CN104169425A - 前列腺癌细胞系、遗传标志及其用途 - Google Patents

前列腺癌细胞系、遗传标志及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及包含原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或一组的哺乳动物前列腺癌细胞系，所述细胞已感染携带癌基因的逆转录病毒载体，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述基因。前列腺细胞系包括前列腺癌的免疫感受态动物模型的应用、用于永生化原代哺乳动物上皮细胞的体外生产的方法、测定具有前列腺癌的人受试者是否患有转移或处于发展转移的危险中的方法、在处于发展癌症或癌症转移的危险中的受试者中预防癌症或抑制对治疗敏感的癌症转移的方法、和鉴定选择性干扰癌细胞的增殖或活力的候选化合物的方法，所述癌细胞具有升高水平的CCR5。

Description

前列腺癌细胞系、遗传标志及其用途
技术领域
提供了用于诊断和治疗癌症包括前列腺癌的方法和组合物。本发明的具体方面涉及对于前列腺癌诊断、研究、治疗分层和治疗有用的方法和组合物。本发明中还提供的是可在这些方法中使用的细胞和转基因非人动物。
关于联邦赞助研究开发的声明
本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的授权号R01CA70896、R01CA75503、R01CA86072、P30CA56036和R01CA132115-02下由政府支持进行。政府在本发明中拥有一定权利。
背景技术
癌症是遍及全世界的重大健康问题。尽管在癌症检测和治疗中已取得进展，但目前无法获得用于预防和/或治疗的疫苗或其他普遍成功的方法。一般基于化学疗法或手术和放射的组合的目前疗法在许多患者中继续证明是不足够的。
例如，前列腺癌是对于在美国和遍及全世界的男性的重大健康问题。尽管在该疾病检测和治疗中已取得进展，但前列腺癌仍是男性中的癌症相关死亡的重要原因，每年影响美国超过221,000名男性。对于北美的男性，获得前列腺癌的寿命优势目前是19.6%，具有4.6%的死亡风险。前列腺癌是2009年全世界约250,000例死亡的原因。
目前无法获得用于预防或治疗前列腺癌的疫苗或其他普遍成功的方法。该疾病的管理目前依赖早期诊断（通过常规前列腺特异性抗原(“PSA”)测试）和侵入性治疗的组合，所述侵入性治疗可包括多种治疗例如手术、放射疗法、化学疗法和激素疗法中的一种或多种。关于特定前列腺癌的治疗过程通常基于多种前列腺参数包括组织学分析和疾病传播加以选择。然而，目前作为筛选标准的PSA的使用导致较不优化的治疗决策，因为PSA测试具有高假阳性和假阴性率。2009年在美国进行约45,000,000次PSA，具有约27%的特异性。基于升高的PSA，去年在美国采取约1百万次前列腺活组织检查，从其中鉴定250,000例肿瘤。在前列腺癌患者中观察到的高死亡率指出在该疾病的治疗、诊断和预防中需要改善。
关于PSA测试使用的另一复杂因素是医生关于PSA筛选的建议不同。一些人鼓励超过50岁的男性每年筛选，并且一些人建议处于前列腺癌的更高危险中的男性在40或45岁时开始筛选。另外其他人警告常规筛选。一般来讲，4.0ng/mL以下的PSA水平视为正常的。然而，考虑到两个报道，即Thompson IM等人的一个(“Prevalence of prostatecancer among men with a prostate-specific antigen level<or=4.0ng permilliliter,”New England Journal of Medicine2004,350(22),2239-2246)和Smith DS等人的另一个(“The early detection of prostate carcinomawith prostate specific antigen:The Washington University experience,”Cancer1997,80(9),1853-1856)，参考的PSA水平看起来是任意且无用的。根据Thompson IM等人，在具有等于或小于4.0ng/mL的PSA水平的15.2百分比的男性中诊断出前列腺癌。那些男性中的百分之十五或总共约2.3百分比男性具有高分级的癌症。根据Smith DS等人，发现具有4.1-9.9ng/mL的PSA水平和经历前列腺活组织检查的25–35百分比的男性具有前列腺癌，而65-75百分比的剩余男性不具有前列腺癌。因此，不存在特定的正常或异常PSA水平。
此外，促成前列腺癌复发和治疗抗性的分子机制知之甚少。雄激素剥夺疗法导致60%-80%初始应答率（参见Scher,H.I.和Sawyers,C.L.,J Clin Oncol2005,23,8253-8261）。然而，经历雄激素拮抗剂疗法的大多数患者随后复发。早期诊断可提供治愈手术的机会，然而，接受根治性前列腺切除术的～30%男性复发，促成微转移疾病。因此，存在可在该疾病的早期阶段时检测和/或阻止转移性恶性肿瘤的分子驱动物的医学干预的需要。
发明内容
在一个方面，本发明提供了哺乳动物前列腺癌细胞系，其包含一组原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或多种，所述细胞已感染携带癌基因的逆转录病毒载体。在某些实施例中，癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述癌基因或基因组合。哺乳动物前列腺癌细胞系可包括任何合适的哺乳动物细胞，包括原代鼠上皮细胞。原代哺乳动物上皮细胞可源自任何免疫感受态哺乳动物，包括免疫感受态啮齿类动物，包括大鼠和小鼠。
在另一方面，本发明提供了癌症动物模型，包括植入癌细胞系的免疫感受态哺乳动物，所述癌细胞系用选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一组癌基因中的一种或多种转化。
在一个实施例中，基于选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一组癌基因中的一种或多种的表达水平，使用本发明的哺乳动物前列腺癌细胞系产生的免疫活性转基因小鼠发展能够产生可检测的分子遗传标志的前列腺肿瘤。
在又一方面，本发明提供了用于体外生产永生化原代哺乳动物上皮细胞的方法，该方法包括用逆转录病毒载体感染原代哺乳动物上皮细胞，所述逆转录病毒载体携带选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的癌基因，以提供受感染细胞，其中所述原代哺乳动物上皮细胞能够被所述逆转录病毒载体和在这样的条件下感染，由此在所述受感染细胞中表达c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
在进一步方面，本发明提供了用于诊断前列腺癌的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者的生物学测试样品，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中；(b)基于测试样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性，测定至少一种生物标记或分子遗传标志的水平，其中一组或多组基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；(c)比较所述测试样品中的所述至少一种生物标记或所述分子遗传标志的水平与对照样品中的生物标记的水平或分子遗传标志的水平，其中相对于所述对照样品中的生物标记或分子遗传标志的水平，所述测试样品中的生物标记或分子遗传标志的水平升高是所述受试者中的前列腺癌存在的诊断指示物。
在又一方面，本发明提供了分类癌症肿瘤包括前列腺肿瘤的方法，该方法包括：(a)提供癌症肿瘤或前列腺肿瘤样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和(c)基于检测步骤(b)的结果，将前列腺肿瘤分类为属于肿瘤亚类。
在进一步方面，本发明提供了将具有癌症肿瘤包括前列腺肿瘤的受试者分层用于临床试验的方法，该方法包括：(a)提供源自具有癌症肿瘤或前列腺肿瘤的受试者的样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src、ErbB2及其组合；和(c)基于检测步骤的结果，将受试者分层用于临床试验。
