CN104178561B

CN104178561B - 一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN104178561B
Application number: CN201410213044.2A
Authority: CN
Inventors: 段世伟; 汤琳琳; 麦一峰; 叶孟
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2034-05-20
Also published as: CN104178561A

Abstract

本发明公开了一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含用于检测PDPK1基因、GCK基因、PIK3R2基因、MAPK9基因、CBLC基因、MKNK2基因、FLOT2基因、TRIP10基因及KRAS基因单核苷酸多态性的引物，所述的单核苷酸多态性分别为rs76318740、rs12702070、rs3736328、rs1363513、rs2965143、rs3810412、rs4795473、rs340141及rs7311692其通过将检测试剂盒的引物对样品DNA进行PCR扩增，并对PCR扩增产物用荧光定量PCR仪分析熔解曲线，再将熔解曲线与标准熔解曲线进行比较，对比PCR扩增产物的Tm值，获得相应的基因分型结果。本检测试剂盒可以辅助检测、预测受试者的糖尿病，检测方法简单，检测效率高，针对性强，从而能够促进2型糖尿病的早期预防和为用药治疗提供参考。

Description

一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及糖尿病的辅助诊断技术领域，特别涉及一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，是由于血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。糖尿病的患病率随着生活条件的改善生活水平提高都呈逐渐增长的趋势。据统计，目前中国糖尿病患病人数接近一亿，患病率高达9.7％。糖尿病不是单一疾病，是由遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。其中2型糖尿病发病人数约占糖尿病总发病人数的97％。2型糖尿病过去主要在超过40岁的成年人中发病，而现在2型糖尿病的发病正趋向低龄化。

目前国内外对2型糖尿病机制的研究也越来越多。单核苷酸多态性(SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，是第三代分子标记。据估计，大约有10亿个SNP分子标记将被用于基因功能及与疾病的相关性的关联研究。而关于2型糖尿病分子机制CpG-SNP方面的研究甚少。CpG-SNP是指可以发生CG突变的SNP位点。已有相关研究报道表明2型糖尿病的发生与CpG-SNP有关，主要是SNP的突变通过对CpG位点的DNA甲基化影响而干扰基因功能的表达。一些CpG位点的引入或消除可能是2型糖尿病的发生密切相关。胰岛素信号通路是与2型糖尿病发生密切相关的一条通路。

PDPK1、GCK、PIK3R2、MAPK9、CBLC、MKNK2、FLOT2、TRIP10、KRAS属于胰岛素通路中的一部分基因。PDPK1主要编码3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)蛋白，而PDPK1蛋白可以调节AGC家族中部分重要的蛋白激酶，包括蛋白激酶、血清和糖皮质激素诱导激酶；GCK编码葡萄糖激酶，而葡萄糖激酶是促进葡萄糖磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的关键酶；PIK3是PI3K/AKT通路中的一个重要基因，PI3K/AKT通路参与体内血糖稳态的调节；MAPK9编码的JNK2蛋白与胰岛beta细胞的破坏有关，也参与调节Th1/Th2免疫细胞；CBLC编码的蛋白属于Cb1家族，也参与了氰钴胺素细胞内代谢，它与糖尿病酮症酸中毒相关；MKNK2参与了胰岛素信号通路对胰岛素信号的调节，它的过度表达会抑制胰岛素抵抗；FLOT2编码的蛋白与细胞内小泡运输和信号转导有关；TRIP10可以通过PI3K/AKT通路促进糖诱导的间质上皮转化；KRAS编码的蛋白属于GTP酶家族中的一员，GTP酶参与了糖代谢。

但目前，国内外还没有公开任何用于检测该胰岛素通路PDPK1基因rs76318740单核苷酸多态性、GCK基因rs12702070单核苷酸多态性、PIK3R2基因rs3736328单核苷酸多态性、MAPK9基因rs1363513单核苷酸多态性、CBLC基因rs2965143单核苷酸多态性、MKNK2基因rs3810412单核苷酸多态性、FLOT2基因rs4795473单核苷酸多态性、TRIP10基因rs340141单核苷酸多态性、KRAS基因rs7311692单核苷酸多态性与2型糖尿病相关程度的试剂盒的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、检测准确率高的一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒；通过基因引物对样品DNA进行PCR扩增，并建立熔解曲线与标准熔解曲线相比较得出结论，其检测方法简单、高效。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含用于检测PDPK1基因、GCK基因、PIK3R2基因、MAPK9基因、CBLC基因、MKNK2基因、FLOT2基因、TRIP10基因及KRAS基因单核苷酸多态性的引物，所述的单核苷酸多态性分别为rs76318740、rs12702070、rs3736328、rs1363513、rs2965143、rs3810412、rs4795473、rs340141及rs7311692，所述的引物包括：

