CN104171413A

CN104171413A - 一种含厌氧菌K.paraultunenseKD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料

Info

Publication number: CN104171413A
Application number: CN201410376505.8A
Authority: CN
Inventors: 陈璐; 尹小波; 邓宇; 张云飞; 李强
Original assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Current assignee: Biogas Institute of Ministry of Agriculture
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2034-08-01
Also published as: CN104171413B

Abstract

本发明提供了一种含厌氧菌K.paraultunenseKD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，该饲料分为基础饲料和厌氧菌厌氧菌K.paraultunenseKD-1发酵液两部分。基础饲料配方包括羽毛粉、玉米、豆粕、小麦麸、食盐、磷酸氢钙、石粉、氯化胆碱、维生素预混料、矿物质和蛋氨酸。厌氧菌K.paraultunenseKD-1发酵液中不仅含有丰富的营养物质，其中的角蛋白酶还能高效降解羽毛粉角蛋白以及促进饲料中其他蛋白质的水解，因此，在提高饲料营养水平的同时还提高了饲料的转化利用率。本发明提供的一种含厌氧菌K.paraultunenseKD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，具有制备方法简单、生产成本低、生物转化率高、食用安全的优点，为羽毛角蛋白废弃物资源化利用提供一种有效的途径。

Description

一种含厌氧菌 K. paraultunense KD-1 发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料。

背景技术

近年来，我国养殖业迅速朝着标准化、规模化、集约化的方向发展，但随之产生的废弃物污染问题日益凸显。我国畜禽养殖废弃物处理面临的现状是：一方面，养殖业废弃物治理方法体系中普遍存在处理效率低、治理不彻底、易形成二次污染等问题；另一方面，畜禽养殖废弃物中包含大量有机物以及无机矿物元素，但没有得到有效利用，这不仅造成了资源浪费，而且严重污染了环境。解决畜禽废弃物污染问题迫在眉睫，如何实现畜禽养殖废弃物的无害化处理、资源化利用成为当今社会亟待解决的重要课题。

畜禽养殖生产中会产生大量角蛋白废弃物，如羽毛、皮毛、角、蹄、爪等。然而，角蛋白不易被一般的蛋白酶降解。例如，我国平均每年产羽毛达90多万吨，除少部分用于保暖填充材料，绝大部分未得到合理利用。羽毛粉中蛋白质含量超过80％，其中赖氨酸、缬氨酸和苏氨酸等氨基酸含量的总和均高于大豆粕，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的，可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源。传统的物理化学方法处理角蛋白废弃物不仅转化率低，破坏角蛋白的营养成分，还易造成环境污染。20世纪40年代，科学家们相继发现许多微生物能分泌一类具有角蛋白水解活性的酶，称为角蛋白酶。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽，氨基酸及矿物元素，可以用于制造有机肥料以及饲料添加剂，这不仅解决了目前国内农业和畜牧业资源紧缺的难题，还降解了污染源，有利于改善环境。目前发现的多数角蛋白酶具有广泛的底物，除了能够降解角蛋白外，还可以降解多种可溶性蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白、牛血清白蛋白，酪蛋白等。

长期以来，在饲料生产行业中，存在饲料转化率低、饲料原料短缺、抗生素、激素等过量添加导致的禽类产品的品质降低等问题。因此，新型的生物饲料是养禽业发展的必然要求。前期研究表明，在饲料中添加各种生物添加剂，都取得了明显的效果。Vandeplas等人研究表明在肉鸡饲料中添加0.01%（wt/wt）的木聚糖酶（xylanase）配合10⁶cfu/g的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）饲喂鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）感染3d后的30-42d龄肉鸡，结果显示饲料转化率提高19.7%，且肉鸡粪便中鼠伤寒沙门氏菌数量显著降低（Vandeplas S, et al. Poultry science,2009,88(8):1643-1654）。顾维智等人，通过在肉鸭饲料中添加70g/t的溶菌酶，研究发现溶菌酶能有效促进肉鸭生长，溶菌酶组与对照组相比较，平均日增重比提高6.0%，胸腺和脾脏免疫器官指数分别提高53.8%和29.4%（顾维智，等.饲料工业,2008,29(24): 46-48）。Odetallah等在肉仔鸡饲料中分别添加0.05％(wt/wt)，0.1％(wt/wt)和0.15％(wt/wt)的PWD-1角蛋白酶，试验结果表明，在21d龄和26d龄时肉鸡的增重率和饲料转化率都有大幅度提高（Odetallah NH, et al. Poultry science,2003,82(4):664-70）。Wang等人在饲料中按0.1%(wt/wt)添加Versazyme酶制剂饲喂肉鸡，结果显示角蛋白酶制剂能有效提高肉鸡增重率（1-21d龄肉鸡）与饲料转化率（1-42d龄肉鸡）（Wang H, et al. Animal Feed Science and Technology,2008,140(3-4):376-384）。