在另一方面，本发明提供了选择用于具有前列腺肿瘤的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)提供源自具有前列腺肿瘤的受试者的样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和(c)基于检测步骤的结果选择治疗。
在又一方面，本发明提供了通过用一种或多种外源癌基因转化细胞产生的非天然存在的细胞，允许所述细胞分裂至少一次，其中所述细胞是被含有一种或多种外源癌基因的载体转化的哺乳动物细胞，其中所述一种或多种外源癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
已发现前列腺上皮细胞的癌基因转化诱导与趋化因子受体5型(“CCR5”)及其配体(CCL5、CCL8、CCL7)的表达增加相关的转移细胞。CCR5受体在功能上与骨转移有关，如通过使用每日口服CCR5拮抗剂马拉维若减少转移证明的。
附图说明
图1示出癌基因转导的PEC系在软琼脂中形成集落；
图2示出通过阵列CGH评估的在四个癌基因细胞系中的拷贝数异常；
图3示出前列腺上皮细胞系在免疫感受态小鼠中生长；
图4示出癌基因转化的前列腺上皮细胞肿瘤转移至肺；
图5示出微阵列基因表达的层次聚类；
图6示出前列腺肿瘤中的c-Myc和Ha-Ras特异性癌基因标志在其他组织中是保守的；
图7示出癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联；和
图8示出癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联。
图9示出分化不良的前列腺腺癌的组织学特征；
图10示出同基因前列腺癌细胞系的3D基质胶侵入的Src增强，其中：
图10A示出细胞迁移的划痕测定显示划痕，
图10B示出关于N=3次分开实验的关闭定量，
图10C示出在基质胶中使用前列腺癌细胞系的3-D侵入测定，和
图10D示出来自对于PEC系（PEC-NeuT、PEC-Ras和PEC-Src）的3次独立实验的平均侵入距离±SEM；
图11示出同基因前列腺癌细胞系肿瘤是血管的，其中：
图11A示出使用标准化的光子通量来定量肿瘤体积，对于3个系各自在1x105细胞的皮下接种后经过3周定量的，在NCR裸鼠中的皮下肿瘤生长，
图11B示出关于血管性血友病因子(von Willebrand factor，WF)的免疫组织化学染色，显示具有Ras系的增强VWF染色的该系血管分布；
图12示出前列腺癌系发展转移。如下呈现来自实验的结果，其中将用表达Luc2-番茄红融合蛋白的载体转导的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且每周定量体内生物发光信号：
图12A示出在前列腺上皮细胞的心内注射后两周时的代表性全身生物发光图像，
图12B示出在同基因前列腺癌系的心内注射后，在小鼠中的脑转移的代表性图像，
图12C示出显示为具有肿瘤的小鼠比例的生物发光成像(BLI)的定量（平均值±SEM，n=6），
图12D示出对于同基因系各自作为转移性脑肿瘤负荷的量度的平均总质子通量，
图12E示出在PEC-Src和PEC-NeuT心内注射与细胞角蛋白14(“CK14”)染色2周后形成的脑转移的苏木精伊红(“H&E”)染色，确证在脑内前列腺上皮细胞的存在；
图13示出前列腺肿瘤细胞系的肝转移。如下呈现来自实验的结果，其中将表达Luc2-番茄红融合蛋白的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且定量体内生物发光信号：
图13A示出具有肝肿瘤的小鼠百分比，
图13B示出通过光子通量测定的肿瘤大小，
图13C示出显示肝转移的代表性小鼠图像，
图13D示出具有肾肿瘤的小鼠百分比，
图13E示出通过光子通量的肾肿瘤大小，和
图13F示出肾转移的代表性图像；
图14示出同基因前列腺癌细胞系发展溶骨性骨转移：
图14A示出FVB小鼠的代表性体内图像，所述FVB小鼠经历表达Luc2-番茄红融合蛋白的PEC系的心内注射，并且定量体内生物发光信号，
图14B示出作为具有肿瘤的小鼠比例的生物发光成像(BLI)的定量（平均值±SEM，n=6），和
图14C示出在光子通量上的肿瘤团块大小；
图15示出溶骨性前列腺癌骨转移的Src增强。如下呈现来自实验的结果，其中在PEC-Src心内注射后2周，FVB小鼠发展溶骨性骨病灶：
图15A示出与PEC-Ras和PEC-NeuT相比较，骨中的肿瘤面积在PEC-Src组中显著增加，
图15B示出在细胞的心内注射前(t0)和后14天(t14)的代表性X射线，
图15C示出耐酒石酸盐酸性磷酸酶(“TRAP”)染色，确证骨-肿瘤界面中成骨细胞（箭头）的存在，
图15D示出骨转移形成后的H&E染色，
图15E示出CK14染色，和图15F示出CK8染色，并且两者均确证在骨内上皮细胞的存在；
图16示出溶骨性前列腺癌细胞系表达功能CCL5和骨桥蛋白(“OPN”)受体：
图16A—16D示出在PEC系上的CCR5表达的荧光激活细胞分选器(“FACS”)分析，
图16E和16F示出使用OPN作为CD44配体和CCL5作为CCR5配体进行的PEC-Src系的基质胶侵入测定，和
图16G示出定量为平均值+SEM的PEC-Src系的基质胶侵入，和
图16F示出在组织培养中的前列腺肿瘤细胞系的趋化因子受体和配体基因表达，和
图16G示出与组织培养中的表达相比较，在皮下植入后的细胞因子配体和受体的相对丰度；
图17示出CCR5拮抗剂阻断脊柱溶骨性前列腺癌转移。来自实验的结果显示于图16A-16D中，其中将用表达Luc2-番茄红融合蛋白的载体转导的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且在2周后定量体内生物发光信号：
图17A示出显示来自每组小鼠的代表性例子（用口服马拉维若(8mg/kg)或对照处理小鼠），
图17B示出作为总肿瘤团块的体积分析的光子通量，
图17C示出小鼠中的下肢骨质量（数据是关于每个组中的N=8只分离小鼠的平均值+SEM，P<0.05）；和
图17D显示小鼠中的下肢骨质量的代表性X射线图像。
图18A-18H示出与X射线分析关联的氟-18，氟化钠(“F-18-NaF”)成像证实脊柱转移的存在；
图19A和19B显示用马拉维若每日口服处理使脊柱转移减少>90%；和
图20示出来自tPEC细胞系微阵列的数据。
具体实施方式
本发明主题目前将在下文参考附图和其中显示了代表性实施例的实例更全面地描述。然而，本发明主题可以不同形式体现，并且不应解释为限制于本文阐述的实施例。相反，这些实施例提供用于描述且赋予本领域技术人员方法。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与主题所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本文提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考文献全文以引用的方式并入。
I.动物模型和细胞系：
用于疾病例如癌症且特别是前列腺癌的新治疗需要在动物中的新测试方案。这些测试方案已受限于可植入免疫感受态（或“免疫活性”）动物中的前列腺癌细胞系的缺乏。这是重要的，因为免疫系统在人前列腺癌的发作和进展中起重要作用。为了筛选对于治疗具有前列腺癌的患者有用的新药，必须开发可在免疫感受态动物中研究的前列腺癌细胞系，所述免疫感受态动物通过组织学反映人疾病，并且在体内经历相同类型的行为，包括如在人疾病中发生的对肺和骨的转移。
相应地，本发明的方面提供了可植入免疫感受态或免疫活性动物中的癌细胞系，所述动物包括人和非人动物，包括哺乳动物。示例性非人哺乳动物包括例如啮齿类动物例如大鼠、豚鼠和小鼠，和农场动物例如猪、绵羊、山羊、马和牛。
因为在体内的任何类型的细胞均可以是癌症的来源，所以任何合适类型的癌细胞系均可在本发明中使用。合适的癌症类型包括癌（上皮细胞的癌症）、肉瘤（骨、肌肉或其他结缔组织的癌症）、淋巴瘤（淋巴系统的癌症）、白血病（血细胞或血前体细胞的癌症）和黑素瘤（色素提供细胞的癌症）。
