CN104173568A - 一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，它是由下述重量配比的生地、山茱萸有效部位制备而成：生地总环烯醚萜苷提取物2-3份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物3-5份、山茱萸总三萜酸提取物0.5-1.5份。该组合物经STZ致C57BL/6小鼠糖尿病模型的研究结果表明，该组合物能够明显改善糖尿病小鼠“三多一少”症状，降低血糖值，增加胰岛素的分泌，降低血清肌酐、尿素氮、AGEs水平，增加尿肌酐和减少尿蛋白的排出，改善胰腺、肾脏、睾丸、心脏病理变化。表明该组合物具有降血糖及抗糖尿病血管病变的作用。

Description

一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物

技术领域

本发明涉及一种中药的有效部位组合物，特别是一种用于防治糖尿病及其血管病变的有效部位配伍组合物。

背景技术

近年来，糖尿病(DiabetesMellitus，DM)患病人数迅速增加，成为继肿瘤和心脑血管疾病之后，严重威胁人类生命健康的第三大疾病。众所周知，糖尿病的可怕之处并不在于其表面的“三多一少”症状，其后续引起的并发症才是糖尿病致死致残的主要原因，而糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症，其大血管病变性质为动脉粥样硬化，主要累及主动脉、冠状动脉等大血管，而糖尿病的微血管病变是糖尿病特有的慢性血管并发症，主要表现为肾脏、睾丸等微血管病变。糖尿病血管病变是由高血糖引起的多种代谢途径发生异常，使血管细胞的结构功能发生改变的缘故。所以预防和改善糖尿病血管病变的关键在于控制血糖和保护血管细胞。糖尿病血管病变的病理机制尚不明确，主要流行的假说有非酶糖基化学说、多元醇通路学说、氧化应激学说等。目前用于治疗糖尿病血管病变的化学物质主要有蛋白质非酶糖基化抑制剂(NEDI)、醛糖还原酶抑制剂(ARI)，它们都存在着相应的副作用，且尚未进入到临床应用中来。因此从目前的治疗现状来看，西医治疗糖尿病血管病变仍然处在摸索阶段，尚未发现有效治疗的药物。而中医药治疗糖尿病及其并发症有着相当悠久的历史，毒副作用较小且从根本上对症下药，在治疗糖尿病过程中发挥着不可替代的作用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明目的在于提供了一种用于防治糖尿病及其血管病变的有效部位配伍组合物。

本发明目的是通过以下的技术方案来实现的：

一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于它是由下述重量配比的生地、山茱萸有效部位制备而成：

生地总环烯醚萜苷提取物2-3份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物3-5份、山茱萸总三萜酸提取物0.5-1.5份。

生地总环烯醚萜苷提取物的制备方法为：称取生地药材，粉碎过筛，进行3次提取，第一次加入10倍量水，提取2h，过滤得提取液Ⅰ；第二次在药渣中加入6倍量水，提取1h，得提取液Ⅱ；第三次在药渣中加入4倍量水，提取1h，得提取液Ⅲ，合并各次提取液，浓缩至1g生药/mL，加醇至浓度为70％醇沉，静置24h，过滤，浓缩后载入D101树脂，用水洗脱，收集水洗脱液，直至梓醇峰基本消失，再将收集的水洗脱液减压浓缩，载入H103树脂，用水洗脱，水洗脱液弃去，再用20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩并冷冻干燥，得生地环烯醚萜苷提取物粉末。

山茱萸总环烯醚萜苷提取物的制备方法为：称取山茱萸药材，加水提取3次，合并水提液，浓缩后加入无水乙醇，过滤，得山茱萸水提醇沉提取液，载入大孔吸附树脂柱，依次用蒸馏水、30％乙醇水溶液洗脱，收集流出液，减压浓缩，冷冻干燥，再以甲醇溶解，加入硅胶拌样，减压回收甲醇至干，得红棕色粉末；上硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇溶剂系统进行等度洗脱，收集流出液，冷冻干燥，得到山茱萸总环烯醚萜苷提取物粉末。

山茱萸总三萜酸提取物的制备方法为：称取山茱萸药材，加水提取3次，将水提后药渣沥干，用乙酸乙酯索氏抽提，旋转蒸发回收溶剂至干，用40％乙醇洗涤，60℃加热水浴，抽滤，滤渣50℃烘干，得到山茱萸三萜酸提取物粉末。

