子（PDGF），血管内皮生长因子（VEGF）和PDGF，以及转化生长因子-beta（TFG-beta）等多种生长因子的纳米纤维的制造已有报道。除了同轴电纺以外，共轴电纺技术也已经广泛应用。

静电纺丝技术在骨科迅速发展，通过静电纺丝技术制成的纳米支架具有纤维直径小（几十到数百纳米），孔隙率高，比表面积大，均一性好等优点。同轴电纺因为具有内外双层结构，克服了单轴静电纺丝时水溶性和脂溶性材料相互难融合的问题。将生长因子作为静电纺丝支架的一部分，构建促进间充质干细胞向髓核样细胞分化的组织工程支架，有望成为生物治疗的有效手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为治疗下腰痛提供一种组织工程支架。

本发明的技术方案是含生长因子的椎间盘组织支架，为采用同轴静电纺丝装置制备得到的同轴电纺支架；所述的生长因子为TGF-β1；其中，同轴电纺支架外层溶液为以六氟异丙醇为溶剂的13～17%g/mL聚乳酸PLGA；同轴电纺支架内层溶液为13～17%g/mL聚乙烯醇PVA和3μLTGF-β1；其中TGF-β1溶解于1%的BSA中，其浓度为1ng/μL。

优选的，同轴电纺支架外层溶液为以六氟异丙醇为溶剂的15%g/mL聚乳酸PLGA。

优选的，同轴电纺支架内层溶液为15%g/mL聚乙烯醇PVA。

本发明还提供了椎间盘组织支架的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶解于六氟异丙醇HFIP中，制成13～17%g/mLPLGA溶液，即为同轴静电纺丝外层溶液；

步骤2、将TGF-β1用1%牛血清白蛋白BSA稀释为浓度1ng/μL；

步骤3、将PVA溶于超纯水中，成为13～17%g/mLPVA溶液。

步骤4、在2mL15%PVA溶液中加入6μL1ng/μL的TGF-β1，此为同轴静电纺丝的内层溶液；

步骤5、组装好仪器，针头距离接受装置15cm，电压16～18Kv，注射速度0.2～0.4mL/h，内、外层溶液都纺1.2mL。

步骤6、支架完成后，保存于-20℃。

优选的，步骤1中PLGA的浓度为15%g/mL。

优选的，步骤3中PVA的浓度为15%g/mL。

优选的，步骤5中注射速度为0.3mL/h。

本发明组织工程支架纺丝均一性好，具有内外双层结构。该支架具有良好的力学特性、亲水性，可以长时间稳定释放生长因子TGF-β1，促进人间充质干细胞的增殖和向髓核样细胞的分化。其制备方法简单易行。

附图说明

图1、静电纺丝装置，由高压电源、喷头及给液装置、接受装置构成。高压电源是提供高达几万伏特的直流电源；喷头为含内外两层的同轴喷头，给液装置为内含配好的溶液的注射器及固定注射器的注射泵；接收装置为金属接收板，并有导线接地。

图2、A图对构建的椎间盘组织支架进行扫描电镜观察，B图为纺丝直径分布进行统计。

图3、使用投射电镜观察椎间盘组织支架的纺丝壳-核双层结构。

图4、使用高效液相色谱分析法测量椎间盘组织支架TGF-β1释放。

图5、对椎间盘组织支架进行了水接触角测试。

图6、使用MTT方法测量人间充质干细胞在椎间盘组织支架表面增殖情况。

图7、人间充质干细胞在椎间盘组织支架表面的生长情况。

具体实施方式

实施例1采用本发明方法制备同椎间盘组织支架

步骤1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）溶解于六氟异丙醇（HFIP）中，制成15%PLGA溶液，即为同轴静电纺丝外层溶液；

步骤2、将TGF-β1（Prospec公司）用1%牛血清白蛋白（BSA）稀释为浓度1ng/μL；

步骤3、将聚醋酸乙烯酯（PVA）溶于超纯水中，成为15%PVA溶液。

步骤5、如图1组装好仪器，注射器为(LSP02-1B,保定兰格公司,China)，高压电源为中频直流高压器(RXZGF,上海日行公司,China)，针头距离接受装置15cm，电压16-18Kv，注射速度0.3mL/h，内、外层溶液都纺1.2mL。

步骤6、支架完成后，保存于-20℃。

实施例2对本发明椎间盘组织支架的性能检测

1、对构建的椎间盘组织支架进行扫描电镜观察，并对纺丝直径分布进行统计。结果见图2。扫描电镜结果可见纺丝直径较为均一，大部分都分布在200～500nm范围内。投射电镜可以明显看到椎间盘组织支架的双层结构。

2、使用投射电镜观察椎间盘组织支架的纺丝壳-核双层结构，结果见图3。内层核层与外层的壳层之间可见明显界限，说明成功得到内外双层壳-核结构的纺丝。

3、为了明确椎间盘组织支架缓释TGF-β1的作用，使用高效液相色谱分析法测量其释放。具体的，将同轴电纺支架分别置于装有PBS缓冲液的透析袋内，将其放置于37℃的温育箱内，用处理搅拌器以50rpm的速率搅拌。按照设定好的时间（在第1,2,3,7,14天），取出5mL的PBS，同时放入新的PBS缓冲液。释放出TGF-β1用HPLC/MS(Agilent,USA)测量。共测量了1,2,3,7,14天共5个时间点。结果见图4，可见蛋白的释放随着时间不断增多，具有明显的缓释效果。