在一个实施例中，提供了前列腺癌细胞系，其中所述前列腺细胞系包含一组原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或多种，其已感染携带癌基因的逆转录病毒载体，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述癌基因或基因组合。
在一个实施例中，提供了小鼠前列腺癌细胞系，其中鼠前列腺细胞用选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的癌基因转导。合适的小鼠前列腺细胞系可通过用携带癌基因的逆转录病毒载体在这样的条件下感染原代鼠上皮细胞而获得，所述条件允许癌基因在原代鼠上皮细胞中表达。
例如，人癌症的转基因免疫活性小鼠模型具有比异种移植物模型更多反映人癌症的潜力，因为尤其是转基因小鼠形成原位肿瘤（即在更类似于人肿瘤的环境中和在正常免疫系统的设置中）。因此，在本发明的一些实施例中，将免疫活性非人哺乳动物改造为表达本文描述的癌基因中的一种或多种，包括c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src或其组合，且发展癌症。
存在在研究中使用人癌症的转基因小鼠模型的几个优点。例如，小动物X射线计算机体层摄影术（微型CT）可用于相对廉价地监控肿瘤的进展，并且作为用于临床前显现血管和血管生成的高度定量的三维方法。使用此类方法能够在活小鼠中在临床前治疗试验过程中实现血管分布的快速和准确评估。用微型CT的肿瘤评估允许数据的快速定量视觉绘制以及肿瘤血容量、血管密度、血管管径、支化度和使用分段分析的弯曲度的定量分析。
适合于在本发明中使用的免疫活性小鼠的例子包括（随机配种的CD1，圣康斯坦的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories,St.Constant,PQ)、C57BI/6J(B6)、C57BI/6×129/J F1（F1，缅因州巴尔港的杰克逊实验室(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)）、FVB/N、C57BV6、BALB/c和ND4。
在优选实施例中，FVB/N小鼠依照本发明用于改造转基因小鼠模型。FVB/N小鼠适合于本文考虑和/或描述的大多数转基因实验和遗传分析。近交FVB/N品系的特征在于强生殖能力和一致的大窝，并且FVB/N受精卵含有大和突出的原核，其促进DNA的显微注射。
基于选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一组癌基因中的一种或多种的表达水平，使用本发明的哺乳动物前列腺癌细胞系产生的免疫活性转基因小鼠发展能够产生可检测的分子遗传标志的前列腺肿瘤。
转移是癌症患者中的死亡主因。目前的化学疗法抗癌治疗使用旨在减少患者体内癌细胞数目的细胞毒性、激素或免疫调节剂药物。然而，渐增的大量证据显示大多数转移细胞对抗癌药物有抵抗力，并且因此目前可用的药物无法有效停止癌细胞散布到其他组织或器官。目前，不存在用于治疗大多数转移性肿瘤的有效方法，尽管有癌症治疗领域中的众多和不同的治疗革新。
“载体”或“构建体”指包含在体外或体内递送给宿主细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。待递送的多核苷酸可包含目的序列用于基因疗法。载体包括例如转座子和其他位点特异性可动元件，病毒载体例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、痘病毒、乳头状瘤病毒、慢病毒、疱疹病毒、泡沫病毒和逆转录病毒载体，并且包括假型病毒、脂质体和其他含脂质复合物，及其他能够介导多核苷酸递送至宿主细胞的大分子复合物，例如DNA包被的金颗粒、聚合物-DNA复合物、脂质体-DNA复合物、脂质体-聚合物-DNA复合物、病毒-聚合物-DNA复合物例如腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合物、和抗体-DNA复合物。载体还可包含其他组分或功能性，其还调节基因递送和/或基因表达，或另外对载体将引入其内的细胞提供有利性质。此类其他组分包括例如影响与细胞的结合或对细胞的靶向的组分（包括介导细胞型或组织特异性结合的组分）；影响载体核酸由细胞摄取的组分；影响多核苷酸在摄取后在细胞内的定位的组分（例如介导核定位的试剂）；和影响多核苷酸表达的组分。此类组分还可包括标记，例如可检测和/或可选标记，其可用于检测或选择已吸收且表达由载体递送的核酸的细胞。此类组分可提供作为载体的天然特征（例如某些病毒载体的使用，所述病毒载体具有介导结合和摄取的组分或功能性），或载体可进行修饰以提供此类功能性。大量多样的此类载体是本领域已知的，并且是一般可获得的。当载体维持在宿主细胞中时，载体可作为自主结构在有丝分裂过程中由细胞稳定地复制，掺入宿主细胞的基因组内，或维持在宿主细胞的核或细胞质中。
人前列腺癌已嵌入反映癌基因信号传导的基因构成和标志内。本发明的细胞系有利地反映这些癌基因信号传导途径中的一种或多种，从而有利于例如癌基因特异性化合物或基于核酸的疗法的测试。特别地，如本文提供的前列腺癌细胞系对于癌基因特异性化合物或基于核酸的疗法的测试和/或筛选是有用的。
合适的癌基因特异性抑制剂的例子包括对于c-Myc、Ha-Ras、c-Src和ErbB2癌基因的抑制剂。在临床使用或开发中的靶向ErbB的几种合适的抗癌剂，包括属于针对ErbB家族的嵌合或人源化单克隆抗体种类的那些和小分子ErbB酪氨酸激酶抑制剂。嵌合或人源化单克隆包括阻止配体结合和配体依赖性受体激活的抗体（例如靶向ErbB1的配体结合亚结构域III的西妥昔单抗）、干扰配体依赖性受体激活的抗体（例如靶向ErbB2的亚结构域IV的曲妥珠单抗）、和阻止受体异二聚化的抗体（例如靶向ErbB2的亚结构域II中的二聚环周围区域的抗ErbB2抗体帕妥珠单抗）。示例性小分子ErbB酪氨酸激酶抑制剂包括两种ErbB1特异性酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼/易瑞沙和厄洛替尼，其已批准用于治疗非小细胞肺癌，和双重ErbB1/ErbB2抑制剂拉帕替尼，其作为上市并且指出与卡培他滨组合用于治疗具有晚期或转移性乳腺癌的患者；并且与来曲唑组合用于治疗具有过表达HER2的激素受体阳性转移性乳腺癌的绝经后女性。
其他ErbB2受体抑制剂包括GW-282974（葛兰素威康公司(GlaxoWellcome PLC)），以及单克隆抗体AR-209（美国德克萨斯州林地市的Aronex制药有限公司(Aronex Pharmaceuticals Inc.of The Woodlands,Tex.,USA)）和2B-1(Chiron)。示例性ErbB2抑制剂还包括在WO1998/02434（1998年1月22日公开）、WO1999/35146（1999年7月15日公开）、WO1999/35132（1999年7月15日公开）、WO1998/02437（1998年1月22日公开）、WO1997/13760（1997年4月17日公开）、WO1995/19970（1995年7月27日公开）、美国专利号5,587,458（1996年12月24日颁布）和美国专利号5,877,305（1999年3月2日颁布）中描述的那些，所述专利各自全文以引用的方式并入本文。在本发明中有用的ErbB2受体抑制剂也在1999年1月27日提交的美国临时申请号60/117,341和1999年1月27日提交的美国临时申请号60/117,346中描述，所述申请全文以引用的方式并入本文。
在本发明中有用的c-Src蛋白质酪氨酸激酶抑制剂的例子包括但不限于一般和具体公开于WO1996/10028、WO1997/28161、WO1997/32879和WO1997/49706中的化合物，包括属于下述结构种类的化合物：吡咯并嘧啶尤其是吡咯并[2,3-d]嘧啶、嘌呤、吡唑并嘧啶尤其是吡唑并[3,4-d]嘧啶、吡唑并嘧啶尤其是吡唑并[3,4-d]嘧啶和吡啶并嘧啶尤其是吡啶并[2,3-d]嘧啶。示例性化合物包括下式I-IV的化合物。
上文化合物可如引用的文件中所述进行制备且施用。式I的化合物可如WO1996/10028中所述进行制备且配制。式II的化合物及其制剂公开于WO1997/16452的实例111c3中。式IV的化合物可与其类似进行制备。两种后面的化合物可如WO1997/16452中所述进行配制。式III的化合物由R.Gamse等人在J.Bone Miner.Res.14(Suppl.1),1999,S487中讨论。