目前，已公开的发明专利多数涉及好氧菌降解羽毛角蛋白，降解过程需要较大的通气设备，发酵成本高，通气时易造成杂菌污染。专利号为4,908,220的美国专利（C.M.Williams.1990.U.S.Patent 4,908,220）公开一种利用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）来源的角蛋白酶水解角蛋白的方法，它通过液体深层发酵制备角蛋白酶，发酵周期为4天。其发酵工艺复杂，且角蛋白酶活力不够理想。另外，国内曹军等人公开的发明专利“一种角蛋白酶的固态发酵制备方法及其应用”，采用固体发酵技术，利用真菌栖土曲霉（Aspergillus terricola）发酵制备角蛋白酶作为饲料添加剂，其发酵周期为3-5天，发酵培养物以2%-10%的比例直接添加入饲料或硫酸铵沉淀后的粗酶液以0.5-5‰添加入饲料。其发酵周期长，且并没有生物安全性相关的验证。

综上所述，角蛋白酶可用于羽毛废弃物的生物消化，使之转化为饲料。一方面角蛋白酶可降解羽毛粉饲料，并水解其它一些常见的蛋白质，因此可作为饲料添加剂提高饲料的利用率；另一方面，角蛋白酶还可起到杀灭饲料中致病微生物的作用。这不仅使羽毛角蛋白废弃物得到有效利用，还有效地缓解了蛋白资源供应紧张的局面。然而，现有的含角蛋白酶制剂的饲料具有角蛋白酶获得成本高的缺点，不适用于大规模的实际应用。研发出成本低廉、生物转化效率高、食用安全的饲料，是实现角蛋白废弃物的无害化处理、资源化利用的有效途径。

发明内容

本发明针对羽毛角蛋白废弃物利用率低的现状，提供一种制备方法简单、生产成本低、生物转化效率高、食用安全且在一定程度上能促进益生菌繁殖并抑制有害细菌的含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料。

本发明的技术目的是通过以下方案实现的：

一种含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，其特征在于：原料包括基础饲料和K. paraultunense KD-1发酵液两部分，K. paraultunense KD-1发酵液与基础饲料的配比为：每千克基础饲料添加200-300ml的发酵液；所述基础饲料包括：玉米、豆粕、小麦麸、食盐、磷酸氢钙、石粉、氯化胆碱、维生素预混料、矿物质、蛋氨酸和占基础饲料总重量5％的羽毛粉。

本发明所述厌氧菌K. paraultunense KD-1，其分类命名为Keratinibaculum paraultunense gen. nov., sp.nov.，保藏于日本JCM和德国DMSZ微生物菌种保藏中心，菌种的保藏编号分别为JCM 18769T和DSM 26752T。

本专利采用厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液，其角蛋白酶降解效率高，发酵液营养成分丰富。所述厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液中的活菌数为（1.53×10⁸-6.7×10⁸ cfu/ml），发酵液上清的酶活力为（350-400 U/ml）。经检测，该厌氧细菌的羽毛发酵液中富含矿物质、微量元素以及各种氨基酸，包括：赖氨酸46-60µg/ml，苯丙氨酸172-320µg/ml，苏氨酸91-280µg/ml，异亮氨酸93-346µg/ml，亮氨酸199-511µg/ml，甲硫氨酸14-18µg/ml，天冬氨酸303-389µg/ml，半胱氨酸225-353µg/ml，脯氨酸345-729µg/ml，谷氨酸478-700µg/ml，丝氨酸199-746µg/ml，甘氨酸89-452µg/ml，酪氨酸118-145µg/ml，缬氨酸275-550µg/ml，丙氨酸232-293µg/ml以及半必需氨基酸精氨酸193-421µg/ml和组氨酸15-18µg/ml。其中赖氨酸、甲硫氨酸等氨基酸在化学物理方法处理角蛋白废弃物中极易被降解。