一种药物有效部位配伍组合物在制备防治糖尿病及其血管病变药物中的应用。

有益效果：

(1)本发明生地为玄参科植物地黄(Rehmanniaglutinosa)的干燥块根，性甘、寒，归心、肝、肾经，具有清热凉血，养阴生津等功效；山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)的干燥成熟果肉，性酸、涩、微温，归肝、肾经，具有补益肝肾，收涩固脱的作用。生地-山茱萸药对是中医临床“滋阴清热”治法的主要方药体现形式。生地具有清热凉血、养阴生津功效，为治疗糖尿病的“四大圣药”之一，是临床上治疗糖尿病的常用中药。山茱萸具有补益肝肾、涩精固脱之功效，能够保护血管内皮，对糖尿病血管病变具有良好的疗效。现代研究表明生地、山茱萸的化学成分主要有环烯醚萜苷、糖类及有机酸等成分，其中环烯醚萜苷类成分具有重要的药理活性，其在防治糖尿病及其并发症中发挥着重要的作用。

(2)本发明提供的药物有效部位组合物经STZ致C57BL/6小鼠糖尿病模型的研究结果表明，该组合物能够明显改善糖尿病小鼠“三多一少”症状，降低血糖，增加胰岛素的分泌，降低血清肌酐、尿素氮、AGEs水平，增加尿肌酐和减少尿蛋白的排出，改善胰腺、肾脏、睾丸、心脏病理变化。表明该组合物具有降血糖和抗糖尿病血管病变的作用。因此本发明提供的组合物能够作为防治糖尿病及其血管病变的药物。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于它是由下述重量配比的生地、山茱萸有效部位制备而成：

生地总环烯醚萜苷提取物2份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物3份、山茱萸总三萜酸提取物0.5份。

实施例2一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于它是由下述重量配比的生地、山茱萸有效部位制备而成：

生地总环烯醚萜苷提取物2.5份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物4份、山茱萸总三萜酸提取物1份。

实施例3一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于它是由下述重量配比的生地、山茱萸有效部位制备而成：

生地总环烯醚萜苷提取物3份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物5份、山茱萸总三萜酸提取物1.5份。

实施例4生地总环烯醚萜苷提取物、山茱萸总环烯醚萜苷提取物、山茱萸总三萜酸提取物的制备方法和含量测定：

1、称取生地药材500g，粉碎过筛，进行3次提取。第一次加入10倍量水，提取2h，过滤得提取液Ⅰ；第二次在药渣中加入6倍量水，提取1h，得提取液Ⅱ；第三次在药渣中加入4倍量水，提取1h，得提取液Ⅲ，合并各次提取液，浓缩至1g生药/mL，加醇至浓度为70％醇沉，静置24h，过滤。浓缩后载入D101树脂，用水洗脱，收集水洗脱液，直至梓醇峰基本消失。再将收集的水洗脱液减压浓缩，载入H103树脂，用水洗脱，水洗脱液弃去，再用20％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩并冷冻干燥，得生地总环烯醚萜苷提取物粉末20.38g。

生地总环烯醚萜苷提取物粉末中梓醇含量检测：采用HPLC法测定，色谱条件为：LichrospHer C₁₈柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水(1：99)；流速0.8mL·min^-1；进样量：10μL；柱温30℃；检测波长210nm。结果：梓醇基线分离良好，进样量在0.33～1.98μg范围内线性关系良好，回归方程y＝26752x-6660，相关系数r＝0.995，方法学考察良好，结果为32.03％。

2、称取山茱萸药材500g，加水提取3次，合并水提液，浓缩后加入无水乙醇，过滤，得山茱萸水提醇沉提取液。载入大孔吸附树脂柱，依次用蒸馏水、30％乙醇水溶液洗脱，收集流出液，减压浓缩，冷冻干燥，再以甲醇溶解，加入硅胶拌样，减压回收甲醇至干，得红棕色粉末；上硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇溶剂系统进行等度洗脱，收集流出液，冷冻干燥，得到山茱萸总环烯醚萜苷提取物粉末11.765g。