4、为了了解椎间盘组织支架表面的亲水性，进行了水接触角测试，将同轴电纺支架以1cm×2cm的尺寸分别进行裁剪，且注意将内膜朝上平放在玻璃平面上，再用另一面玻璃进行适量按压，使得样品表面较为平整。然后用接触角测量仪测量接触角，每次用0.5mL超纯水检测样品，取统计值分析。结果见图5和表1。在3s,6s,12s,18s分别测量了其接触角。可见材料表面具有良好的亲水性，且可以预测其表面适合细胞粘附、增殖、生长、分化。

表1水接触角测试

时间

3s

6s

12s

18s

角度

50.95

49.78725

47.05375

44.2555

5、为了明确制成的椎间盘组织支架的细胞毒性，使用MTT比色（噻唑蓝比色法）方法测量人间充质干细胞（购买于cyagen公司，网址如下http://www.cyagen.com.cn/product/130.html）在支架表面增殖情况。具体操作如下：24孔板，接种密度5×10⁴个/孔，一直使用hMSCs生长培养基(Cyagen)培养。使用MTT试剂盒（MTT CellProliferation Assay Kit，life technologies，USA）分别在2，4，6，8天时进行MTT实验操作：a，吸出孔内培养液，每孔加入600μL新鲜hMSCs growth medium及24μL MTT液（5mg/mL），孵育4小时；b，吸出培养液，每孔加入二甲亚砜DMSO(Sigma)450μL，孵育30分钟；c，取出后使用酶标仪（MK3,Thermo,USA）检测570nm处吸光值。结果见图6，可见细胞在支架表面的数量随时间增加而增加，具有良好的促进细胞增殖能力。

6、在椎间盘组织支架表面的生长情况实验：将人间充质干细胞接种在椎间盘组织支架表面后分别在低氧（1%O₂）和常氧状态下培养21天。作为对照，将细胞同时接种在不含TGF-β1的同轴电纺支架后分别在低氧（1%O₂）和常氧状态下培养21天。之后对其进行qRT-PCR（以β-Actin为检测内参）检测SOX-9、collagen-II和aggrecan（这几个基因是髓核细胞表达高的基因，当这几个基因表达增强，可以说明人间充质干细胞向髓核样细胞分化）的mRNA表达，结果见图7。SOX-9，collagen-II，aggrecan的mRNA表达可见，含有TGF-β1的同轴电纺支架在低氧状态下最有利于间充质干细胞向髓核样细胞的分化。

qRT-PCR的引物序列：

SOX-9：

上游引物：5-GCGGAGGAAGTCGGTGAAGA-3；

下游引物：5-GAAGATGGCGTTGGGGGAGA-3；

Collagen type II：

上游引物：5-GGAGCAGCAAGAGCAAGGAGA-3；

下游引物：5-GTGGACAGCAGGCGTAGGAAG-3；

aggrecan：

上游引物：5-ACTCTGGGTTTTCGTGACTCT-3；

下游引物：5-ACACTCAGCGAGTTGTCATGG-3；

β-Actin：

上游引物：5-GTCCTCTCCCAAGTCCACAC-3；

下游引物：5-GGGAGACCAAAAGCCTTCAT-3。

Claims

1.含生长因子的椎间盘组织支架，其特征在于：为采用同轴静电纺丝装置制备得到的同轴电纺支架；所述的生长因子为 TGF-β1；其中，同轴电纺支架外层溶液为以六氟异丙醇为溶剂的 15%g/mL 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 PLGA；同轴电纺支架内层溶液为 13～17%g/mL 聚乙烯醇 PVA 和 3µLTGF-β1；其中 TGF-β1 溶解于 1%的 BSA 中，其浓度为 1ng/µL。

2.如权利要求 1 所述的椎间盘组织支架，其特征在于：同轴电纺支架内层溶液为 15%g/mL聚乙烯醇 PVA。

3.椎间盘组织支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤 1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA溶解于六氟异丙醇HFIP中，制成 15%g/mLPLGA溶液，即为同轴静电纺丝外层溶液；

步骤 2、将 TGF-β1 用 1%牛血清白蛋白BSA稀释为浓度 1ng/µL；

步骤 3、将 PVA 溶于超纯水中，成为 13～17%g/mL PVA 溶液；

步骤 4、在 2mL 13～17% g/mL PVA 溶液中加入 6µL 1ng/µL 的 TGF-β1，此为同轴静电纺丝的内层溶液；

步骤 5、组装好仪器，针头距离接受装置 15cm，电压 16～18Kv，注射速度 0.2～0.4mL/h，内、外层溶液都纺 1.2mL；

步骤 6、支架完成后，保存于-20℃。

4.如权利要求 3 所述的制备方法，其特征在于：步骤 3 中 PVA 的浓度为 15%g/mL。

5.如权利要求 3 或 4 所述的制备方法，其特征在于：步骤 5 中注射速度为 0.3mL/h。