CN104181257B - 烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法以及所用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于农残检测领域，涉及一种烟草样品中恶霉灵农药残留的提取净化方法。本发明还涉及一种检测恶霉灵农残的方法以及用于提取净化恶霉灵或者用于检测恶霉灵的组合物或试剂盒。具体地，所述提取净化方法包括：(1)将烟草样品在碱液中浸润，加入乙酸乙酯，振荡，得到初提取液；(2)将得到的初提取液与选自如下的试剂组A－C中的任意一组混合，静置，取上清液，得到上清液1；A.硫酸镁和氯化钠，B.硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠，和C.硫酸镁、醋酸钠和醋酸。采用该方法的恶霉灵提取率高、污染性小、成本低。

Description

烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法以及所用组合物

技术领域

本发明属于农药残留提取和检测技术领域，涉及一种烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法以及所用的组合物。本发明还涉及一种检测烟草中恶霉灵农药残留的方法。

背景技术

恶霉灵俗称绿亨一号、土菌消、土菌克或绿佳宝，是一种高效广谱杀菌剂，对植物各类土传病害的病原菌如腐霉菌、苗腐菌、镰刀菌、丝核菌和根壳菌等均具有极强的灭杀与防治效果。其有效成分为3－羟基－5－甲基异恶唑(hymexazol)，结构式如下面的式I所示：

恶霉灵的杀菌机理为：施用后的恶霉灵被土壤吸收并与土壤中的金属离子结合，形成有效抑制孢子萌发和病原菌菌丝体正常生长的物质，从而灭杀病原菌。除了杀菌作用外，恶霉灵还能被植物根系吸收并在根系内传导移动，吸收和传导过程中，恶霉灵能够在植株内代谢产生糖苷，从而可促进植株根系的生长，使植株健壮，提高植物抵御低温、霜冻、干旱、涝渍、药害和肥害等的能力。

基于上述作用，恶霉灵常施用于蔬菜、水果、棉花、烟草、花卉和林木等作物，尤其适用于烟草的苗圃消毒和草枯病、黑胫病的防治工作。

目前，全球烟草年消费量高达几百万吨，随着人们对健康安全关注度的增加，烟草作物中恶霉灵农药残留对人体的毒害作用也逐渐受到关注，有资料显示恶霉灵农药残留不仅会损害人体的肠胃、肾脏器官，而且在人体代谢过程中恶霉灵转变成的亚硝基化合物容易诱发癌症等疾病。据此，需要对烟草原料中的恶霉灵农药残留进行提取，以净化烟草原料，降低恶霉灵对人体健康的威胁。

目前已经有从土壤样品或西瓜样品中提取恶霉灵农残的报道，但是提取率并不高。更重要的是，由于烟草样品有自身的特殊性，例如基体十分复杂，大量的杂质和色素可能对检测仪器带来干扰。此外，恶霉灵本身有毒，这也增加了分离净化的难度。

因此，尚无从烟草样品中提取净化恶霉灵农残的有效方法。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种高提取率的烟草中恶霉灵农药残留的提取方法。

同时，本发明涉及一种污染性小、成本低的烟草中恶霉灵农药残留的提取方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法，包括，