山茱萸总环烯醚萜苷提取物粉末中马钱苷、莫诺苷含量检测：采用HPLC法测定，色谱条件为：LichrospHer C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水梯度洗脱(0～12min，乙腈比例由10％增加到55％)；流速1mL·min-1；进样量：10μL；柱温30℃；检测波长240nm。结果：马钱苷基线分离良好，进样量在0.088～0.528μg与峰面积呈良好线性关系，回归方程为Y＝1E+06X+1946，相关系数为r＝0.999，方法学考察良好；莫诺苷基线分离良好，进样量在0.088～0.528μg与峰面积呈良好线性关系，回归方程为Y＝1E+06X+4379，相关系数为r＝0.998，方法学考察良好。含量测定结果为55.77％。

3、称取山茱萸药材500g，加水提取3次，将水提后药渣沥干，用乙酸乙酯索氏抽提，旋转蒸发回收溶剂至干，用40％乙醇洗涤，60℃加热水浴，抽滤，滤渣50℃烘干，得到山茱萸总三萜酸提取物粉末2.925g。

山茱萸总三萜酸提取物粉末中熊果酸、齐墩果酸含量检测：采用ELSD法测定，色谱条件为：welchrom-C₁₈柱(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：MeOH-1％NH4AC(85：15)；漂移管温度90℃，气流2.4L/min；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；进样量：20μl。结果：熊果酸基线分离良好，进样量在60.00～300.00μg范围内线性关系良好，回归方程为y＝1.0913x+4.3929，相关系数r＝0.9999，方法学考察良好；齐墩果酸基线分离良好，进样量在15.00～75.00μg范围内线性关系良好，回归方程为y＝0.9885x+4.4635，相关系数为r＝0.9999，方法学考察良好。含量测定结果为52.89％。

实施例5生地山茱萸有效部位配伍组合物对糖尿病小鼠的作用

实验药品及试剂：生地山茱萸有效部位配伍组合物，按照上述实施例方法分别提取生地总环烯醚萜苷提取物、山茱萸总环烯醚萜苷提取物、山茱萸总三萜酸提取物，并按照生地总环烯醚萜苷提取物2.5份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物4份、山茱萸总三萜酸提取物1份进行配比。链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；二甲双胍，中美上海施贵宝制药有限公司。血清胰岛素Elisa试剂盒，Bioscience公司；血清AGEsElisa试剂盒，Bioscience公司；血清肌酐Elisa试剂盒，Bioscience公司；血清尿素氮Elisa试剂盒，Bioscience公司；血糖试纸，罗氏制药有限公司。

实验动物：C57BL/6J雄性小鼠，扬州大学比较医学中心，SCXKK苏2012-0004。

实验仪器：代谢笼，上海瑞曼信息科技有限公司；分析天平，上海HANGPING公司；层流架，苏州市苏杭科技器材有限公司；纯水仪，德国MILLIPORE公司。酶标仪，美国BioTeLK公司。

实验过程：选取6周龄大的C57BL/6J雄性小鼠,体重在18-22g，先适应性喂养1周，然后开始造模，造模前禁食12h，于第1天、第4天以STZ100mg/kg的剂量腹腔注射，在第8天测量小鼠空腹血糖，若空腹血糖值大于15mmol/L，即作为糖尿病造模成功。此后将糖尿病小鼠随机分组，并进行灌胃给药，每天1次，连续8周。

1、对血糖和血清胰岛素、AGEs、肌酐、尿素氮的影响

于给药前、给药4周和8周，分别测量小鼠空腹血糖值。于8周末摘眼球取血，离心取血清测定胰岛素、AGEs、肌酐、尿素氮水平。

表1对糖尿病小鼠血糖的影响

^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,vs.生地环烯醚萜苷组；^□p<0.05,vs.山茱萸三萜酸组

实验结果(表1)显示：模型组小鼠血糖值明显升高，与空白对照组比较具有极显著性差异(P<0.01)；给药4周和8周后，二甲双胍组及配伍组合物低、中、高剂量组小鼠血糖值均能明显下降(P＜0.01)。在同等剂量情况下，配伍组合物中剂量组优于生地环烯醚萜苷组和山茱萸三萜酸组，略优于山茱萸环烯醚萜苷组，降血糖作用更显著(P＜0.05)。