PDPK1基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCAGCTGCCCCTCTCTCCCc-3’；

PDPK1基因特异性上游引物二：5’-gattaccgCAGCTGCCCCTCTCTCCCt-3’；

PDPK1基因下游引物：5’-AGAAAGCATCTGAGCAGGCACCAG-3’；

GCK基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCCTTGTCACTACAGTGACCGCc-3’；

GCK基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCCTTGTCACTACAGTGACCGCt-3’；

GCK基因下游引物：5’-CAGGTGGCAAAGGCTTAACAGG-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGGAAATGGCCGAACACTCTCTACc-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGGAAATGGCCGAACACTCTCTACg-3’；

PIK3R2基因下游引物：5’-ATCAGCCTCAGTTGTGCCAGTGC-3’；

MAPK9基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCGTGGAGAGCCGGCCg-3’；

MAPK9基因特异性上游引物二：5’-gattaccgCGTGGAGAGCCGGCCt-3’；

MAPK9基因下游引物：5’-AACCATTGTTCCCACTCTTCTAGTCCC-3’；

CBLC基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGAGGACCACTTGAGCCCCg-3’；

CBLC基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGAGGACCACTTGAGCCCCa-3’；

CBLC基因下游引物：5’-TGTTGGATCACCACTCATTGCA-3’；

MKNK2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGc-3’；

MKNK2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGt-3’；

MKNK2基因下游引物：5’-CACCACCAGCACGCTTGGAGTC-3’；

FLOT2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTc-3’；

FLOT2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTt-3’；

FLOT2基因下游引物：5’-AATACACACCACTGTGCCTAGCCC-3’；

TRIP10基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCGAACCTAGACGCCTGGAGCc-3’；

TRIP10基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCGAACCTAGACGCCTGGAGCt-3’；

TRIP10基因下游引物：5’-CCTGAGGTCACCCCGTTCTTGC-3’；

KRAS基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcTGACCGGTCTCCACAGAGAAGc-3’；

KRAS基因特异性上游引物二：5’-gattaccgTGACCGGTCTCCACAGAGAAGg-3’；

KRAS基因下游引物：5’-AGTATAGGCCGACCCTGAGGGTG-3’。

一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

步骤一：对标准样品进行PCR扩增建立标准熔解曲线；

步骤二：用检测试剂盒对样品DNA进行PCR扩增；

步骤三：将步骤二中的PCR扩增产物用荧光定量PCR仪分析熔解曲线，并与步骤一中建立的标准熔解曲线进行比较，对比PCR扩增产物的Tm值，获得相应的基因分型结果。

上述的步骤二中PCR扩增的扩增程序为：95℃初始变性阶段30s；接着95℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸5min。

上述步骤三中熔解曲线分析方法为：将PCR产物置于荧光定量PCR仪中，95℃变性15s，60℃复性30s，再以0.11℃/s的速度上升到95℃，期间连续采集荧光信号，40℃维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。