另外的有用化合物（例如PP1）由T.Schindler、F.Sicheri等人在Molecular Cell,1999(3),639,647中；J.M.Hamby等人，J.Med.Chem.40,1997,2296-2303；R.L.Panek等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.283,1997,1433-1444；和S.R.Klutchko等人，J.Med.Chem.41,1998,3276-3292中描述。
其他src抑制剂包括SKI606，也称为博舒替尼（惠氏公司(Wyeth)），和公开于WO2000/62778和美国专利号6,596,746中的化合物达沙替尼，也称为施达赛（百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)）。所有这些src抑制剂全部并入本文。
小分子c-Myc抑制剂包括10074-G5，也称为联苯基-2-基-(7-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-4-基胺；喹氟拉辛（也称为CX-3543）；和10074-G5，也称为联苯基-2-基-(7-硝基苯并[1,2,5]噁二唑-4-基胺。据报道CX-3543通过与c-Myc四重、四链DNA二级结构结合来抑制c-Myc活性，所述二级结构调节特异性癌基因包括c-Myc的转录。
其他c-Myc抑制剂包括公开于美国专利申请公开号2007/0203188（2007年8月30日公开）中的化合物。这些c-Myc抑制剂全部并入本文。
在又一方面，本发明提供了用于体外生产永生化原代哺乳动物上皮细胞的方法，该方法包括用逆转录病毒载体感染原代哺乳动物上皮细胞，所述逆转录病毒载体携带选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的癌基因，以提供受感染细胞，其中所述原代哺乳动物上皮细胞能够被所述逆转录病毒载体和在这样的条件下感染，由此在所述受感染细胞中表达c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
任何合适的基因递送系统均可用于本发明中。合适的基因递送系统的具体例子包括逆转录病毒和腺病毒表达系统。逆转录病毒介导的基因转移广泛用于在多种细胞系包括造血细胞中表达蛋白质，这由于多种原因，包括其对血细胞增殖、分化和生物学功能的作用的分析。特别地，鼠干细胞病毒(“MSCV”)逆转录病毒表达系统（隆达生物技术实验室公司(Clontech Laboratories,Inc)）含有对于将靶基因引入多潜能细胞系中且在多潜能细胞系中表达靶基因优化的载体，所述多潜能细胞系包括鼠或人造血、胚胎干(ES)和胚胎性癌(EC)细胞。腺病毒表达系统的具体例子包括ViraPowerTM腺病毒表达系统（美国生命技术公司(Life Technologies)），其例如对于产生复制缺陷型腺病毒是有用的，所述腺病毒可用于在分裂或非分裂哺乳动物细胞中递送且瞬时表达目的靶基因。
II.使用方法：
在另一方面，本发明提供了用于诊断前列腺癌的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者的生物学测试样品，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中；(b)基于测试样品中与前列腺癌诊断相关的基因表达模式，测定至少一种生物标记或分子遗传标志的水平；(c)比较所述测试样品中的所述至少一种生物标记或所述分子遗传标志的水平与对照样品中的生物标记的水平或分子遗传标志的水平，其中相对于所述对照样品中的生物标记或分子遗传标志的水平，所述测试样品中的生物标记或分子遗传标志的水平升高是所述受试者中的前列腺癌存在的诊断指示物。
在一个实施例中，生物样本包括源自得自患者的肿瘤的核酸。核酸可通过活组织检查源自肿瘤、或源自在尿中的来自肿瘤的细胞或由于分泌到患者血液内的基因标志而制备的蛋白质。
在又一方面，本发明提供了分类前列腺肿瘤的方法，该方法包括：(a)提供前列腺肿瘤样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和(c)基于检测步骤的结果，将前列腺肿瘤分类为属于肿瘤亚类。
在一个方面，本发明提供了将具有癌症肿瘤包括前列腺肿瘤的受试者分层用于临床试验的方法，该方法包括：(a)提供源自具有癌症肿瘤或前列腺肿瘤的受试者的样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src、ErbB2及其组合；和(c)基于检测步骤的结果，将受试者分层用于临床试验。
在一些实施例中，将受试者分层为基于分子遗传标志的存在和/或与分子遗传标志联系的功能途径的亚类。
在一个实施例中，分子遗传标志基于测试样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性，所述测试样品源自具有癌症肿瘤特别是前列腺癌肿瘤的受试者，其中所述其中一组或多组基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
在另一方面，本发明提供了选择用于具有前列腺肿瘤的受试者的治疗的方法，该方法包括：(a)提供源自具有前列腺肿瘤的受试者的样品；(b)检测源自样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和(c)基于检测步骤(b)的结果选择治疗。（即基于癌基因的疗法将基于患者肿瘤中的肿瘤标志给予）
在又一方面，本发明提供了通过用一种或多种外源癌基因转化细胞产生的非天然存在的细胞，允许所述细胞分裂至少一次，其中所述细胞是被含有一种或多种外源癌基因的载体转化的人细胞，其中所述一种或多种外源癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。该标志可应用于源自前列腺癌的遗传材料–即在与前列腺有关的生物流体中，包括前列腺、尿、血液或其他生物样本。该标志还可应用于其他癌症类型特别是如对于乳腺癌显示的。在c-Myc标志的情况下，该标志在前列腺肿瘤和源自c-Myc在转基因小鼠的乳腺中的转基因表达的乳腺肿瘤中可见（图7C）。
在一个实施例中，本发明包括通过下述鉴定癌症：获得来自受试者的生物样品，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中，并且测定来自生物样品的遗传材料是否具有如本文描述的遗传标志。在一个实施例中，生物样品源自前列腺活组织检查。在另一个实施例中，生物样品源自与前列腺有关的生物流体，包括前列腺、尿、血液或其他生物样本。在另一个实施例中，本发明的方法包括在获得尿样品用于遗传标志鉴定前按摩前列腺。在另一个实施例中，该方法包括如上所述的其他流体。
新治疗需要在动物中的新测试方案。这些研究已受限于可植入免疫感受态动物中的前列腺癌细胞系的缺乏。免疫系统在人前列腺癌的发作和进展中起重要作用。为了允许筛选新药以治疗具有前列腺癌的患者，必须开发可在免疫感受态动物中研究的前列腺癌细胞系，所述免疫感受态动物通过组织学反映人疾病，并且在体内经历相同类型的行为，包括如在人疾病中发生的对肺和骨的转移。与这些细胞系的产生有关的方法在补充3中描述，所述细胞系可在免疫感受态小鼠中使用。
寡核苷酸序列可如本领域已知的引入细胞内。转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合颗粒与病毒和非病毒载体以及本领域已知的其他方法可用于将寡核苷酸序列递送至细胞。选择的递送方法至少取决于待治疗的细胞和细胞的定位，并且将是本领域技术人员已知的。定位可通过下述实现：在表面上具有特异性标记用于指导脂质体的脂质体、直接注射到含靶细胞的组织内、具有在空间接近中与靶细胞结合的沉积物、特异性受体介导的摄取、病毒载体等。癌基因可以通过转导或转染引入细胞内。转导可使用逆转录病毒或其他病毒递送系统进行。
实例
小鼠、细胞培养物、化学品和试剂。
使用转基因小鼠的实验程序通过托马斯杰斐逊大学(ThomasJefferson University)的伦理委员会批准。小鼠是FVB品系。小鼠前列腺上皮细胞培养物从12周龄雄性小鼠的前列腺中分离，并且如先前描述的[42]维持，并且在25次传代后进行分析，对于每个基因型具有至少三个系。在载体pBABE-IRES-GFP中编码c-Myc、Ha-Ras、v-Src、NeuT的逆转录病毒表达载体的细胞转导先前得到描述[43,44]。