(1)烟草样品在碱液中浸润，加入乙酸乙酯涡旋振荡，得到初提取液；

(2)将得到的初提取液与选自如下的试剂组A－C中的任意一组混合，静置，取上清液，得到上清液1；

A.硫酸镁和氯化钠，

B.硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠，和

C.硫酸镁、醋酸钠和醋酸。

所述“烟草样品”包括但不限于干烟草或烟草制品(雪茄、香烟、鼻烟、烟丝、嚼烟和/或水烟等)的样品；所述“浸润”过程可以是将碱液加入到烟草样品中，也可以是相反的操作；所述“与乙酸乙酯相混合”可以是将乙酸乙酯加入到烟草样品与碱液混合物中，也可以是相反的操作；步骤(2)中的混合过程可以是将硫酸镁和氯化钠的混合物、柠檬酸缓冲盐试剂包或醋酸盐缓冲盐试剂包加入到初提取液中，也可以是相反的过程；所述“上清液”指烟草样品中绝大部分恶霉灵都转移至上部乙酸乙酯相中，下部为水相，因此提取上清液即将恶霉灵提取出来。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，步骤(1)中：优选，所述碱液的pH值为8-9，优选pH值为8、8.5、8.6、9。优选，所述碱液氢氧化钠和氢氧化钾水溶液中的一种或两种。优选，每克烟草样品所用碱液的体积为4.1-7.5mL，优选为5-7.5mL,优选为4.1mL、5mL、6mL、7.5mL。优选，浸润的时间为5-10min。优选，将烟草样品与碱液的混合物进行振荡以充分浸润。优选，每克烟草样品所用乙酸乙酯的体积为4-7.5mL，优选为5-7.5mL，具体为4mL、5mL、6mL、7.5mL。优选，与乙酸乙酯后混合后进行振荡；具体地，振荡的时间为2-5min。优选，所述烟草样品为粉末状。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，步骤(2)中：优选，所添加的硫酸镁和氯化钠的混合物中，以质量计，硫酸镁为烟草样品的3-4.5倍，优选为3倍、3.5倍、4倍、4.5倍，氯化钠为烟草样品的0.5-1.5倍，优选为0.5、1倍、1.5倍。优选，所添加的柠檬酸缓冲盐试剂包中，以质量计，硫酸镁为烟草样品的3-4.5倍，优选为3倍、3.5倍、4倍、4.5倍，氯化钠为烟草样品的1-1.5倍，优选为1倍、1.2倍、1.5倍，柠檬酸钠为烟草样品的1-1.5倍，优选为1倍、1.2倍、1.5倍，柠檬酸氢二钠为烟草样品的0.25-0.5，优选为0.25、0.5。优选，所添加的醋酸盐缓冲盐试剂包中，以质量计，硫酸镁为烟草样品的2-4.5倍，优选为3-4.5倍，具体为2倍、3倍、4倍、4.5倍，醋酸钠为烟草样品的0.3-1.5倍，优选为1-1.5倍，具体为0.3、1倍和1.5倍，浓度为100v.％醋酸为烟草样品的2％-4％，优选为2％、3％、4％。优选，将初提取液与硫酸镁和氯化钠的混合物、柠檬酸缓冲盐试剂包或醋酸盐缓冲盐试剂包进行振荡；优选地，振荡时间为2-5min。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，还包括向上清液1中加入石墨化炭黑，静置之后再取上部清液(上清液2)。石墨化炭黑能够去除上清液中的干扰性杂质对检测仪器的影响，提高后续恶霉灵测定的灵敏度和准确度。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，相当于每克烟草所使用的石墨化炭黑为50-100mg，优选50-75mg，优选为50mg、67mg、75mg、100mg；

根据本发明任一项所述的提取净化方法，所述上清液1与石墨化炭黑进行振荡混合。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，所述上清液1与石墨化炭黑进行漩涡振荡混合。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，所述振荡为涡旋振荡；具体地，所述漩涡振荡的速度为2000-2500r/min。

根据本发明任一项所述的提取净化方法，恶霉灵农药残留提取净化方法的流程可以如附图1所示。

本发明还涉及一种检测烟草样品中恶霉灵农残的方法，包括上述的提取净化方法；具体地，所述检测为定性或定量检测；具体地，采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法对提取净化得到的上清液或上部清液进行检测。

本发明还涉及一种组合物，包括：

碱液、乙酸乙酯，以及选自如下的A－C组中的任意一组：

A.硫酸镁和氯化钠的混合物，

B.柠檬酸缓冲盐试剂包，由硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠组成，和

C.醋酸盐缓冲盐试剂包，由硫酸镁、醋酸钠和醋酸组成；

优选地，还包括石墨化炭黑；

具体地，所述组合物为用于提取净化恶霉灵农残或者用于检测恶霉灵农残的组合物。

根据本发明任一项所述的组合物，所述组合物包含pH值为8-9的氢氧化钠水溶液10－15mL、乙酸乙酯10－15mL、无水硫酸镁，氯化钠，柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠。

在此基础上，本发明还涉及一种用于提取净化恶霉灵农残或者用于检测恶霉灵农残的试剂盒，其包含上述的组合物。

发明的有益效果

(1)本发明所述烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法，使用碱液浸润烟草，将烟草中的恶霉灵农药残留充分抽提出来，再使用乙酸乙酯进行萃取，并在后续使用硫酸镁和氯化钠的混合物、柠檬酸缓冲盐试剂包或醋酸盐缓冲盐试剂包将水相中的恶霉灵转移至乙酸乙酯相中，从而提高了烟草中恶霉灵农药残留的提取率；解决了现有方法恶霉灵提取率低的问题。使用的试剂均无毒性并且步骤简单，解决了现有技术提取法容易造成污染、成本高的问题。