表2对糖尿病小鼠血清胰岛素的影响

^#p<0.05,^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,vs.生地环烯醚萜苷组

实验结果(表2)表明，模型组小鼠血清胰岛素明显减少，与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05,0.01)；二甲双胍组及配伍组合物低、中、高剂量组小鼠血清胰岛素均有明显的增加(P＜0.05,0.01)。在同剂量情况下，配伍组合物中剂量组优于生地环烯醚萜苷组，增加血清胰岛素水平更明显(P＜0.05)。

表3对糖尿病小鼠血清AGEs的影响

^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,vs.模型组；^△p<0.05,vs.生地环烯醚萜苷组；^□p<0.05,vs.山茱萸三萜酸组

实验结果(表3)表明，模型组小鼠血清AGEs明显升高，与空白对照组比较具有极显著性差异(P<0.01)；二甲双胍组、配伍组合物中、高剂量组小鼠血清AGEs均有显著降低作用(P＜0.05)。在同剂量情况下，配伍组合物中剂量组优于生地环烯醚萜苷组和山茱萸三萜酸组，降低血清AGEs作用更明显(P＜0.05)。

表4对糖尿病小鼠血清肌酐和血清尿素氮的影响

^#p<0.05,vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,vs.生地环烯醚萜苷组；^▲p<0.05,vs.山茱萸环烯醚萜苷组

实验结果(表4)表明，模型组小鼠血清肌酐、尿素氮明显升高，与空白对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)；二甲双胍及配伍组合物低、中、高剂量组均能减少血清肌酐及尿素氮水平，与模型组比较差异显著(P＜0.05，0.01)。且在同剂量情况下，配伍组合物中剂量组优于生地环烯醚萜苷组和山茱萸环烯醚萜苷组，降低血清肌酐、尿素氮作用更明显(P＜0.05)。

2、对尿肌酐、尿蛋白的影响

分别于第4、8周末收集各组小鼠24h尿液，3000rpm条件下离心10min，取上层清液，ELISA法测定尿肌酐和尿蛋白。结果见表5、6。

表5对糖尿病小鼠尿肌酐的影响

^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,vs.生地环烯醚萜苷组；^▲p<0.05,vs.山茱萸环烯醚萜苷组

表6对糖尿病小鼠24h尿蛋白排泄量的影响

^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△△p<0.01,vs.生地环烯醚萜苷组；^▲p<0.05,vs.山茱萸环烯醚萜苷组；^□p<0.05,vs.山茱萸三萜酸组

实验结果(表5、表6)表明，模型组小鼠尿肌酐明显减少，而尿蛋白明显增加，与空白对照组相比较具有极显著性差异(P<0.01)。给药后，配伍组合物低、中和高剂量组均能增加尿肌酐和减少尿蛋白的排泄(P＜0.05,0.01)，且配伍高剂量组作用更为明显(P＜0.01)。而二甲双胍仅减少尿蛋白含量，对尿肌酐的排泄作用不明显。在同剂量情况下，配伍组合物中剂量组均优于生地环烯醚萜苷组、山茱萸环烯醚萜苷组、山茱萸三萜酸组，增加尿肌酐、减少尿蛋白排泄作用更明显(P＜0.05，0.01)。

3、对胰腺、肾脏、睾丸、心脏病理变化的影响

实验结束后处死小鼠，取肾脏和睾丸，称重后计算脏器系数；取胰腺、肾脏、睾丸、心脏后，用10％福尔马林固定，脱水，石腊包埋。切片经HE染色后行光学显微镜观察主要病变。结果见表7、8、9。

表7各组小鼠肾脏和睾丸系数的变化

^#p<0.05,^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,^△△p<0.01,vs.生地环烯醚萜苷组；^▲p<0.05,^▲▲p<0.01,vs.山茱萸环烯醚萜苷组；^□p<0.05,^□□p<0.01,vs.山茱萸三萜酸组

表8各组小鼠胰腺病变

^#p<0.05,^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,^△△p<0.01,vs.生地环烯醚萜苷组；^▲p<0.05,^▲▲p<0.01,vs.山茱萸环烯醚萜苷组；^□p<0.05,^□□p<0.01,vs.山茱萸三萜酸组