上述的步骤三中的PCR扩增产物熔解曲线中，

PDPK1基因熔解曲线：熔解温度62±0.5℃的为TT型，熔解温度67±0.5℃的为CC型，熔解温度62±0.5℃和67±0.5℃的为TC型；

GCK基因熔解曲线：熔解温度60±0.5℃的为TT型，熔解温度64±0.5℃的为CC型，熔解温度60±0.5℃和64±0.5℃的为TC型；

PIK3R2基因熔解曲线：熔解温度62±0.5℃的为GG型，熔解温度67±0.5℃的为CC型，熔解温度62±0.5℃和67±0.5℃的为GC型；

MAPK9基因熔解曲线：熔解温度61±0.5℃的为TT型，熔解温度65±0.5℃的为GG型，熔解温度61±0.5℃和65±0.5℃的为GT型；

CBLC基因熔解曲线：熔解温度59±0.5℃的为AA型，熔解温度63±0.5℃的为GG型，熔解温度59±0.5℃和63±0.5℃的为AG型；

MKNK2基因熔解曲线：熔解温度62±0.5℃的为TT型，熔解温度68±0.5℃的为CC型，熔解温度62±0.5℃和68±0.5℃的为TC型；

FLOT2基因熔解曲线：熔解温度59±0.5℃的为TT型，熔解温度64±0.5℃的为CC型，熔解温度59±0.5℃和64±0.5℃的为TC型；

TRIP10基因熔解曲线：熔解温度63±0.5℃的为TT型，熔解温度68±0.5℃的为CC型，熔解温度63±0.5℃和68±0.5℃的为TC型；

KRAS基因熔解曲线：熔解温度61±0.5℃的为GG型，熔解温度65±0.5℃的为CC型，熔解温度61±0.5℃和65±0.5℃的为GC型。

本发明首次公开了可用于检测胰岛素通路PDPK1基因rs76318740单核苷酸多态性、GCK基因rs12702070单核苷酸多态性、PIK3R2基因rs3736328单核苷酸多态性、MAPK9基因rs1363513单核苷酸多态性、CBLC基因rs2965143单核苷酸多态性、MKNK2基因rs3810412单核苷酸多态性、FLOT2基因rs4795473单核苷酸多态性、TRIP10基因rs340141单核苷酸多态性和KRAS基因rs7311692单核苷酸多态性与2型糖尿病相关程度的试剂盒及其应用。该胰岛素通路中等位基因突变，其相对应的危险基因是2型糖尿病发生的重要因素，与2型糖尿病强相关。因此通过检测rs76318740位点T等位基因、rs12702070位点C等位基因、、rs3736328位点C等位基因、rs1363513位点G等位基因、rs2965143位点A等位基因、rs3810412位点T等位基因、rs4795473位点C等位基因、rs340141位点T等位基因及rs7311692位点G等位基因，可以辅助检测、预测受试者的2型糖尿病，检测效率高，针对性强，因此能够促进疾病的早期发现、早期预防，并为临床用药和治疗提供参考。

本方法采用SYBRGreenI的MeltingTemperatureshift(Tm-shift)法来检测病例组、前期糖尿病组和正常组基因型。Tm-shift是一种新的基因分型方法，主要通过在两条特异性引物5′端加入不同长度的GC序列，PCR扩增后根据熔解曲线中产物Tm值的差异来完成分型。SYBRGreenI是一种在Real-timePCR中使用广泛且成熟的双链DNA(dsDNA)染料。其非特异性地嵌合于双链DNA双螺旋结构中的小沟内，一般不与单链DNA结合，结合状态的荧光强度较之游离状态的荧光增加数千倍。在激发光的作用下发出荧光信号。荧光强度随温度变化，当两条DNA分子复性结合时荧光最强，随温度上升荧光强度降低并出现一较恒定的坡度。当DNA片段在加热过程中达到熔解温度，即达到Tm值时，双链分开，SYBRGreenI从DNA上释放出来，导致荧光信号减弱。经过软件分析可得到熔解曲线图，其波峰所在的温度代表双链DNA分子的Tm值。Tm值的大小取决于DNA分子的长度及其序列中G/C含量。熔解曲线完成后，根据特异性引物的设计，即可获得相应的基因分型结果。判读分型结果时，将HH纯合子与LL纯合子峰值最小差距3℃作为分型判断的依据。为了保证实验的准确度，选取基因型已知的3种不同基因型的样本，在每一块96孔板中放入标准品作为阳性对照，以区分3种基因型的熔解峰。

Tm-shift法方法简单易行，耗时仅2小时左右，每次可同时检测96个标本，操作简便，是一种既能满足中低通量研究需要又能高性价比完成基因分型的方法。由于实验全程闭管操作，避免了PCR扩增产物的污染，减少了假阳性结果，准确性高。某一型的引物只与相同型的模板结合才发生PCR扩增反应，从而保证了检测的特异性。

本发明的优点在于，所建立的Tm-shift法操作简便，准确度高，重复性好，成本低廉，是在扩增结束后，对PCR产物进行熔解曲线分析的终点分析方法，无需一直进行实时荧光检测。