优选的，K. paraultunense KD-1发酵液与羽毛粉饲料的配比为200-300ml/kg，按此比例区间添加发酵液，饲料中的羽毛粉中一半以上的羽毛转化为可溶性蛋白，同时饲料具有较好适口性。若添加量低于此比例，羽毛中角蛋白降解率低，不能有效利用，且饲料转化率低；若高于此添加比例，饲料过稀，不易取食且适口性降低。若进一步浓缩发酵活性物，可增加对基础饲料中羽毛的转化率，但是发酵液本身的营养成分会在浓缩过程中丢失，且浓缩过程增加运行成本。

优选的，所述基础饲料各组分的重量百分含量为：所述基础饲料各组分按百分含量计为：羽毛粉5％、玉米65.68％、豆粕18％、小麦麸8％、食盐0.35％、磷酸氢钙1.3％、石粉1.2％、氯化胆碱0.15％、维生素预混料0.02％、矿物质0.2％和蛋氨酸0.1％。羽毛粉的添加比例占基础饲料总重量5％时，羽毛的生物转化率高。若添加比例过高，羽毛不易被K. paraultunense KD-1发酵液转化为可溶性蛋白，添加比例过低则饲料营养不均衡，需格外添加其他蛋白类组分，增加成本。

所述矿物质预混料包括：Fe 80mg/kg、Mn 60mg/kg、Zn 60mg/kg、Cu 10mg/kg、I 0.2mg/kg和Se 0.2mg/kg；维生素预混料包括VA 6000IU/kg、VB₁3mg/kg、VB₂ 5mg/kg、VB₃50mg/kg、VB₆ 2.5 mg/kg、VB₁₂ 0.01mg/kg、VD 500IU/kg、VE 15mg/kg、VK 3mg/kg、D-泛酸 9mg/kg和叶酸 1mg/kg。

本发明与现有技术相比较，具有如下显著优点：

1、制备方法简单、生产成本低、饲料转化率高；

2、能有效提高肉鸭增重率，降低料重比，同时增加肉鸭免疫力及改善肉质；

3、能促进羽毛废弃物资源的安全高效利用，对解决自然界羽毛废弃物造成的资源浪费和环境污染的问题具有重要参考意义；

4、食用安全，含K. paraultunense KD-1发酵液作为生物饲料添加剂使用，对家禽肠道微生物群落结构没有明显影响且促进肠道益生菌增殖，一定程度抑制有害菌。

附图说明

图1显示不同时间（A-D: 0h,6h,12h,18h）K.paraultunense KD-1发酵液降解羽毛情况的扫描电镜图；

图2显示发酵13h后发酵液中氨基酸种类与含量；

图3显示不同处理组对肉鸭肠道微生物结构的影响。(A)不同细菌（分类层次：门）在肠道微生物中所占比例(丰度%) ；(B)乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）以及埃希氏菌属/沙门氏菌属（Escherichia/Shigella）在肠道微生物中所占比例（平均丰度%）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

饲料的适口性是配方饲料及饲料添加剂的一个重要衡量指标。饲料适口性是指饲料的滋味、香味和质地特性的总和，是动物在觅食、定位和采食过程中视觉、嗅觉、触觉和味觉等感觉器官对饲料的综合反应。饲料适口性以动物的采食量来体现。本实施例中，选取4周龄幼鸭60只（四川麻鸭兼容性地方品种），随机分成6组，每组10只，进行为期两周的饲料适口性检测实验。对照组饲喂基础饲料，其他实验组组饲喂基础饲料添加不同比例的发酵液（100ml、200ml、300ml、400ml、500ml）。记录每天各处理组采食量、采食时间，观察采食规律。实验鸭采用笼养方式，自由采食、饮水。

如表1所示，在发酵液添加量为200-300ml/kg时，鸭子的采食量和采食速度都在正常范围内，且料重比优势明显。尤其是添加量为300ml/kg时，其日增重相对于对照组提高了12.7%，采食量降低14.6%，料重比降低24.2%。但是，当发酵液添加量增至500ml/kg时，鸭子采食量和采食速度明显降低。结果表明，在饲料中添加发酵液，添加量在200ml-300ml/kg时，其适口性好，作用效果明显，肉鸭日增重提高6.3%-12.7%。

实施例2

将厌氧发酵液按300ml每千克基础饲料添加入基础饲料，进行为期8周的饲喂实验。选3周龄幼鸭60只，分成三组（对照组、高蛋白组、发酵液组），每组4个处理，每个处理5个重复（雌雄随机）。对照组饲喂基础饲料，高蛋白组饲喂基础饲料+4%豆粕（wt/wt），发酵液组饲喂基础饲料+300ml发酵培养物/1000g饲料（对照组与高蛋白组按相同比例水补齐）。基础饲料为颗粒状，委托成都粟海饲料有限公司加工（饲料中包含5%的羽毛粉）。记录每天各处理组采食量，定期称重，计算肉鸭日增重、日采食量和料重比。

