CN104188908A - 黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法，制备方法如下：(1)按配比称取卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1，然后放入容器中，加入甲醇氯仿混合溶剂使其充分溶解；(2)然后溶解后的原料置于旋转蒸发器上，在恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥过夜；(3)配制的胆酸钠PBS溶液，再往胆酸钠PBS溶液中加入乙二胺四甲叉磷酸，然后将上述混合溶液加入到干燥后的原料中，在恒温水浴中，常压旋蒸，制得脂质体初悬液；(4)然后对脂质体初悬液进行超声振荡，最后将初悬液依次挤压通过0.80、0.45、0.22μm孔径的微孔滤膜得到柔性纳米脂质体。本发明的脂质体具有粒径均匀，包封率高，靶向性好的优点。

Description

黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法。

背景技术

骨质疏松症是由于骨吸收与骨形成失耦联而致骨量丢失和骨组织微结构破坏为特征，从而导致骨脆性增加和容易发生骨折的全身性骨病。世界卫生组织将骨质疏松症定义为骨密度(BMD)或骨矿含量(BMC)较正常成人骨密度平均值降低2.5个标准差以上。骨质疏松按病因分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。临床表现为疼痛、骨密度降低、身长缩短、驼背、呼吸功能下降、骨折。随着人均寿命的延长、老年人口的增加，骨质疏松已日益突出地成为健康和社会问题。

现阶段治疗骨质疏松的药物主要包括：降钙素，双磷酸盐，选择性雌激素受体调节剂，核因子-kappa B受体活化因子配体(RANKL)抑制剂，甲状旁腺激素等。这些药物对骨质疏松有着较好的预防和治疗作用，但同时也存在着一些问题，如药物的生物利用度低以及严重的不良反应等。双磷酸盐是目前使用最为广泛的治疗骨质疏松药物，但是由于口服给药肠道吸收差限制了其有效性，尤其是含氮双磷酸盐长期服用易引起严重的胃肠道副作用以及病人服药依从性差，此外双磷酸盐与狄诺塞麦也被证明与颚骨坏死这一罕见但却很严重的不良反应相关；服用雷诺昔芬可引起潮热和导致腿抽筋以及增加血栓的风险；甲状旁腺素会引起头晕、恶心、腿抽筋以及骨肉瘤的发生。因此，大力加强绝经后骨质疏松的治疗与预防工作，发扬中药整体治疗、毒副作用少的特色，开发安全有效的中药新成品，具有重要意义。

黄芪三仙汤是一传统古方，组方以仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)、淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)、肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma)等温阳补肾药，以及黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge)、当归(Angelicasinensis)、田三七(Panax pseudoginseng Wall.var.notoginseng(Burkill)Hoo etTseng)、延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang ex Z.Y.Su et C.Y.Wu)等养血活血药物组成，是一经典的补肾活血方剂。通过十多年的临床研究发现黄芪三仙汤治疗绝经后骨质疏松能取得一定的疗效，研究结果表明该方具有改善患者肾虚症状积分，提高血清雌二醇(E₂)水平，有增加绝经后妇女的骨密度，抑制骨吸收的趋势。动物实验发现黄芪三仙汤可使去卵巢大鼠股骨钙、磷含量增加，胫骨上段的骨量有增加的趋势。同时还对去卵巢大鼠中枢神经的病变具有保护作用。黄芪三仙汤中的单味药如黄芪，淫羊藿，三七被证明具有抗骨质疏松的作用。

黄芪含有多糖、甙类、黄酮和微量元素等多种成分，黄芪及其提取成分除对免疫系统、心血管系统有影响外，在抗衰老、抗癌等方面也起着不容忽视的作用。现代医学研究表明，黄芪有抑制破骨细胞的功能，同时也有促进骨形成的补骨功效。阳波等对绝经后骨质疏松患者随机分组，经过6个月的临床观察，结果发现实验组采用黄芪治疗后，患者腰椎和股骨骨密度随时间显著升高，血液生化指标的改善也明显好于其他组，所有结果均提示黄芪能显著改善绝经后骨质疏松症状，能够促进骨形成、抑制骨吸收。动物实验表明，黄芪中的黄芪甲苷、黄芪总黄酮、黄芪多糖等都对骨质疏松有一定的作用。