附图说明

图1为Tm-shift法检测PDPK1基因rs76318740单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图2为Tm-shift法检测GCK基因rs12702070单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图3为Tm-shift法检测PIK3R2基因rs3736328单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图4为Tm-shift法检测MAPK9基因rs1363513单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图5为Tm-shift法检测CBLC基因rs2965143单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图6为Tm-shift法检测MKNK2基因rs3810412单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图7为Tm-shift法检测FLOT2基因rs4795473单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图8为Tm-shift法检测TRIP10基因rs340141单核苷酸多态性的熔解温度曲线图；

图9为Tm-shift法检测KRAS基因rs7311692单核苷酸多态性的熔解温度曲线图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

PDPK1基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCAGCTGCCCCTCTCTCCCc-3’；

PDPK1基因特异性上游引物二：5’-gattaccgCAGCTGCCCCTCTCTCCCt-3’；

PDPK1基因下游引物：5’-AGAAAGCATCTGAGCAGGCACCAG-3’；

GCK基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCCTTGTCACTACAGTGACCGCc-3’；

GCK基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCCTTGTCACTACAGTGACCGCt-3’；

GCK基因下游引物：5’-CAGGTGGCAAAGGCTTAACAGG-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGGAAATGGCCGAACACTCTCTACc-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGGAAATGGCCGAACACTCTCTACg-3’；

PIK3R2基因下游引物：5’-ATCAGCCTCAGTTGTGCCAGTGC-3’；

MAPK9基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCGTGGAGAGCCGGCCg-3’；

MAPK9基因特异性上游引物二：5’-gattaccgCGTGGAGAGCCGGCCt-3’；

MAPK9基因下游引物：5’-AACCATTGTTCCCACTCTTCTAGTCCC-3’；

CBLC基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGAGGACCACTTGAGCCCCg-3’；

CBLC基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGAGGACCACTTGAGCCCCa-3’；

CBLC基因下游引物：5’-TGTTGGATCACCACTCATTGCA-3’；

MKNK2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGc-3’；

MKNK2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGt-3’；

MKNK2基因下游引物：5’-CACCACCAGCACGCTTGGAGTC-3’；

FLOT2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTc-3’；

FLOT2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTt-3’；

FLOT2基因下游引物：5’-AATACACACCACTGTGCCTAGCCC-3’；

TRIP10基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCGAACCTAGACGCCTGGAGCc-3’；

TRIP10基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCGAACCTAGACGCCTGGAGCt-3’；

TRIP10基因下游引物：5’-CCTGAGGTCACCCCGTTCTTGC-3’；

KRAS基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcTGACCGGTCTCCACAGAGAAGc-3’；

KRAS基因下游引物：5’-AGTATAGGCCGACCCTGAGGGTG-3’。

步骤一：对标准样品进行PCR扩增建立标准熔解曲线；

步骤二：用检测试剂盒对样品DNA进行PCR扩增；

所述的步骤二中PCR扩增的扩增程序为：95℃初始变性阶段30s；接着95℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸5min。

所述步骤三中熔解曲线分析方法为：将PCR产物置于荧光定量PCR仪中，95℃变性15s，60℃复性30s，再以0.11℃/s的速度上升到95℃，期间连续采集荧光信号，40℃维持；根据荧光强度进行聚类分析获得熔解曲线数据。

所述的步骤三中的PCR扩增产物熔解曲线中，

研究对象的收集：从深圳南山社区卫生服务中心收集2型糖尿病患者，共708例，前期糖尿病患者253例及正常人575例。所有的参与者都没有心肌梗塞、先天性心脏疾病、肝脏或者肾脏疾病。

1.血清DNA的提取

应用Lab-Aid820全自动核酸提取仪(中国厦门致善生物科技有限公司，500u1体系)提取样本的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度。

2.引物设计：以PDPK1基因为例，根据NCBIdbSNP网站下载的目标SNPrs76318740附近序列，设计特异性引物，序列为5’-CAGCTGCCCCTCTCTCCCt-3’；并在特异性上游引物5′端分别加入富含GC的序列——14bp的长序列(5′-GCGGGCAGGGCGGC-3′)和8bp的短序列(5′-GATTACCG-3′)，并且在3′末端加入到碱基与SNP的等位基因变异体配对，人为地扩大了PCR产物Tm值的差距，使产物的Tm值更易区分。引物序列如下：