如表2所示，在日增重方面，发酵液组与高蛋白组分别比对照提高了7.23%和4.15%，且发酵液组与高蛋白组在料重比指标上分别比对照降低了18.43%和19.16%。实验结果说明，在饲料中添加活性产角蛋白酶厌氧菌发酵液，能有效提高肉鸭日增重，降低料重比，提高羽毛粉饲料的转化利用效率。从生产效益上看，一方面，发酵液中的营养成分为对于肉鸭生长有促进作用；另一方面，发酵液中角蛋白酶能降解饲料中羽毛角蛋白，使羽毛饲料得到充分利用，降低料重比，节约成本。

表 2不同处理对肉鸭生长性能的影响

实施例3

上述实施例2饲喂实验结束后，禁食12h（自由饮水），使用不含热原和内毒素的试管采集血液后，以3000rpm/10min取血清，分装后于-80℃冻存。采用鸭免疫球蛋白（IgG/IgA/IgM）ELISA检测试剂盒，分别检测不同处理组血清中免疫球蛋白含量。

血清免疫球蛋白作为血清蛋白的一部分，能与外来的特异性抗原结合起免疫反应而保护机体，其含量反应机体的免疫能力。如表3所示，发酵液组血清中IgG、IgM含量比高蛋白组和对照组均有显著提高。发酵液组中的IgG含量比对照组和高蛋白组分别高了10.0%和7.3%；发酵液组中的IgM含量比对照组提高了8.7%；三个实验组肉鸭血清中IgA含量没有明显差别（P<0.05）。本实施例表明饲料中添加活性厌氧菌发酵液，可更好地维持机体免疫功能，提高机体免疫力。

表3 不同处理对肉鸭血清中免疫球蛋白含量的影响(ug/ml)

注：同类指标中同列数字右肩有相同字母者表示差异不显著（P＞0.05），不同字母表示差异显著（P＜0.05）

实施例4

为了进一步了解发酵液对于肉质品质的影响，本实施例对上述实施例2中三个处理组的肉鸭进行随机取样，分别对肉鸭的营养成分以及肉质指标进行检测。

干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、钙、磷等常规营养成分测定方法参照张丽英主编的《饲料分析及饲料质量检测技术》（第三版）的方法进行；肌苷酸的含量使用HPLC法检测；肉质指标的测定主要参照杨公社等主编的《猪生产学》中关于动物肉质指标的测定方法及相关文献资料。数据分析与计算采用SPSS18.0 进行二因素方差分析，并采用Duncan′s法进行多重比较。

肌肉营养成分是肉质评价的客观标准，能反映肉品的内在质量。如表4和表5所示，本实施例中各处理组胸肌和腿肌中的干物质、粗灰分的含量接近，且无明显差异。不同肌肉部位粗蛋白的含量，发酵液组和高蛋白组要高于对照组，且腿肌中发酵液组和高蛋白组分别比对照组高19.92%和18.65%，差异极显著（P<0.01）。因此，发酵液组中肉鸭腿肌可食用蛋白最多，营养价值优于高蛋白组和对照组。肌肉内脂肪的含量与肌肉肉质关系极为密切，肌肉脂肪含量与肌肉的多汁性和风味有关。在一定范围内，肌内脂肪越多，肉质越好。胸肌发酵液组的粗脂肪含量大于高蛋白组，为其肉风味提供了保证。胸肌和腿肌不同处理组间肌苷酸含量趋势一致,发酵液组>高蛋白组>对照组｡由此可知,发酵液组肉鸭风味和鲜味要优于高蛋白组和对照组｡以上结果表明，发酵液中含有的营养成分在一定程度上能够改善肉鸭肌肉的风味和口感。