淫羊藿又名仙灵脾，现代药理学研究表明，淫羊藿具有抗骨质疏松的药理活性。年华等研究表明箭叶淫羊藿提取物能显著提高去卵巢大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)活性，抑制去卵巢引起的骨丢失，同时可以显著提高骨形成率。解芳等报道了淫羊藿提取物对去卵巢大鼠骨转换的影响，结果发现淫羊藿提取物能够显著抑制由于雌激素缺乏引发的骨转换增强，调整骨形成和骨吸收的关系，对遏制去卵巢造成的骨质疏松有一定的作用，且长期服用对子宫没有刺激作用。淫羊藿苷是淫羊藿中主要的抗骨质疏松成分。于波等探讨了淫羊藿苷对人成骨细胞的影响，发现不同浓度的淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖均有促进作用，淫羊藿苷浓度为100ng/ml和10ng/ml对成骨细胞分泌ALP也有促进作用，表明淫羊藿苷促进成骨细胞增殖的同时也增强了成骨细胞成骨活性。张秀珍等发现淫羊藿苷可以上调大鼠成骨细胞骨保护素(OPG)mRNA表达，下调RANKL mRNA表达，从而调节骨吸收。吕明波等[24]研究表明淫羊藿苷具有诱导破骨细胞凋亡，抑制骨吸收的作用。

三七自古以来就被公认为具有显著的活血化瘀、消肿定痛功效。郭福等探讨了三七对骨重建偶联中细胞因IGF-1和IL-6的表达影响。结果发现三七能够促进成骨细胞增长，促进IGF-1的分泌，抑制成IL-6的分泌，从而抑制破骨细胞增长和骨吸收，达到治疗骨质疏松症的作用。吴丽萍等报道三七总皂苷(PNS)可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化，促进成骨细胞OPG的表达。纳青青等研究了PNS对大鼠高脂血症性骨质疏松的作用，结果发PNS可显著降低血脂并促进骨的形成，对大鼠高脂血症所致骨质疏松有一定防治作用。王大伟等证实了PNS能够促进兔成骨细胞的增殖和分化，并能提高成骨细胞的OPGmRNA的相对表达量而对其RANKL mRNA的表达有抑制作用。盛华刚等探讨PNS和淫羊藿苷组分配伍对体外培养成骨细胞的增殖和钙化的影响。当PNS和淫羊藿苷组分配伍比例为5:2时，可明显促进成骨细胞增殖并有明显的钙化作用，这证实了PNS和淫羊藿苷组分配伍治疗骨质疏松的合理性。

脂质(liposome)是1965年由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。1971年，脂质体第一次被用作药物载体，由于其独特的结构特点，脂质体用作药物载体使药剂学的研究进入靶向给药的新天地，同时增加了新的给药途径。脂质体由不溶性的具有极性的卵磷脂为主要膜材并加入胆固醇等附加剂组成，可以同时包封脂溶性和水溶性的药物。脂质体作为药物传递系统，具有很多优点：①降低药物毒性，脂质体是由生物可降解脂质材料制备而成，对人体无毒，而且可减轻药物的刺激性，降低药物的毒副作用；②靶向性，包封在脂质体中的药物，主要被巨噬细胞摄取，在肝、脾和骨髓等单核、巨噬细胞丰富的器官中浓集，具有天然的靶向作用；③缓释作用，代谢迅速、作用时间短的药物，用脂质体包封，可减少在机体内的代谢而延长药物作用时间，具有缓释长效作用；④提高稳定性，将一些化学性质不稳定的药物用脂质体包裹，可以增加药物的稳定性。脂质体作为新型的药物给药系统，可以达到提高药物有效性、安全性、稳定性和患者依从性的目的，所以受到了国内外医药界的广泛重视。

随着生物技术的不断进步，研究者已制备出各种不同的脂质体药物输送系统，包括前体脂质体、柔性脂质体、长循环脂质体、磁性脂质体、靶向脂质体、免疫脂质体和热敏脂质体等。脂质体的制备方法也越来越多，常用的有被动载药法如薄膜分散法、注入法、逆相蒸发法和超声波分散法等，以及主动载药法如pH梯度法和硫酸铵梯度法等。随着脂质体制备工艺的逐渐完善，使其优点得以充分体现，脂质体的研究愈来愈受到重视。脂质体技术的良好的技术性能和诱人的市场前景使其已经渗透到制药、生物技术、遗传工程、免疫调节、基因药物等各个领域。