细胞生长测定。
将细胞以1x104细胞/孔的浓度种植到24孔板中，每个样品一式三份x7天。在具有10%FBS的DMEM培养基中生长经转化的细胞，而对照PEC细胞在前列腺上皮原代培养基中培养。每24小时收获细胞，在100μl PBS中悬浮细胞，加入等体积的0.4%台盼蓝，在5分钟后，通过CountessTM自动计数的细胞计数器（C10227，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英潍捷基公司(Invitrogen Carlsbad,CA)）来计数细胞。
软琼脂中的集落形成。
将细胞(3x103/ml)种植到悬浮皿（纽约州罗彻斯特的Nalgene NuncInternational公司(Nalgene Nunc International,Rochester,NY)）中的0.3%软琼脂（西格玛公司(Sigma)）内。集落通过0.04%乙酸结晶紫染色，并且在温育2周后在立式显微镜下计数。
肿瘤形成测定I
将在100μl体积中的1x106细胞皮下注射到7～8周的FVB雄性小鼠内。我们将细胞悬液与按体积计20%的BD基质胶（马萨诸塞州贝德福德的BD生物科学公司(BD Biosciences,Bedford,MA)）混合，得到10-7细胞/ml的最终细胞浓度。通过游标卡尺每周两次测量肿瘤生长。在30天后收获肿瘤样品（除了在16天后收获的NeuT诱导的肿瘤外）。
细胞培养、转染、转导、表达载体
生成用Ha-Ras、v-Src和NeuT癌基因转化的PEC（前列腺上皮细胞）系，并且用含有luc2基因的慢病毒载体转染，以生成稳定的生物发光癌细胞系。Luc2-番茄红表达载体先前得到描述（Liu,H.,等人，ProcNatl Acad Sci U.S.A.2010,107,18115-18120）。同基因PEC系维持在补充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素-链霉素的达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)，并且在37℃下在5%CO2中培养。
划痕愈合测定
细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中在12孔板上生长至汇合。用P10微量加液器吸头将单层划痕。细胞在用PBS评分后立即洗涤，并且加入无血清DMEM(16)。监控细胞迁移20小时，并且使用Axiovert200Zeiss显微镜系统在9小时、12小时、15小时和20小时时间点获得照片。使用ImageJ软件分析图像。
细胞因子阵列分析
点在硝酸纤维素膜上的小鼠细胞因子阵列得自瑞博奥生物科技公司(Raybiotech)。通过在无血清DMEM中培养细胞48小时制备条件培养基。随后根据制造商的说明书处理膜用于评估条件培养基中分泌的细胞因子（参见Katiyar,S.等人，Mol Cell Biol2007,27,1356-1369）。
肿瘤形成测定II
通过暴露于3%异氟烷使12周龄的雄性nu/nu小鼠麻醉。通过在一个背侧胁腹下的皮下注射，麻醉的小鼠接受悬浮于50μL缺乏钙和镁的达尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)和50μL BD基底膜基质胶（马萨诸塞州贝德福德的BD生物科学公司(BD Biosciences,Bedford,MA)）中的1x106细胞。注射已使用27G1/2针执行。已通过每周一次的生物发光测量跟踪肿瘤进展，直至使用如先前描述的肿瘤摘除(18)。一次背侧监控三只小鼠。来自展示图像的目的区(ROI)在肿瘤部位或转移病灶周围描绘，并且使用Living Image3.0软件（卡利普生命科学公司(Caliper LifeSciences)）定量。在3周后收获肿瘤样品。涉及小鼠的所有实验均在托马斯杰斐逊大学的IACUC批准下执行。
实验转移测定
通过暴露于3%异氟烷使8周龄的雄性FVB小鼠麻醉。将悬浮于100μL DPBS中的2x105癌细胞注射到小鼠心脏的左心室内。注射使用30G1/2针和1m注射器执行。为了证实在体循环中细胞的存在，使用IVISLUMINA XR系统（马萨诸塞州霍普金顿的卡利普生命科学公司(Caliper Life Sciences,Hopkinton MA)）使动物成像。通过遍布动物体分布的全身生物发光指出成功的心内注射。从研究中去除未适当注射的小鼠。为了在体内成像小鼠，通过10μL荧光素原液/克体重（制造商的建议）的腹膜内注射，动物接受以在PBS中15mg/mL的萤光素酶底物D荧光素(Gold Biotechnology)，并且通过暴露于3%异氟烷麻醉。在D-荧光素注射后10-15分钟时，将动物置于IVIS Lumina XR（马萨诸塞州霍普金顿的卡利普生命科学公司）的相机盒内，并且接受2.5%异氟烷的连续暴露。成像时间范围为5秒（对于以后时间点）到5分钟（对于较早时间点），这取决于转移病灶的生物发光。仅一只小鼠腹侧成像。使用Living Image3.0软件分析结果。对于离体BLI，将D-荧光素在PBS中稀释到300μg/mL的最终浓度，并且用于在成像前浸泡新鲜分离的器官2-3分钟。动物实验由托马斯杰斐逊大学的IACUC批准。
骨转移的射线照相术分析和CT
使用IVIS Lumina XR（卡利普生命科学公司）通过X射线照相术监控骨转移的发展。将小鼠麻醉，安排在俯卧位并且暴露于X射线5分钟。马拉维若（CCR5的拮抗剂）的施用。自从癌细胞接种前5天以及在ic注射后直至安乐死时，雄性FVB小鼠每12小时接受8mg/kg的马拉维若（赛力克化学有限公司(Selleck Chemicals LLC)）口服剂量。将药物溶解于含有5%DMSO和0.5%1N HCl的水中。对照小鼠维持在相同的给药方案上并且接受相同媒介物体积的注射。
侵入测定
如先前报道的执行三维侵入测定。简言之，将100ml1.67mg/ml大鼠尾部胶原I型（BD生物科学公司(BD Biosciences)）吸取到24孔8mm孔跨室(transwell)（马萨诸塞州洛威尔的康宁公司(Corning,Lowell,MA)）的上室内。将跨室在37℃下温育过夜，以允许胶原固化。随后将30,000个细胞种植到跨室膜的底部上且允许附着。将无血清生长培养基置于下室内，而10ug/ml骨桥蛋白(R&D System)、或15ng/ml CCL5(R&D System)、或10%FBS用作在上室的培养基中的化学吸引剂。随后将细胞化学吸引跨越滤器通过上文胶原共三天。将细胞在4%甲醛中固定，用在PBS中的0.2%Triton-X渗透化，并且随后用40mg/ml碘化丙啶(PI)染色2小时。在基梅尔癌症中心生物成像实验室(KimmelCancer Center Bioimaging Facilit)使用Zeiss LSM510Meta倒置共焦显微镜，从滤器的底部以10x放大率通过共焦z切片（每20mm一个切片）分析荧光。
组织学分析
将肿瘤样品和软组织在4%多聚甲醛(PFA,Fisher)中固定，并且处理用于石蜡包埋、切片、H&E和免疫组织化学(IHC)。将骨在4%PFA中在4℃下固定72小时，在0.5M EDTA(pH8)中在4℃下脱钙7天，并且在石蜡中包埋(19)。在肿瘤切片上的vWF染色通过KCC的病理学核心实验室(Pathology Core Facility)执行。在去石蜡化和再水合后执行CK14（科文斯公司(Covance)）PRB-155P和CK8（克隆1E8,科文斯公司）MMS-162P染色，而不执行对骨和脑样品的抗原修复处理，以区别基部与腔前列腺上皮细胞。如由制造商（西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)）指导的，在去石蜡化和再水合后执行TRAP（耐酒石酸盐酸性磷酸酶）染色，以鉴定在转移病灶和骨密质之间的表面上的活性破骨细胞(5)(20)。对骨执行四铬法，以鉴定在成骨细胞病灶区域中的编织骨(5,21)。仅对脑样品执行（RV202，圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)）染色，以区别肉瘤与癌。
激光捕获显微解剖和RNA提取