表 4 胸肌常规营养成分和肌苷酸测定结果

表 5 腿肌常规营养成分和肌苷酸测定结果

注：同列数字右肩有相同字母者表示差异不显著（P＞0.05），不同字母表示差异显著（P＜0.05），大写字母表示差异极显著（P<0.01）

本实施例还检测了三个处理组肉鸭的肉质指标。如表6所示，本试验不同处理组间剪切力、熟肉率、滴水损失等指标均在正常值范围内。剪切力越小表示嫩度越高，发酵液组嫩度较高, 且胸肌嫩度高于腿肌,这可能与不同部位的营养成分有关。熟肉率是评定肌肉烹煮损失的重要指标，它度量了肌肉系水力的强弱和肌肉中挥发性风味物质的损失高低。胸肌和腿肌高蛋白组与发酵液组均优于对照组，其中在胸肌熟肉率方面，蛋白组和发酵液组分别比对照组高出4.18%和3.04%，差异极显著(P<0.01)｡因此，从剪切力和熟肉率方面的指标来看，在肌肉品质方面发酵液组具有明显优势。

表6 不同处理对肉鸭肉质指标的影响

实施例5

本实施例对上述实施例2中三个处理组的肉鸭肠道菌群取样，以便进一步了解饲喂发酵液是否影响肉鸭肠道微生物群落结构。取实验鸭空肠粪便样本，用磷酸缓冲液（pH7.0）悬浮粪便样本后用粪便基因组提取试剂盒，提取总DNA。肠道菌群16 S rDNA测序由金唯智生物科技有限公司完成。测序结果表明，饲喂K. paraultunense KD-1厌氧发酵液，对实验鸭肠道微生物群落结构没有明显影响，说明K. paraultunense KD-1厌氧菌不会破坏肠道菌群的平衡（图3A）。另外，饲喂发酵液能有效促进肠道益生菌（乳酸杆菌以及双歧杆菌）的增殖，同时对肠道有害菌（大肠杆菌/沙门氏菌）有抑制作用（图3B）。

Claims

1.一种含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，其特征在于：原料包括基础饲料和K. paraultunense KD-1发酵液两部分，K. paraultunense KD-1发酵液与基础饲料的配比为：每千克基础饲料添加200-300ml的发酵液；所述基础饲料包括：玉米、豆粕、小麦麸、食盐、磷酸氢钙、石粉、氯化胆碱、维生素预混料、矿物质、蛋氨酸和占基础饲料总重量5％的羽毛粉。

2.根据权利要求1所述的含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，其特征在于：所述基础饲料各组分按百分含量计为：羽毛粉5％、玉米65.68％、豆粕18％、小麦麸8％、食盐0.35％、磷酸氢钙1.3％、石粉1.2％、氯化胆碱0.15％、维生素预混料0.02％、矿物质0.2％和蛋氨酸0.1％。

3.根据权利要求1所述的发酵液饲料添加剂，其特征在于：所述厌氧菌K. paraultunense KD-1属于梭菌科（Clostridiaceae）的一个新属，其分类命名为Keratinibaculum paraultunense gen. nov., sp.nov.，该菌种分别保藏于日本JCM（保藏编号：JCM 18769T）和德国DMSZ（保藏编号：DSM 26752T）微生物菌种保藏中心。

4.根据权利要求1或2所述的一种含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，其特征在于：所述厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液中的活菌数为（1.53×10⁸-6.7×10⁸ cfu/ml），发酵液上清的酶活力为（350-400 U/ml）；发酵液中氨基酸组成包括：赖氨酸46-60µg/ml，苯丙氨酸172-320µg/ml，苏氨酸91-280µg/ml，异亮氨酸93-346µg/ml，亮氨酸199-511µg/ml，甲硫氨酸14-18µg/ml，天冬氨酸303-389µg/ml，半胱氨酸225-353µg/ml，脯氨酸345-729µg/ml，谷氨酸478-700µg/ml，丝氨酸199-746µg/ml，甘氨酸89-452µg/ml，酪氨酸118-145µg/ml，缬氨酸275-550µg/ml，丙氨酸232-293µg/ml以及半必需氨基酸精氨酸193-421µg/ml和组氨酸15-18µg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，其特征在于：所述矿物质预混料包括：Fe 80mg/kg、Mn 60mg/kg、Zn 60mg/kg、Cu 10mg/kg、I 0.2mg/kg和Se 0.2mg/kg；维生素预混料包括VA 6000IU/kg、VB₁3mg/kg、VB₂ 5mg/kg、VB₃50mg/kg、VB₆ 2.5 mg/kg、VB₁₂ 0.01mg/kg、VD 500IU/kg、VE 15mg/kg、VK 3mg/kg、D-泛酸 9mg/kg和叶酸 1mg/kg。

6.根据权利要求1所述的一种含厌氧菌K. paraultunense KD-1发酵液和羽毛粉的肉型家禽饲料，其特征在于：所述肉型家禽包括鸡、鸭或者鹅，但不仅限于鸡、鸭或鹅。