中药是我国特有的宝库，现代脂质体制剂技术与传统中医药的结合开始于20世纪80年代，近年来中药脂质体的研究已经成为中药领域的一大热点。脂质体在中药领域中的应用也取得了可喜的成绩，其改善疗效、降低毒性以及靶向、缓释、细胞亲和性等特性已得到公认，但是中药脂质体的研究也存在些问题：中药脂质体的研究以单一活性药物成分脂质体的研究为主，从本质上看与西药脂质体的研究没有任何区别，只有中药多成分的脂质体才能够体现出中药的特色，也符合中药的用药特点。有些中药脂质体的载药量低，稳定性较差，有待进一步解决。与西药相比，中药化学成分的复杂多样导致中药脂质体的研究要困难得多。通过不断地提高脂质体技术，使传统中药与现代脂质体制剂技术结合必将促进中药现代化的发展。

发明内容

本发明提供了一种黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明的黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法的具体步骤如下：

(1)按配比称取卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1，上述原料中卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1的重量比为80-120:5-15:3-10:1-5:10-15，然后放入容器中，加入甲醇氯仿混合溶剂使其充分溶解，混合溶剂与胆固醇的体积重量比为0.5-2:1ml/mg；

(2)然后溶解后的原料置于旋转蒸发器上，在30-50℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸10-20min以确保有机溶剂去除完全，减压旋蒸结束后，真空干燥过夜；

(3)配制胆酸钠PBS溶液，胆酸钠PBS溶液与胆固醇的体积重量比为1:1ml/mg，胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量与胆固醇的重量比为1-4：2，再往胆酸钠PBS溶液中加入乙二胺四甲叉磷酸，乙二胺四甲叉磷酸的加入量与胆固醇的重量比为1-3：5，然后将上述混合溶液加入到步骤(2)干燥后的原料中，并在30-50℃的恒温水浴中，常压旋蒸10-60min，制得脂质体初悬液；

(4)然后探头式超声仪对脂质体初悬液进行超声振荡，时间为3-10min，使脂质体初悬液成半透明状，最后将初悬液依次挤压通过0.80、0.45、0.22μm孔径的微孔滤膜得到本发明的柔性纳米脂质体。

步骤(1)中，优选卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1的重量比为100:10:6:3:13。

步骤(1)中，甲醇氯仿混合溶剂中甲醇与氯仿的体积比为1:1。

步骤(1)中，优选混合溶剂与胆固醇的体积重量比为1:1ml/mg。

步骤(2)中，优选在40℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸15min以确保有机溶剂去除完全。

步骤(3)中，优选胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量与胆固醇的重量比为2：2；优选乙二胺四甲叉磷酸的加入量与胆固醇的重量比为1：5；优选在40℃的恒温水浴中，常压旋蒸30min，制得脂质体初悬液。

步骤(4)中，超声时间优选为6min。

黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1的分子结构式如下：

A为黄芪甲苷、B为淫羊藿苷、C为三七皂苷R1。

理化性质如表1所示：

表1 基本性质

本发明的积极效果如下：

本发明的黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法具有工艺简单，反应条件温和、安全环保的优点，并且本发明的方法制备的黄芪三仙汤柔性纳米脂质体具有粒径均匀，包封率高，靶向性好的优点。

附图说明

图1是本发明实施例3制备的柔性纳米脂质体的显微镜照片。

图2是本发明实施例3制备的柔性纳米脂质体的扫描电镜照片。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

(1)称取卵磷脂80mg、胆固醇5mg、黄芪甲苷3mg、淫羊藿苷1mg、三七皂苷R110mg，然后放入容器中，加入甲醇氯仿混合溶剂使其充分溶解，混合溶剂的体积为0.5ml；

(2)然后溶解后的原料置于旋转蒸发器上，在30℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸10min以确保有机溶剂去除完全，减压旋蒸结束后，真空干燥过夜；

(3)配制5ml的胆酸钠PBS溶液，胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量为2.5mg，再往胆酸钠PBS溶液中加入乙二胺四甲叉磷酸，乙二胺四甲叉磷酸的加入量为1mg，然后将上述混合溶液加入到步骤(2)干燥后的原料中，并在30℃的恒温水浴中，常压旋蒸60min，制得脂质体初悬液；