去除皮肤和肌肉后的整个脑和腿在最适切割温度培养基（OCT化合物Tissue Tek）中速冻，并且贮存于-80℃下。组织在低温恒温器()上切片并且在膜载玻片NF1.0PEN上固定。使用PALM Microbeam系统（卡尔蔡斯公司(Carl Zeiss)）和PALM Robo v4.2软件执行LCM。将冷冻切片用甲酚紫（LCM染色试剂盒，Ambion）染色。捕获在从染色步骤起2小时内完成，以确保RNA质量。在胶粘盖(adhesive cap)（卡尔蔡斯公司）中收集的组织直接贮存于-80℃下，其中盖朝下。如制造商的建议（RNeasy Micro Kit，凯杰公司(Qiagen)），将捕获的细胞裂解且提取RNA。（参见Bos,P.D.等人Nature2009,459,1005-1009；和Wang,W.Z.等人BMC molecular biology2009,10,69）。通过在KCC的核酸实验室(Nucleic Acids Facility)使用2100生物分析仪（安捷伦公司(Agilent)）检查RNA的完整性。RNA质量评估基于RNA完整性数目(RIN)。
微阵列分析方法
预处理和差异表达分析。使用本底校正预处理微阵列数据，使用在Affymetrix Expression Console版本1.1[加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞公司(Affymetrix,Inc.,Santa Clara,CA)]中的强多芯片分析(RobustMultichip Analysis，RMA)工作流，在小鼠基因1.0ST基因表达微阵列上执行分位数标准化和概括。通过针对Pec对照细胞系执行配对比较，对于四个过表达细胞系各自鉴定差异表达的基因。使用微阵列显著性分析(SAM)执行这些比较，使用1%的假发现率截断和两倍变化截断。
蛋白质印迹
蛋白质印迹测定如所示的在PEC细胞中执行。使细胞形成团块且在补充有蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液（50mM HEPES、pH7.2、150mMNaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM DTT、0.1%Tween20）（德国曼海姆的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)）中裂解。用于蛋白质印迹的抗体是：AR（H-280，圣克鲁斯生物技术公司）。
CGH数据概括
根据CGH数据，相对于癌基因转化的细胞系，对于从脑和骨中回收的转移性Src转化细胞测定拷贝获得和丧失。基因组拷贝变异区鉴定为其中转移性Src转化细胞系的所有三个重复样品均证实相对于Src转化细胞系的获得或丧失的基因组区段。通过跨越小鼠基因组标绘获得和丧失的频率来概括拷贝数数据。
PET成像：
动物成像根据机构动物管理与使用委员会(Institutional AnimalCare and Use Committee)执行。在等渗溶液中的氟-18，氟化钠(F-18-NaF)得自IBA分子公司(IBA Molecular)（弗吉尼亚州的阿什本(Ashburn,VA)）。将在150μl中的210±9.54μCi F-18-NaF通过侧面尾静脉注射到未麻醉的小鼠。一小时后，用在98.5%O2中的1.5%熏硫(sulfuring)麻醉动物，并且用Inveon microPET扫描仪（伊利诺伊州的西门子霍夫曼产业(Siemens Hoffman estate,IL)）成像。在10分钟成像中获得平均起来1.5百万计数的高空间分辨率（在半高全宽中1mm）和灵敏度(>10%)PET扫描仪。具有5次迭代和8个子集的有序子集期望最大3维(3D)算法用于证实。
统计分析。
通过双侧t检验分析组间比较。P<0.05的差异视为统计上显著的。所有分析均用SPSS11.5软件完成。数据表示为平均值±SEM。
微阵列分析方法。预处理和差异表达分析。
使用本底校正预处理微阵列数据，使用在Affymetrix ExpressionConsole版本1.1[加利福尼亚州圣克拉拉的昂飞公司(Affymetrix,Inc.,Santa Clara,CA)]中的强多芯片分析(Robust Multichip Analysis)(RMA)[45]工作流，在小鼠基因1.0ST基因表达微阵列上执行分位数标准化和概括。通过针对PEC对照细胞系执行配对比较，对于四个过表达细胞系c-Myc、NeuT、Ha-Ras和v-Src各自鉴定差异表达的基因。使用微阵列显著性分析(SAM)执行这些比较，使用1%的假发现率截断和两倍变化截断。
与成纤维细胞和乳房肿瘤乳腺癌细胞系的比较。
四个癌基因过表达细胞系的差异表达模式针对先前公开的数据集进行比较，所述数据集包括癌基因转导的成纤维细胞和诱导的乳房肿瘤[46]。这个数据集在昂飞鼠11K微阵列A和B集上生成，并且含有Ha-Ras过表达样品、c-Myc过表达样品以及正常对照。来自Huang等人[46]的原始数据（Affymetrix.CEL文件）得自公布网站。.CEL文件使用RMA进行处理，使用来自密歇根大学(University of Michigan)定制CDF网站的更新探针集定义（Entrez探针集版本12，日期为2009年7月30日）[47]。来自这个数据集的总共6143种基因对基因符号作图且用于比较分析。执行差异表达分析，以鉴定与对照相比较对Ras和Myc细胞系特异性的差异调节的基因，使用SAM与10%的FDR截断。在这个数据集中鉴定的差异表达的基因针对我们的四个癌基因过表达的细胞系进行比较。
接受者操作特征(ROC)曲线用于标绘在诊断和与c-Myc标志关联时关于PSA的区别值范围上的灵敏度和特异性[29-31]。对于PSA的估计，具有异常PSA和临床转移事件的样品视为真阳性，而具有异常PSA和无临床转移事件的样品视为假阳性。对于c-Myc标志的估计，与标志具有高关联且具有临床转移的样品视为真阳性，而具有低或负关联和临床转移事件的样品视为假阳性。
对于四个癌基因转化的前列腺癌细胞系各自唯一的基因标志针对两个先前公开的前列腺数据集进行比较。第一个数据集包含185个样品，从MSKCC前列腺癌数据库网站(http://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/)下载log2标准化的mRNA表达数据[20]。这个MSKCC数据集中的基因概况是中值集中的，并且对于每个癌基因特异性标志在每个MSKCC样品和log2倍数变化概况之间计算皮尔森关联。包括远端转移样品的第二个前列腺癌数据集先前得自MSKCC杰拉尔德实验室(Gerald Laboratory)，并且样品如[33]中所述的进行处理。简言之，使用强多芯片平均值(RMA)程序[45]处理微阵列样品，使用日期为2009年7月30日的定制CDF（版本12）[47]。
与前列腺癌的临床特征的比较。
四个癌基因过表达的细胞系的表达模式针对关于临床性状的表达数据进行比较，所述临床性状包括疾病分期、分级和复发，先前由Lapointe等人[3]公开。数据从公布网站下载。这个数据集含有5153个探针集和具有注释的112个前列腺癌样品，所述注释包括肿瘤分级、肿瘤期和疾病复发。使用日期为7/9/2009的阵列信息文库通用导航仪(Array Information Library Universal Navigator)GPL3044注释文件[48]更新探针集注释。消除缺乏基因符号注释的探针集以及具有至少25%漏失值的探针集，得到对于3327种独特基因总共4232个特征。使用SAM与25%的FDR截断，对于晚期与早期相比较、高分级与低分级相比较、和复发与无复发疾病相比较执行差异表达分析。在这个数据集中鉴定的差异表达的基因针对四个癌基因过表达的前列腺癌细胞系进行比较。使用超几何检验估计在来自LaPointe数据集的差异表达基因和我们数据中的基因之间的重叠中的显著性。
通过使用先前公开的具有关于无复发存活的临床数据的微阵列数据集[11]，就其与疾病复发的关系研究来自四个癌基因过表达细胞系的符合至少两倍变化截断的所有上调的基因。如[11]中所述，用昂飞微阵列套件版本5.0(Affymetrix Microarray Suite v.5.0)处理微阵列数据，并且从该作者的网站(http://www.ordwayresearch.org/Glinsky-Supplemental2.html)的补充信息部分下载关于每个前列腺样品的临床数据。将数据log2转化，并且对于四个细胞系各自，并且通过将它们一起求平均值且将它们定标至具有最大变异的探针集来处理具有多个探针集的基因。从分析中过滤掉在最低第50百分位数中具有变异的基因。关于在复发数据集中的四个系过表达标志各自的平均表达用于将群体分成高（前第25百分位数）和低（后第75百分位数）表达组。对于高和低表达群体标绘无复发存活曲线，并且使用对数秩和检验计算显著p值。