PDPK1基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因：

5’-gcgggcagggcggcCAGCTGCCCCTCTCTCCCc-3’；

PDPK1基因特异性上游引物二；用于检测t等位基因：

5’-gattaccgCAGCTGCCCCTCTCTCCCt-3’；

PDPK1基因下游引物：5’-AGAAAGCATCTGAGCAGGCACCAG-3’。

该胰岛素通路中其他基因的引物序列如下：

GCK基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因：

5’-gcgggcagggcggcCCTTGTCACTACAGTGACCGCc-3’；

GCK基因特异性上游引物二；用于检测t等位基因：

5’-gattaccgCCTTGTCACTACAGTGACCGCt-3’；

GCK基因下游引物：5’-CAGGTGGCAAAGGCTTAACAGG-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因；：

5’-gcgggcagggcggcGGAAATGGCCGAACACTCTCTACc-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物二；用于检测g等位基因：

5’-gattaccgGGAAATGGCCGAACACTCTCTACg-3’；

PIK3R2基因下游引物：5’-ATCAGCCTCAGTTGTGCCAGTGC-3’；

MAPK9基因特异性上游引物一；用于检测g等位基因：

5’-gcgggcagggcggcCGTGGAGAGCCGGCCg-3’；

MAPK9基因特异性上游引物二；用于检测t等位基因：

5’-gattaccgCGTGGAGAGCCGGCCt-3’；

MAPK9基因下游引物：5’-AACCATTGTTCCCACTCTTCTAGTCCC-3’；

CBLC基因特异性上游引物一；用于检测g等位基因：

5’-gcgggcagggcggcGAGGACCACTTGAGCCCCg-3’；

CBLC基因特异性上游引物二；用于检测a等位基因：

5’-gattaccgGAGGACCACTTGAGCCCCa-3’；

CBLC基因下游引物：5’-TGTTGGATCACCACTCATTGCA-3’；

MKNK2基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因：

5’-gcgggcagggcggcCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGc-3’；

MKNK2基因特异性上游引物二；用于检测t等位基因：

5’-gattaccgCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGt-3’；

MKNK2基因下游引物：5’-CACCACCAGCACGCTTGGAGTC-3’；

FLOT2基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因：

5’-gcgggcagggcggcGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTc-3’；

FLOT2基因特异性上游引物二；用于检测t等位基因：

5’-gattaccgGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTt-3’；

FLOT2基因下游引物：5’-AATACACACCACTGTGCCTAGCCC-3’；

TRIP10基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因：

5’-gcgggcagggcggcCGAACCTAGACGCCTGGAGCc-3’；

TRIP10基因特异性上游引物二；用于检测t等位基因：

5’-gattaccgCGAACCTAGACGCCTGGAGCt-3’；

TRIP10基因下游引物：5’-CCTGAGGTCACCCCGTTCTTGC-3’；

KRAS基因特异性上游引物一；用于检测c等位基因：

5’-gcgggcagggcggcTGACCGGTCTCCACAGAGAAGc-3’；

KRAS基因特异性上游引物二；用于检测g等位基因：

5’-gattaccgTGACCGGTCTCCACAGAGAAGg-3’；

KRAS基因下游引物：5’-AGTATAGGCCGACCCTGAGGGTG-3’

3.PCR扩增和熔解曲线分析

(1)建立PCR反应体系：总反应体系为12μL，两条特异性上游引物和一条反向引物各0.25μL(体系中引物含量分别为0.1μmol/L)，2μL的基因组DNA(20ng)，480SYBRGreenIMaster(包含FastStartTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合物，SYBRGreenI染料，MgCl₂)6μL，加高纯水补足至12μL。

(2)进行PCR扩增，扩增程序：95℃初始变性阶段30s；接着95℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

(3)熔解曲线分析：将PCR产物放入RocheLightCycler480荧光定量PCR仪中。熔解曲线程序：95℃15s，60℃30s，以0.11℃/s的速度使温度上升到95℃，期间连续采集荧光信号，40℃维持。熔解曲线数据由Roche提供的机载软件自动根据荧光强度进行聚类分析获得。熔解曲线完成后，对比Tm值，即可获得相应的基因分型结果。为了确保分型的准确性，我们在每一块96孔板中放入标准品作为阳性对照，以区分3种基因型的熔解峰。在我们的实验中，标准品对照的重复性达到了100％。