(4)然后探头式超声仪对脂质体初悬液进行超声振荡，时间为3min，使脂质体初悬液成半透明状，最后将初悬液依次挤压通过0.80、0.45、0.22μm孔径的微孔滤膜得到本发明的柔性纳米脂质体。

步骤(1)中，甲醇氯仿混合溶剂中甲醇与氯仿的体积比为1:1。

实施例2

(1)称取卵磷脂120mg、胆固醇15mg、黄芪甲苷10mg、淫羊藿苷5mg、三七皂苷R115mg，然后放入容器中，加入甲醇氯仿混合溶剂使其充分溶解，混合溶剂与胆固醇的体积重量比为30ml；

(2)然后溶解后的原料置于旋转蒸发器上，在50℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸20min以确保有机溶剂去除完全，减压旋蒸结束后，真空干燥过夜；

(3)配制15ml的胆酸钠PBS溶液，胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量为30mg，再往胆酸钠PBS溶液中加入乙二胺四甲叉磷酸，乙二胺四甲叉磷酸的加入量为9mg，然后将上述混合溶液加入到步骤(2)干燥后的原料中，并在50℃的恒温水浴中，常压旋蒸10min，制得脂质体初悬液；

(4)然后探头式超声仪对脂质体初悬液进行超声振荡，时间为10min，使脂质体初悬液成半透明状，最后将初悬液依次挤压通过0.80、0.45、0.22μm孔径的微孔滤膜得到本发明的柔性纳米脂质体。

步骤(1)中，甲醇氯仿混合溶剂中甲醇与氯仿的体积比为1:1。

实施例3

(1)称取卵磷脂100mg、胆固醇10mg、黄芪甲苷6mg、淫羊藿苷3mg、三七皂苷R113mg，然后放入容器中，加入甲醇氯仿混合溶剂使其充分溶解，混合溶剂与胆固醇的体积重量比为10ml；

(2)然后溶解后的原料置于旋转蒸发器上，在40℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸15min以确保有机溶剂去除完全，减压旋蒸结束后，真空干燥过夜；

(3)配制10ml的胆酸钠PBS溶液，胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量为10mg，再往胆酸钠PBS溶液中加入乙二胺四甲叉磷酸，乙二胺四甲叉磷酸的加入量为2mg，然后将上述混合溶液加入到步骤(2)干燥后的原料中，并在40℃的恒温水浴中，常压旋蒸30min，制得脂质体初悬液；

(4)然后探头式超声仪对脂质体初悬液进行超声振荡，时间为6min，使脂质体初悬液成半透明状，最后将初悬液依次挤压通过0.80、0.45、0.22μm孔径的微孔滤膜得到本发明的柔性纳米脂质体。

步骤(1)中，甲醇氯仿混合溶剂中甲醇与氯仿的体积比为1:1。

实施例4本发明制备的柔性纳米脂质体的理化性质

对实施例1-3制备的柔性纳米脂质体进行如下检测:

粒度分布:

加样枪吸取适量脂质体样品溶液,注入到纳米粒度和Zeta电位分析仪的石英测量池和毛细管小池中，测定样品的平均粒径和多分散性指数(PDI)。

包封率的测定

采用微柱离心法分离脂质体和未包封的游离药物，高效液相色谱法测定含量。精密量取脂质体悬液200μl上样于微型凝胶柱中，3000r/min离心3min，补加200μlPBS离心，再重复加200μlPBS洗脱两次。合并洗脱液，用甲醇破膜，高效液相色谱法测定测定脂质体中包封的药量。总药量：取200μl脂质体直接用甲醇破膜测定。

药物的包封率＝制剂所含药量/总药量。

结果如表2所示：

表2

本发明实施例3制备的柔性纳米脂质体的显微镜照片如图1所示，通过对外观观察发现发明的脂质体呈现淡蓝色乳光，可初步说明粒径较小，分布较均一。如图1，显微镜观察发现发明的脂质体的粒径较小且无结晶析出。

实施例5本发明制备的柔性纳米脂质体的稳定性

取本发明实施例3制备的柔性纳米脂质体，充氮绝氧熔封后，分别置室温的自然条件下和4℃避光存放，于0，1，3个月测定药物包封率，考察脂质体的长期稳定性。结果如表3所示。