癌基因转化的前列腺细胞系表现出(convey)接触不依赖性生长。
原代前列腺上皮细胞培养由FVB小鼠的腹部前列腺建立（图1A）。用编码单一不同癌基因（c-Myc、Ha-Ras(V-12)、v-Src和NeuT，即ErbB2的激活突变体）的逆转录病毒表达载体转导细胞。经过四周时期改变前列腺上皮细胞的细胞形态（图1B）。选择且表征癌基因转导的细胞的个别集落。通过细胞计数进行细胞生长测定（图1C）。与原代前列腺上皮细胞相比较，在每个癌基因转导的细胞系中观察到大量生长优点。
进行蛋白质印迹分析，以检查用于转导PEC的癌基因各自的相对表达。通过蛋白质印迹鉴定癌基因c-Myc、Ha-Ras、ErbB2和v-Src的存在。每种癌基因的丰度中的增加对每个细胞系是特异性的（图2A）。与原代PEC相比较，Src的相对丰度在每个系中是增加的，并且与其他肿瘤细胞系相比较，在v-Src转化的PEC中是约2倍大（较短的暴露，图2A）。成纤维细胞或鼠上皮细胞的癌基因转化表现出在固体琼脂中的接触不依赖性生长。检查癌基因转导的PEC系在软琼脂中的生长。对于每种癌基因表征集落大小和数目（图2B）[27]。如先前描述的，未经转化的PEC未能在软琼脂中生长[27]。癌基因转导增加集落大小和数目（图2C，D）。
前列腺癌细胞系的肺转移。
在FVB小鼠中进行肿瘤形成研究。1x106细胞的皮下注射导致肿瘤生长。通过游标卡尺进行系列测量。前列腺肿瘤系各自在免疫感受态小鼠中皮下生长。生长对于c-Myc、Ha-Ras和v-Src转化的PEC持续（图3A）。摘除的肿瘤是出血性的（图3B），具有分化不良的前列腺腺癌的组织学特征（图3C，补充1）。关于血管性血友病因子(VWF)的肿瘤免疫染色证实血管生成，并且证实在由Ha-Ras诱导的肿瘤中显著更大的VWF染色（补充2A，B）。就CK5、AR、MUC1和MGK（PSA的鼠同系物）染色肿瘤（补充2C）。如“材料与方法”中所述，通过组织病理学评估在尸体解剖时表征肺转移（图4A）。源自原代PEC的肺转移数目在Ha-Ras、v-Src和c-Myc亚系中是增加的（图4B）。
前列腺癌细胞系中的癌基因特异性分子标志。
为了进一步表征在前列腺上皮细胞中由特异性癌基因调节的分子遗传信号传导途径，由癌基因转化的PEC细胞系制备mRNA。微阵列分析从22115种基因中鉴定总共2635种基因，当与未经转化的前列腺上皮细胞对照样品相比较时，所述基因在癌基因过表达的细胞系中的表达中显著改变（至少两倍变化）（图5）。鉴定为在其表达中显著不同（至少2倍变化）的基因的热图显示于图5中。热图的行代表独特基因，并且对于所有四个癌基因诱导的细胞系通过其上和下调模式展示。相当大数目的上和下调的基因在所有四个细胞系中共享（组1；251种基因）。例如，组1含有跨越所有四个细胞系共享差异表达模式的基因，而组15含有其差异表达对于Src细胞系是特异性的基因。具有对于Ha-Ras特异性上和下调的基因是最普遍的（组14；584种基因），随后为c-Myc特异性基因（组8；332种基因）、NeuT特异性基因（组12；277种基因）和v-Src特异性基因（组15；215种基因）。
在高分级和晚期人前列腺癌中的鼠前列腺癌基因表达标志。
前列腺“癌基因表达标志”定义为与原代前列腺上皮细胞相比较，在表达水平中显著改变且在特异性癌基因的表达中独特改变的基因（图5）。从而鉴定的癌基因表达标志与得自其他公开数据库的基因标志相比较，以鉴定与其他充分研究的疾病表型和细胞系的相似性。比较针对基因标志进行，所述基因标志代表在晚期状态与早期状态前列腺癌相比较、高分级与低分级前列腺癌相比较、复发与无复发前列腺癌相比较中的差异表达[3]。代表晚期/早期、高分级/低分级和复发/无复发前列腺癌表型[3]的基因标志热图（图6A,B）显示在左侧上，并且在右侧上的热图代表在前列腺癌基因表达标志中差异表达的基因。图6-8中的热图用在差异表达的“癌基因表达标志”内的基因百分比标记。显示了关于在前列腺癌细胞系中表达的基因和疾病表型的基因标志之间的相似性的统计显著性的P值。P值基于超几何分布，并且代表如果基因随机选择，则这些基因在疾病表型中差异表达的概率。低p值指出在癌基因细胞系和不太可能仅仅偶然出现的疾病表型之间的相似性程度。
“高分级”前列腺癌基因标志先前由61个原发性前列腺肿瘤测定[3]。图6A显示来自前列腺癌基因表达标志的34种基因是高分级基因标志共同的(p=2.97x10-5)。对于每种癌基因诱导的前列腺癌细胞系，显示了促成那个细胞系的显著基因比例。例如，在前列腺癌基因表达标志和高分级疾病之间的重叠包括其为c-Myc(47%)、NeuT(53%)、Ha-Ras(71%)和v-Src(62%)中的显著基因的基因组合。图6B描述在前列腺癌基因标志和晚期基因标志之间共同的72种基因(p=4.13x10-8)。这些结果指出在前列腺癌基因表达标志和高分级疾病之间(p=2.97x10-5)和在癌基因表达标志和晚期疾病表型之间(p=4.13x10-8)的显著相似性程度。
在前列腺癌基因表达标志和由Lapointe等人[3]鉴定的复发/无复发疾病标志之间未鉴定出显著重叠。当前列腺癌基因表达标志与Lapointe数据相比较时，Ha-Ras细胞系捕获与高分级疾病的最高水平的相似性(71%)，而v-Src细胞系显示与晚期疾病的最高相似性(67%)。
前列腺癌上皮细胞中的c-Myc特异性基因表达标志类似成纤维细胞和乳房肿瘤中的c-Myc标志。
在先前研究中，我们鉴定了对于用于转化成纤维细胞（3T3细胞）的癌基因特异性的基因表达标志，其在由c-Myc或Ha-Ras诱导的乳房肿瘤中重演[28]。先前定义的c-Myc和Ha-Ras诱导的分子标志与在前列腺癌上皮细胞中由这些癌基因诱导的基因表达标志相比较。图7A中的热图描述在c-Myc转导的成纤维细胞（图7A）、c-Myc诱导的乳房肿瘤（图7C）（左手热图）和c-Myc诱导的前列腺癌基因表达标志（右手热图）之间共享的基因。在前列腺癌基因表达标志和在小鼠成纤维细胞（108种基因，超几何p=5.84x10-12）或乳房肿瘤（363种基因；超几何p=7.5916e-012）中由c-My转导差异调节的基因之间鉴定显著重叠。在前列腺癌基因表达标志内，c-Myc细胞系证实与Myc转导的成纤维细胞(92%)（图7A）和c-Myc诱导的乳房肿瘤(85%)（图7C）的最大比例的相似性。
前列腺癌基因表达标志针对Ha-Ras转导的成纤维细胞的比较（图7B）。在前列腺癌基因表达标志和在小鼠成纤维细胞中Ras癌基因转导后差异表达的基因（64种基因，超几何p=5.65x10-9）之间鉴定显著重叠。令人惊讶的是，与v-Src、c-Myc和NeuT细胞系相比较，Ha-Ras转化的前列腺上皮细胞系显示与Ha-Ras转导的成纤维细胞标志的更少共同性(52%)（图7C）。
接受者操作特征(ROC)曲线（图7D）用于估计PSA和c-Myc标志鉴定转移性疾病的区别潜力。
ROC曲线先前已用于估计PSA的诊断能力[29,30]及其鉴定转移性疾病的能力[31]。在MSKCC PCa样品中，c-Myc标志ROC曲线显示出比PSA更好的灵敏度/特异性特征，如在ROC曲线下面积中显而易见的。ROC曲线下面积代表变量区别两种条件的潜力[32]，从而指出c-Myc标志表现为比血清PSA水平更佳的转移性疾病鉴别物。
c-Myc标志与转移性前列腺癌关联。
所有样品均得自可公开获得的前列腺癌数据集[11,20,33]。这个比较显示，c-Myc标志显示在肿瘤样品子集中的正相关，其在晚期肿瘤中更显而易见，并且与正常前列腺组织反相关（图7E）。相比之下，Ha-Ras和v-Src标志与正常前列腺组织内的表达概况最一致地关联，并且其在肿瘤样品中的关联更异质。
在人前列腺癌中前列腺癌基因诱导的基因表达和无复发存活。
为了检查在癌基因转化的细胞系中表达的基因和来自人前列腺癌的存活率之间的关系，使用先前公开的具有已知临床无复发存活时间的人前列腺肿瘤样品的微阵列数据集[11]。这个公开数据集中对应于四个癌基因转化的前列腺癌细胞系各自中上调的那些的基因用于将样品指定为高（前第25百分位数）或低的（后第75百分位数）。卡普兰迈耶分析(Kaplan Meier analysis)用于估计与这些基因的高表达与低表达相比较相关的无复发存活中的差异。图8A提供示出在来自Glinsky的数据集的人前列腺癌样品中的基因表达概况的热图，所述基因在癌基因转化的前列腺癌细胞系中是上调的。在四个前列腺癌基因细胞系各自中高度表达的基因具有与不良结果的显著相关(p<0.005)（图8B,E）。