4.数据分析

本次研究采用Arlequin软件(v3.5)，SPSS16.0对数据进行整理分析。

为验证上述方法的准确性，随机抽取80个样本进行测序鉴定，结果显示，上述Tm-shift检测结果与测序结果一致。

5.基因分型结果

本发明根据Tm值判断基因型。

PDPK1基因：

LL纯合子，即TT：Tm为62±0.5℃，HH纯合子，即CC：Tm为67±0.5℃；LH杂合子即CT，Tm为62±0.5℃及67±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图1),676例2型糖尿病患者中，CC占了75.74%(512/676)；CT占了23.52%(159/676)；TT占了0.74%(5/676)。246例前期糖尿病患者中，CC占了73.17%(180/246)；CT占了24.39%(60/246)；TT占了2.44%(6/246)。

GCK基因：

LL纯合子，即TT：Tm为60±0.5℃，HH纯合子，即CC：Tm为64±0.5℃；LH杂合子即CT，Tm为60±0.5℃及64±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图2),675例2型糖尿病患者中，TT占了80.44%(543/675)；CT占了18.67%(126/675)；CC占了0.89%(6/675)。245例前期糖尿病患者中，TT占了80.41%(197/245)；CT占了17.96%(44/245)；CC占了1.63%(4/245)。

PIK3R2基因：

LL纯合子，即CC：Tm为62±0.5℃，HH纯合子，即GG：Tm为67±0.5℃；LH杂合子即CG，Tm为62±0.5℃及67±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图3),676例2型糖尿病患者中，CC占了55.62%(376/676)；CG占了37.28%(252/676)；GG占了7.10%(48/676)。246例前期糖尿病患者中，GG占了58.54%(144/246)；GT占了35.37%(87/246)；TT占了6.09%(15/246)。

MAPK9基因：

LL纯合子，即TT：Tm为61±0.5℃，HH纯合子，即GG：Tm为65±0.5℃；LH杂合子即GT，Tm为61±0.5℃及65±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图4),676例2型糖尿病患者中，TT占了67.90%(459/676)；TG占了28.55%(193/676)；GG占了3.55%(24/676)。246例前期糖尿病患者中，TT占了68.70%(169/246)；TG占了28.46%(70/246)；GG占了2.84%(7/246)。

CBLC基因：

LL纯合子，即AA：Tm为59±0.5℃，HH纯合子，即GG：Tm为63±0.5℃；LH杂合子即AG，Tm为59±0.5℃及63±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图5),676例2型糖尿病患者中，AA占了31.95%(216/676)；AG占了51.63%(349/676)；GG占了16.42%(111/676)。246例前期糖尿病患者中，AA占了44.72%(110/246)；AG占了40.24%(99/246)；GG占了15.04%(37/246)。

MKNK2基因：

LL纯合子，即TT：Tm为62±0.5℃，HH纯合子，即CC：Tm为68±0.5℃；LH杂合子即CT，Tm为62±0.5℃及68±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图6),703例2型糖尿病患者中，CC占了79.23%(557/703)；CT占了19.63%(138/703)；TT占了1.14%(8/703)。253例前期糖尿病患者中，CC占了84.19%(213/253)；CT占了15.02%(38/253)；TT占了0.79%(2/253)。

FLOT2基因：

LL纯合子，即TT：Tm为59±0.5℃，HH纯合子，即CC：Tm为64±0.5℃；LH杂合子即CT，Tm为59±0.5℃及64±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图7),703例2型糖尿病患者中，TT占了50.07%(352/703)；CT占了42.82%(301/703)；CC占了2.28%(16/703)。253例前期糖尿病患者中，CC占了47.83%(121/253)；CT占了45.85%(116/253)；TT占了6.32%(16/253)。

TRIP10基因：

LL纯合子，即TT：Tm为63±0.5℃，HH纯合子，即CC：Tm为68±0.5℃；LH杂合子即CT，Tm为63±0.5℃及68±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图8),703例2型糖尿病患者中，CC占了61.17%(430/703)；CT占了34.85%(245/703)；TT占了3.98%(28/703)。253例前期糖尿病患者中，CC占了67.59%(171/253)；CT占了30.04%(76/253)；TT占了2.37%(6/253)。