表9各组小鼠肾脏、睾丸、心脏病变

^##p<0.01vs.空白对照组；^*p<0.05,^**p<0.01,vs.模型组；^△p<0.05,vs.生地环烯醚萜苷组；^▲p<0.05,vs.山茱萸环烯醚萜苷组；^□p<0.05,^□□p<0.01,vs.山茱萸三萜酸组

实验结果(表7、表8、表9)显示：

(1)模型组小鼠肾脏系数及睾丸系数增加，与模型组比较差异显著(p<0.05，0.01)。而配伍组合物低、中和高剂量组小鼠肾脏系数及睾丸系数明显减小(p<0.05，0.01)；

(2)模型组胰岛形状不规整，胰岛细胞分布不均匀、数量减少、有变性，胰岛面积减少；而配伍组合物中剂量和高剂量组小鼠胰腺病变程度明显减轻(p<0.05，0.01)。

(3)模型组小鼠肾脏病变主要是肾小球系膜基质增多。睾丸曲细精管内生精细胞排列欠整齐，部分曲细精管内生精细胞数量减少,变性的生精细胞融合成多核巨细胞。心脏心肌细胞内有轻度-重度空泡(空泡变性)，严重区域空泡聚集、呈团块状，无坏死，呈现糖尿病多脏器的血管病变。而配伍组合物低、中、高剂量组小鼠肾脏、睾丸、心脏病变程度明显减轻，与模型组比较具有显著性差异(p<0.05,0.01)。

(4)二甲双胍在改善糖尿病肾脏病变、睾丸病变和心脏病变中作用不明显。

(5)在同等剂量下，配伍组合物中剂量组与生地环烯醚萜苷组、山茱萸环烯醚萜苷组、山茱萸三萜酸组比较作用更优(p<0.05)。表明配伍组合后对糖尿病小鼠的血管病变具有更好的保护作用。

以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (5)

1.一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于它是由下述重量配比的生地、山茱萸有效部位制备而成：

生地总环烯醚萜苷提取物2-3份、山茱萸总环烯醚萜苷提取物3-5份、山茱萸总三萜酸提取物0.5-1.5份。

2.如权利要求1所述的一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于所述的生地总环烯醚萜苷提取物的制备方法为：称取生地药材，粉碎过筛，进行3次提取，第一次加入10倍量水，提取2h，过滤得提取液Ⅰ；第二次在药渣中加入6倍量水，提取1h，得提取液Ⅱ；第三次在药渣中加入4倍量水，提取1h，得提取液Ⅲ，合并各次提取液，浓缩至1g生药/mL，加醇至浓度为70%醇沉，静置24h，过滤，浓缩后载入D101树脂，用水洗脱，收集水洗脱液，直至梓醇峰基本消失，再将收集的水洗脱液减压浓缩，载入H103树脂，用水洗脱，水洗脱液弃去，再用20%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩并冷冻干燥，得生地总环烯醚萜苷提取物粉末。

3.如权利要求1所述的一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于所述的山茱萸总环烯醚萜苷提取物的制备方法为：称取山茱萸药材，加水提取3次，合并水提液，浓缩后加入无水乙醇，过滤，得山茱萸水提醇沉提取液，载入大孔吸附树脂柱，依次用蒸馏水、30%乙醇水溶液洗脱，收集流出液，减压浓缩，冷冻干燥，再以甲醇溶解，加入硅胶拌样，减压回收甲醇至干，得红棕色粉末；上硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇溶剂系统进行等度洗脱，收集流出液，冷冻干燥，得到山茱萸总环烯醚萜苷提取物粉末。

4.如权利要求1所述的一种防治糖尿病及其血管病变的药物有效部位配伍组合物，其特征在于所述的山茱萸总三萜酸提取物的制备方法为：称取山茱萸药材，加水提取3次，将水提后药渣沥干，用乙酸乙酯索氏抽提，旋转蒸发回收溶剂至干，用40%乙醇洗涤，60℃加热水浴，抽滤，滤渣50℃烘干，得到山茱萸总三萜酸提取物粉末。

5.如权利要求1所述的一种药物有效部位配伍组合物在制备防治糖尿病及其血管病变药物中的应用。