(2)本发明所述烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法，采用pH值为8-9的碱液可进一步提高由烟草得到恶霉灵的提取率。限定硫酸镁和氯化钠的混合物、柠檬酸缓冲盐试剂包或醋酸盐缓冲盐试剂包相对于烟草样品的添加量，能够使水相中的恶霉灵更多地转移到乙酸乙酯相中，从而进一步提高了恶霉灵的提取率。

(3)本发明所述烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法，石墨化炭黑能够去除对后续检测产生干扰的杂质，从而避免了后续检测中的干扰，提高了检测的灵敏度和准确度，同时也提高了恶霉灵提取物的纯度；限定所述石墨化炭黑的用量，可进一步提高干扰杂质的去除率，提高检测灵敏度和准确度。

附图说明

图1：本发明烟草中恶霉灵农药残留提取净化方法的流程图。

图2：实施例1提取液的总离子流图。

图3：对比例2提取液的总离子流图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：白肋烟样品中恶霉灵农残的检测

1.恶霉灵农残的提取净化

(1)称取约2g白肋烟样品于50mL容积的具盖离心管中，加入10mL、pH值为8.5的氢氧化钠水溶液，振荡至样品被水充分浸润，静置5min。加入10mL乙酸乙酯至离心管中，并置于漩涡振荡混合仪上以2000r/min速度振荡2min，得到初提取液。

(2)向初提取液中加入如下试剂：8g无水硫酸镁、2g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸氢二钠，并于漩涡混合振荡仪上以2000r/min速度振荡2min，静置。

(3)静置后移取上层清液于离心管中，加入150mg石墨化炭黑，于漩涡混合振荡仪上以2000r/min速率振荡2min，静置后取上清液定容得到提取液。

2.恶霉灵的含量测定

将5μL提取液进样至超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用仪(美国Agilent公司的Agilent1290高效液相色谱仪和美国ABSCIEX公司的API5500三重四级杆串接质谱仪联用)中平行测定三次，测定条件如下：

色谱条件：色谱柱AgilentZORBAX300SB-C8(规格为2.1×100mm，1.8μm)；流动相：A：甲醇，B：水；梯度洗脱程序：0-4min甲醇：水＝3:7，4-10min甲醇：水＝9:1，10-15min甲醇：水＝3:7；流速：250μL/min，柱温：40℃。

质谱条件：雾化源：电子轰击源；扫描模式：正离子化扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压：5000V；离子源温度：350℃；气帘气：氮气0.15MPa；雾化气：氮气0.50MPa；碰撞气：氮气0.03Mpa；去簇电压：40V；碰撞能20V；驻留时间100ms；定量离子对(m/z)99/44；总离子流图见图2。

配置恶霉灵含量分别0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L的标准溶液，按上面方法进行检测，分别得到各自的总离子流图，以峰面积为纵坐标、恶霉灵含量为横坐标进行线性回归。由图2提取液测得的峰面积与线性回归图比较，得到该提取液的恶霉灵含量。

3.结果计算

(1)恶霉灵含量的计算

按照下式计算得到的白肋烟样品中恶霉灵含量：

烟草样品中恶霉灵含量＝(提取液中恶霉灵含量×提取液体积)/烟草样品质量＝c×20mL/0.2g。

恶霉灵含量及其相对偏差RSD结果见表1。

(2)恶霉灵回收率的计算

采用上述条件进行加标回收测定：取两份相同的提取液作试样，一份试样中加入20ul浓度为100ug/L的恶霉灵标准溶液，然后均按上述条件测定，平行测定三次并计算得到加标回收率，计算公式为：

加标回收率＝(加标试样测定值－未加标试样测定值)/加入标准物质的理论值×100％

加标试样测定值：指加入恶霉灵标准溶液的提取液测得的恶霉灵浓度；

未加标试样测定值：指未加入恶霉灵标准溶液的提取液测得的恶霉灵浓度；

加入标准物质的理论值：指恶霉灵标准溶液的浓度乘以加入的体积。

结果亦见表1。

表1三批白肋烟样品平行检测的结果

结果表明，所检测白肋烟样品中恶霉灵农药残留在0.063-0.187mg/kg之间，加标回收率在94.5-101.6％之间，相对偏差RSD在2.9-6.8之间，符合CORESTA(烟草科学研究合作中心)对烟草农残检测的要求(加标回收率在75-120％之间，相对偏差RSD<10％)。