KRAS基因：

LL纯合子，即CC：Tm为61±0.5℃，HH纯合子，即GG：Tm为65±0.5℃；LH杂合子即CG，Tm为61±0.5℃及65±0.5℃。

应用Tm-shift法检测基因型(图9),703例2型糖尿病患者中，CC占了81.93%(576/703)；CG占了17.21%(121/703)；GG占了0.85%(6/703)。253例前期糖尿病患者中，CC占了86.96%(220/253)；CG占了12.65%(32/253)；GG占了0.39%(1/253)。

基因分型与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性：

(1)PDPK1基因rs76318740与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表1：rs76318740基因型和等位基因分布结果

表中a：2型糖尿病与正常人的比较；b：前期糖尿病与正常人的比较；c:2型糖尿病、前期糖尿病与正常人三者之间的比较

表2：rs76318740显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表1和表2所示，不论在总体、男性还是女性中，PDPK1rs76318740在2型糖尿病、前期糖尿病与对照组之间并没有明显差异，但在女性中2型糖尿病其遗传方式为隐性遗传。

(2)GCK基因rs12702070与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表3：rs12702070基因型和等位基因分布结果

表4：rs12702070显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表3和表4所示，在男性中，GCKrs12702070不论在2型糖尿病患者还是前期糖尿病患者中都与对照组有明显差异，且在在男性的2型糖尿病和前期糖尿病的遗传方式为显性遗传。

(3)PIK3R2基因rs3736328与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表5：rs3736328基因型和等位基因分布结果

表6：rs3736328显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表5和表6所示，不论在总体、男性还是女性中，PIK3R2rs3736328在2型糖尿病、前期糖尿病与对照组之间并没有明显差异，但在男性中2型糖尿病其遗传方式为隐性遗传。

(4)MAPK9基因rs1363513与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表7：rs1363513基因型和等位基因分布结果

表8：rs1363513显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表7和表8所示，在男性中，MAPK9rs1363513在2型糖尿病与对照组之间有明显差异，其遗传方式为显性遗传。

(5)CBLC基因rs2965143与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表9：rs2965143基因型和等位基因分布结果

表10：rs2965143显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表9和表10所示，在总体中，CBLCrs2965143在前期糖尿病与对照组之间有明显差异，其遗传方式为显性遗传。

(6)MKNK2基因rs3810412与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表11：rs3810412基因型和等位基因分布结果

表12：rs3810412显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表11和表12所示，在男性中，MKNK2rs3810412在2型糖尿病与对照组之间比较有差异。男性中的MKNK2rs3810412在2型糖尿病中其遗传方式为显性遗传。

FLOT2基因rs4795473与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表13：rs4795473基因型和等位基因分布结果

表14：rs4795473显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表13和表14所示，在女性中，FLOT2rs4795473在2型糖尿病、前期糖尿病与对照组之间比较有显著差异。总体的FLOT2rs4795473在2型糖尿病中其遗传方式为隐性遗传。

TRIP10基因rs340141与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表15：rs340141基因型和等位基因分布结果

表16：rs340141显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表15和表16所示，不论在总体、男性还是女性中，TRIP10rs340141在前期糖尿病与对照组之间比较有显著差异。总体的TRIP10rs340141在糖前期尿病中显隐性遗传方式都存在，男女性的TRIP10rs340141在糖前期尿病中其遗传方式分别为隐性遗传和显性遗传。

KRAS基因rs7311692与2型糖尿病及前期糖尿病的相关性(P<0.05即存在相关性)

表17：rs7311692基因型和等位基因分布结果

表18：rs7311692显隐性模式下的基因检测结果

通过对比，我们发现：如表17和表18所示，在总体中，KRASrs7311692在前期糖尿病与对照组之间比较有显著差异。

本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。

SEQUENCELISTING

<110>宁波大学

<120>一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒及其使用方法

<130>

<160>27

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcgggcagggcggccagctgcccctctctcccc

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gattaccgcagctgccccctctctcct

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

Agaaagcatctgagcaggcaccag

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gcgggcagggcggcccttgtcactacagtgaccgcc