表3

在第一个月时，室温与低温两种条件下，脂质体的制剂外观无明显变化与差别，经测定包封率没有明显改变。在第三个月时，低温下保存的样品，外观无明显变化，但包封率均有所下降；于室温下放置的样品底部有少许絮凝物，而且经测定，包封率明显下降。

实施例6 本发明制备的柔性纳米脂质体的骨靶向性评价

羟基磷灰石吸附试验

取脂质体悬液各1ml分别加入到1ml含2mg/ml的羟基磷灰石混悬液中于37℃恒温水浴震荡，一小时后混悬液过0.45μm微孔滤。吸取悬液200μl，甲醇破膜后进行HPLC测定并记录各组黄芪甲苷、淫羊藿苷和三七皂苷R1所对应的峰面积，从标准曲线上查出各成分的含量(C)。另取脂质体悬液200μl直接用甲醇破膜测定，记录成分所对应的峰面积，从标准曲线上查出各成分的含量(C0)，并计算吸附百分率。

如表4-6所示，羟基磷灰石对实施例1-3制备的脂质体中黄芪甲苷、淫羊藿苷和三七皂苷R1均有一定的吸附率。

表4 黄芪甲苷浓度及吸附率

表5 淫羊藿苷浓度及吸附率

表6 三七皂苷R1及吸附率

骨髓-血屏障(marrow-blood barrier,MBB)是药物进去骨髓发挥治疗作用的主要障碍。有报道显示，粒径是影响微粒通过MBB的关键因素。若设计微粒由内皮细胞间隙途径进入造血区域，则粒径须小于100nm，且一般认为越小越容易穿过。本发明所制备的脂质体黄芪甲苷的包封率达到了40％，淫羊藿苷和三七皂苷R1的包封率都接近20％左右，平均粒径为105nm。基本符合骨靶向脂质体的要求。

羟基磷灰石广泛存在于人体中，人体内主要分布于骨骼和牙齿中，常被用作骨替代材料。乙二胺四甲叉磷酸(EDTMPA)对骨组织有很强的亲和力，进入机体后能很快积聚在骨周围。因此，常被做骨靶向导向物。

我们以羟基磷灰石作为骨骼的替代材料来研究脂质体的靶向性，实验结果显示，本发明制备的柔性纳米脂质体靶向性很强。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.黄芪三仙汤柔性纳米脂质体的制备方法，其特征在于：所述的制备方法的具体步骤如下：

(1)按配比称取卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1，上述原料中卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1的重量比为80-120:5-15:3-10:1-5:10-15，然后放入容器中，加入甲醇氯仿混合溶剂使其充分溶解，混合溶剂与胆固醇的体积重量比为0.5-2:1ml/mg；

(2)然后溶解后的原料置于旋转蒸发器上，在30-50℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸10-20min以确保有机溶剂去除完全，减压旋蒸结束后，真空干燥过夜；

(3)配制胆酸钠PBS溶液，胆酸钠PBS溶液与胆固醇的体积重量比为1:1ml/mg，胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量与胆固醇的重量比为1-4：2，再往胆酸钠PBS溶液中加入乙二胺四甲叉磷酸，乙二胺四甲叉磷酸的加入量与胆固醇的重量比为1-3：5，然后将上述混合溶液加入到步骤(2)干燥后的原料中，并在30-50℃的恒温水浴中，常压旋蒸10-60min，制得脂质体初悬液；

(4)然后探头式超声仪对脂质体初悬液进行超声振荡，时间为3-10min，使脂质体初悬液成半透明状，最后将初悬液依次挤压通过0.80、0.45、0.22μm孔径的微孔滤膜得到本发明的柔性纳米脂质体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，卵磷脂、胆固醇、黄芪甲苷、淫羊藿苷、三七皂苷R1的重量比为100:10:6:3:13。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，甲醇氯仿混合溶剂中甲醇与氯仿的体积比为1:1。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，混合溶剂与胆固醇的体积重量比为1:1ml/mg。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，在40℃的恒温水浴中，减压旋蒸除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜，并继续旋蒸15min以确保有机溶剂去除完全。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，胆酸钠PBS溶液中胆酸钠的加入量与胆固醇的重量比为2：2。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，乙二胺四甲叉磷酸的加入量与胆固醇的重量比为1：5。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，在40℃的恒温水浴中，常压旋蒸30min，制得脂质体初悬液。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，超声时间为6min。