实施例2：烤烟样品中恶霉灵农残的检测

称取约2g烤烟样品于50mL具盖离心管中，加入15mL、pH值为8.6的氢氧化钠水溶液，振荡至样品被水充分浸润，静置10min。加入15mL乙酸乙酯至离心管中，并置于漩涡混合振荡仪上以2500r/min速度振荡5min，得到初提取液；

向初提取液中加入9g无水硫酸镁、3g氯化钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2500r/min速度振荡5min，静置。

静置后移取上层清液于离心管中，加入100mg石墨化炭黑于漩涡混合振荡仪上以2200r/min速率振荡3min，静置后取上清液定容得到提取液。

按照实施例1的方法测定并计算得到烤烟样品中恶霉灵含量和其RSD，按照实施例1的方法测定并计算得到提取液的加标回收率，结果见表2。

表2烤烟样品检测结果

结果发现所检测烤烟样品中恶霉灵农药残留在0.038-0.214mg/kg之间，加标回收率在90.4-98.6％之间，相对偏差RSD在3.9-5.7之间，符合CORESTA(烟草科学研究合作中心)对烟草农残检测的要求(加标回收率在75-120％之间，相对偏差RSD<10％)。

实施例3：香料烟样品中恶霉灵农残的检测

(1)称取约3g香料烟样品于50mL具盖离心管中，加入12.5mL、pH值为9的氢氧化钠水溶液，振荡至样品被水充分浸润，静置7.5min。加入12mL乙酸乙酯至离心管中，并置于漩涡混合振荡仪上以2400r/min速度振荡3min，得到初提取液；

(2)向初提取液中加入6g硫酸镁、1g醋酸钠和0.12g100v.％的醋酸，立即于漩涡混合振荡仪上以2300r/min速度振荡4min，静置。

静置后移取上层清液于离心管中，加入200mg石墨化炭黑，于漩涡混合振荡仪上以2500r/min速率振荡5min，静置后取上清液定容得到提取液。

按照实施例1的方法测定并计算得到香料烟样品中恶霉灵含量及其RSD，按照实施例1的方法测定并计算得到提取液的加标回收率，结果见表3。

表3香料烟样品检测结果

结果发现所检测香料烟样品中恶霉灵农药残留在0.096-0.364mg/kg之间，加标回收率在89.6-99.3％之间，相对偏差RSD在2.7-7.5之间，符合CORESTA对烟草农残检测的要求(加标回收率在75-120％之间，相对偏差RSD<10)。

对比例1

称量2g实施例1中的白肋烟样品置于250mL具塞三角瓶中，加入50mL丙酮后放入恒温振荡箱中振荡提取1h，减压抽滤过滤，再用30mL丙酮分两次洗涤滤渣，合并滤液后加入1mL、2.5wt.％的碳酸钠溶液，在旋转蒸发仪上40℃浓缩使丙酮充分挥发，将提取液转入250mL分液漏斗中，再用100mL蒸馏水分两次洗涤三角瓶后一并转入250mL分液漏斗中，加入1g碳酸氢钠和10g氯化钠摇匀，用50mL、30mL和20mL乙醚进行三次萃取，弃乙醚层(溶液为碱性时，恶霉灵不溶于乙醚层，溶于水层)；将提取液用2mol/L盐酸调节至pH＝2，然后再用50mL的乙醚萃取三次，合并乙醚层(溶液为酸性时，恶霉灵溶于乙醚层)，经无水硫酸钠脱水，在旋转蒸发仪上浓缩至近干，用乙酸乙酯定容至5mL，得到提取液。

按照实施例1的方法测定并计算得到白肋烟样品中恶霉灵含量及其RSD，按照实施例1的方法测定并计算得到提取液的加标回收率，结果见表4。

表4对比例白肋烟样品检测结果

与实施例1中测定结果相比较，发现本发明所述烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法的提取率更高、样品加标回收率更高、重现性更好。