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gattaccgccttgtcactacagtgaccgct

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

caggtggcaaaggcttaacagg

<210>7

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gcgggcagggcggcggaaatggccgaacactctctacc

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gattaccgggaaatggccgaacactctctacg

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

atcagcctcagttgtgccagtgc

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gcgggcagggcggccgtggagagccggccg

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gattaccgcgtggagagccggcct

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

aaccattgttcccactcttctagtccc

<210>13

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gcgggcagggcggcgaggaccacttgagccccg

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gattaccggaggaccacttgagcccca

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tgttggatcaccactcattgca

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gcgggcagggcggccccagcactagaagggagtggc

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gattaccggtaggcaggaagaaagaaaggagtt

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

caccaccagcacgcttggagtc

<210>19

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

gcgggcagggcggcgtaggcaggaagaaagaaaggagtc

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

aatacacaccactgtgcctagccc

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

aatacacaccactgtgcctagcctagccc

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gcgggcagggcggccgaacctagacgcctggagcc

<210>23

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

gattaccgcgaacctagacgcctggagct

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

cctgaggtcaccccgttcttgc

<210>25

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

gcgggcagggcggctgaccggtctccacagagaagc

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

gattaccgtgaccggtctccacagagaagg

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

agtataggccgaccctgagggtg

Claims

1.一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒包含用于检测PDPK1基因、GCK基因、PIK3R2基因、 MAPK9基因、CBLC基因、MKNK2基因、FLOT2基因、TRIP10基因及KRAS基因单核苷酸多态性的引物，所述的单核苷酸多态性分别为rs76318740、rs12702070、rs3736328、rs1363513、rs2965143、rs3810412、rs4795473、rs340141及rs7311692，所述的引物包括：

PDPK1基因特异性上游引物一:

5’-gcgggcagggcggcCAGCTGCCCCTCTCTCCCc-3’；

PDPK1基因特异性上游引物二：5’-gattaccgCAGCTGCCCCTCTCTCCCt-3’；

PDPK1基因下游引物：5’-AGAAAGCATCTGAGCAGGCACCAG-3’；

GCK基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCCTTGTCACTACAGTGACCGCc-3’；

GCK基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCCTTGTCACTACAGTGACCGCt-3’；

GCK基因下游引物：5’-CAGGTGGCAAAGGCTTAACAGG-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGGAAATGGCCGAACACTCTCTACc-3’；

PIK3R2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGGAAATGGCCGAACACTCTCTACg-3’；

PIK3R2基因下游引物：5’-ATCAGCCTCAGTTGTGCCAGTGC-3’；

MAPK9基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCGTGGAGAGCCGGCCg-3’；

MAPK9基因特异性上游引物二：5’-gattaccgCGTGGAGAGCCGGCCt-3’；

MAPK9基因下游引物：5’-AACCATTGTTCCCACTCTTCTAGTCCC-3’；

CBLC基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGAGGACCACTTGAGCCCCg-3’；

CBLC基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGAGGACCACTTGAGCCCCa-3’；

CBLC基因下游引物：5’-TGTTGGATCACCACTCATTGCA-3’；

MKNK2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGc-3’；

MKNK2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCCCAGCACTAGAAGGGAGTGGt-3’；

MKNK2基因下游引物：5’-CACCACCAGCACGCTTGGAGTC-3’；

FLOT2基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTc-3’；

FLOT2基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgGTAGGCAGGAAGAAAGAAAGGAGTt-3’；

FLOT2基因下游引物：5’-AATACACACCACTGTGCCTAGCCC-3’；

TRIP10基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcCGAACCTAGACGCCTGGAGCc-3’；

TRIP10基因特异性上游引物二：

5’-gattaccgCGAACCTAGACGCCTGGAGCt-3’；

TRIP10基因下游引物：5’-CCTGAGGTCACCCCGTTCTTGC-3’；

KRAS基因特异性上游引物一：

5’-gcgggcagggcggcTGACCGGTCTCCACAGAGAAGc-3’；

KRAS基因特异性上游引物二：5’-gattaccgTGACCGGTCTCCACAGAGAAGg-3’；

KRAS基因下游引物：5’-AGTATAGGCCGACCCTGAGGGTG-3’。