对比例2

除了不加入石墨化炭黑，其余步骤同实施例1。其总离子流图见图3。

按照实施例1的方法测定并计算得到白肋烟样品中恶霉灵含量和其RSD，按照实施例1的方法测定并计算得到提取液的加标回收率，结果见表5。

表5对比例2的白肋烟样品检测结果

由表1可计算得到实施例1样品检测的平均RSD，由表5可计算得到对比例2样品检测的平均RSD，见表6。

另外，比较实施例1的总离子流图(附图2)和对比例2提取液的总离子流图(附图3)，可以得出，使用石墨化炭黑处理后提取液对检测仪器的干扰小，从而使得谱图基线杂音小、检出限更低、灵敏度更高、平均RSD更小、重现性更好。

检出限：将0.1mg/L的恶霉灵标准溶液分别按照实施例1和对比例2的方法检测十次，十次测定结果的标准偏差的三倍即为检出限。

表6

方法	检出限(μg/L)	平均RSD(％)
			实施例1	3.2	4.3
对比例2	20.8	10.5

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (16)

1.一种烟草中恶霉灵农药残留的提取净化方法，包括下述步骤：

(1)将烟草样品在碱液中浸润，加入乙酸乙酯，振荡，得到初提取液；所述碱液的pH值为8-9；每克烟草样品所用碱液的体积为5-7.5mL；每克烟草样品所用乙酸乙酯的体积为5-7.5mL；

(2)将得到的初提取液与选自如下的试剂组A－C中的任意一组混合，静置，取上清液，得到上清液1；

A.硫酸镁和氯化钠，

B.硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠，和

C.硫酸镁、醋酸钠和醋酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)满足如下的1)至5)中的任意一项或者多项：

1)所述碱液选自氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或两种；

2)浸润的时间为5-10min；

3)将烟草样品与碱液的混合物进行振荡以充分浸润；

4)振荡的时间为2-5min；

5)所述烟草样品为粉末状。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)满足如下的1)至4)中的任意一项或者多项：

1)试剂组A中，以质量计，硫酸镁为烟草样品的3-4.5倍，氯化钠为烟草样品的0.5-1.5倍；

2)试剂组B中，以质量计，硫酸镁为烟草样品的3-4.5倍，氯化钠为烟草样品的1-1.5倍，柠檬酸钠为烟草样品的1-1.5倍，柠檬酸氢二钠为烟草样品的0.25-0.5；

3)试剂组C中，以质量计，硫酸镁为烟草样品的3-4.5倍，醋酸钠为烟草样品的1-1.5倍，浓度100v.％的醋酸为烟草样品的2％-4％；

4)将初提取液与试剂组混合后进行振荡。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，将初提取液与试剂组混合振荡时间为2-5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其还包括下述步骤：

(3)向步骤(2)中得到的上清液1中加入石墨化炭黑，静置之后取上清液，得到上清液2。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，相对于每克烟草样品，加入的石墨化炭黑为50-100mg。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，将步骤(2)中得到的上清液1与石墨化炭黑进行振荡混合。

8.根据权利要求1、2、3、4、7中任一项所述的方法，其中，所述振荡为涡旋振荡。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述漩涡振荡的速度为2000-2500r/min。

10.一种检测烟草中恶霉灵农残的方法，包括权利要求1至9中任一项所述的提取净化方法。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述检测为定性或定量检测。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法对提取净化得到的上清液1或上清液2进行检测。

13.一种组合物，由如下组分组成：

碱液、乙酸乙酯，

或者

碱液、乙酸乙酯、石墨化炭黑，

以及

选自如下的试剂组A－C中的任意一组：

A.硫酸镁和氯化钠，

B.硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠，和

C.硫酸镁、醋酸钠和醋酸。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述组合物为用于提取净化恶霉灵农残或者用于检测恶霉灵农残的组合物。

15.根据权利要求13或14所述的组合物，其由pH值为8-9的氢氧化钠水溶液10－15mL、乙酸乙酯10－15mL、无水硫酸镁6-9g、氯化钠1-3g、柠檬酸钠0.5-1.5g和柠檬酸氢二钠0.2-1g组成，或者其由pH值为8-9的氢氧化钠水溶液10－15mL、乙酸乙酯10－15mL、石墨化炭黑100-200mg、无水硫酸镁6-9g、氯化钠1-3g、柠檬酸钠0.5-1.5g和柠檬酸氢二钠0.2-1g组成。

16.一种用于提取净化恶霉灵农残或者用于检测恶霉灵农残的试剂盒，其包含权利要求13-15任一项所述的组合物。