图例
图1：癌基因转化的前列腺癌细胞系的建立。
(A)(I)FVB小鼠，(II)前列腺用于建立原代前列腺上皮细胞(PEC)，如通过相差显微镜检查显示的（在12周龄时的雄性FVB小鼠的腹侧前列腺）。(B)采用的方法的图示和源自被不同癌基因(c-Myc、NeuT、Ha-Ras、v-Src)转导的PEC的癌基因诱导细胞系的相差显微镜检查。选择且表征源自癌基因转导的PEC的个别集落的照片。(C)通过细胞计数测定的PEC系的生长曲线。数据是N>3次分离实验的平均值±SEM。
图2：癌基因转导的PEC系在软琼脂中形成集落。
(A)每个癌基因诱导的PEC的3个分离克隆的蛋白质印迹分析显示如所示的用于检测c-Myc、NeuT、Ha-Ras和v-Src的抗体。GDI用作蛋白质装载对照。(B)癌基因转导的PEC的软琼脂测定。未经转化的PEC未能在软琼脂中生长。(C)、(D)来自癌基因转导的PEC系的集落大小(C)和数目(D)显示为N>5次分离实验的平均值±SEM。
图3：前列腺上皮细胞系在免疫感受态小鼠中生长。
(A)通过游标卡尺测量测定的PEC肿瘤直径显示为FVB小鼠中的接种后天数。关于N>5次分离实验的平均直径±SEM。NeuT肿瘤生长2周，随后尺寸减少。(B)源自癌基因诱导系的代表性肿瘤照片。在细胞注射后15天时收获NeuT诱导的肿瘤。(C)PEC的苏木精伊红和(D)VWF染色证实具有局部血管分布的分化不良的前列腺腺癌。
图4：癌基因转化的前列腺上皮细胞肿瘤转移至肺。
(A)在肿瘤植入后的鼠肺的苏木精伊红染色证实肺转移的代表性例子。(B)在皮下注射后5周，对于c-Myc、NeuT和v-Src PEC组，在小鼠中检测肺转移的频率。比率在Ha-Ras和v-Src组中是100%频率。
图5：微阵列基因表达的层次聚类。
(A)四个不同的癌基因转化细胞系的三个分离克隆的双向层次聚类概述。显示了与原代（未经转化的）PEC的比较。关于T检验统计学的移动平均值曲线图。FVB小鼠用相等数目的PEC静脉内注射。差异表达的基因在四个癌基因过表达的细胞系各自中组织成上和下调模式。对于总共N=30只小鼠，数据是N>3次分离实验的平均值±SEM。
图6：与高分级和晚期人前列腺癌相关的基因。
在四个癌基因转化的PEC系中差异表达的基因和在(A)高分级与低分级相比较和(B)晚期与早期前列腺癌相比较中差异表达的基因的热图[3]。左手侧的热图代表前列腺癌高分级和晚期标志，而右侧上的热图代表在四个前列腺癌细胞系中的至少一个中差异表达的基因。在每个个别前列腺癌细胞系内差异表达的这些基因的百分比连同与高分级和晚期表型的相似性程度的p值一起显示于各自的列中。
图7：在前列腺肿瘤中的c-Myc和Ha-Ras特异性癌基因标志在成纤维细胞中是保守的。
(A)和(B)的热图显示在癌基因诱导的前列腺癌细胞系与c-Myc和Ha-Ras转导的成纤维细胞（3T3细胞系）中差异表达的基因[46]。左手侧的热图代表转导的成纤维细胞基因标志，而右侧上的热图代表在四个前列腺癌细胞系中的至少一个中差异表达的基因。(C)的热图显示在c-Myc前列腺癌细胞系和各自的c-Myc诱导的小鼠乳房肿瘤样品中差异表达的基因的交叉[46]。左手侧的热图代表肿瘤样品基因标志，而右侧上的热图代表在前列腺癌细胞系中差异表达的基因。在每个前列腺细胞系热图下显示的p值代表在前列腺和乳房癌数据集之间的重叠的显著性。(D)关于PSA（橙色）和c-Myc标志（绿色）鉴定转移性疾病的效用的ROC曲线。x轴代表假阳性率（1-特异性）并且y轴代表真阳性率（灵敏度）。虚线代表无区别能力。(E)热图描述四个前列腺癌细胞系标志各自和MSKCC前列腺癌数据集中的样品之间的一致性。红色指出正皮尔森相关，而蓝色指出负皮尔森相关。
图8：癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联。
(A)在癌基因转移的前列腺癌细胞系中上调的人前列腺癌样品的表达概况[11]。沿着热图底部的条指出基于四个癌基因转化的细胞系各自中上调的基因，样品具有高（前第25百分位数）还是低表达（后第75百分位数）。显示了关于(B)c-Myc上调的基因、(C)NeuT上调的基因、(D)Ha-Ras上调的基因、(E)v-Src上调的基因的高和低表达群体的卡普兰迈耶曲线。
补充2：VWF染色。
(A)关于VWF作为新血管生成标记的PEC肿瘤的免疫组织化学(IHC)染色。关于每个细胞系的VWF的IHC代表性例子。(B)显示了关于四个癌基因诱导的小鼠前列腺肿瘤的相对血管集中性(concentration)。来自癌基因诱导的前列腺肿瘤的VWF染色的定量。数据是关于N>3个分离肿瘤的平均值±SEM。在NeuT组中，血管集中性更低并且Ha-Ras血管分布更大(p<0.01)。
补充3：用于制备癌基因转化的前列腺癌细胞系的方法：
(A)小鼠前列腺上皮细胞培养
用于原代培养的培养基包含F-12500ml、10%FBS、胰岛素5ug/ml、EGF10ng/ml、氢化可的松1ug/ml、转铁蛋白5ng/ml、牛垂体提取物30ug/ml、1X青霉素-链霉素和1X庆大霉素。取出源自12周龄FVB小鼠的小鼠前列腺，腹侧前列腺，在PBS中洗涤，并且前列腺组织使用剃须刀片在6cm板中剁碎几分钟。将剁碎的组织添加到0.5mg/ml胶原酶溶液中，并且将板置于37℃、5%CO2温箱中16小时。将消化的组织用PBS洗涤并且使用培养基重悬浮所得的细胞团块，并且随后种植到10cm细胞板中。
(B)用pBABE-IRES-cMyc、pBABE-IRES-NeuT、 pBABE-IRES-h-RAS、pBABE-IRES-vSrc质粒转化小鼠前列腺上皮细 胞
通过磷酸钙沉淀将pBABE-IRES-靶基因转染到293T细胞内。将DNA和CaCl2在HBS缓冲液中混合，并且将混合物补足到1ml的最终体积，允许所述混合物在室温下静置20分钟。随后将这种混合物混合到293T细胞内，并且将细胞放入温箱内5小时，随后去除温育培养基，并且替换为新鲜培养基。在48小时后，收集293T细胞的上清液，与相等体积的新鲜培养基混合，并且通过0.45um滤器过滤所得的混合物。随后将聚凝胺（最终浓度8ug/ml）添加到混合物内，随后将所述混合物添加到在传代一中的前列腺上皮细胞内。在感染另外48小时后，去除培养基且替换为新鲜培养基(DMEM,10%FBS)。
(C)选择的阳性克隆
向包含DMEM、10%FBS和1X青霉素-链霉素的培养基中添加嘌呤霉素，并且最终浓度补足为1～2ug/ml。细胞用嘌呤霉素重复处理至少1个月，直至阴性细胞死亡且剩下具有癌基因表达的阳性克隆时。当克隆足够大时，通过克隆环（特制培养基，目录#TR-1004）挑选克隆，并且适当标记细胞。细胞随后生长至少25次传代。在组织培养软琼脂中的生长测定、体内植入、转移、微阵列和组织病理学中表征。
图1示出癌基因转导的PEC系在软琼脂中形成集落。图1A示出被不同癌基因(c-Myc、NeuT、Ha-Ras、v-Src)转导的癌基因诱导的细胞系的相差显微镜检查。源自选择且表征的癌基因转导的PEC的个别集落照片。图1B示出通过细胞计数测定的PEC系的生长曲线。数据是N>3次分离实验的平均值±SEM。图1C和1D描述用如对于c-Myc、NeuT、Ha-Ras和v-Src检测显示的抗体，每个癌基因诱导的PEC的3个分离克隆的蛋白质印迹分析，并且图1D描述基底(CK5)与腔(CK8)前列腺癌相比较的标记。GDI用作蛋白质装载对照。图1E描述癌基因转导的PEC的软琼脂测定。未经转化的PEC未能在软琼脂中生长。来自癌基因转导的PEC系的集落大小（图1E）和数目（图1F）显示为N>5次分离实验的平均值±SEM。
图2描述通过阵列CGH评估的在四个癌基因细胞系中的拷贝数异常。图2A示出共享拷贝获得或丧失区的四个细胞系的百分比显示为基因组位置的函数。图2B示出关于四个细胞系各自的拷贝获得（红色）或丧失（蓝色）区显示为基因组位置的函数。在图2C中，鉴定在四个癌基因细胞系中具有mRNA过表达（红色）、DNA扩增（黄色）或两者（紫色）的癌基因，具有在MKSCC前列腺癌数据库中的相应扩增（在右手侧上列出）。在图2D中，鉴定在四个癌基因细胞系中具有mRNA表达不足（蓝色）、DNA拷贝丧失（粉色）或两者（橙色）的肿瘤抑制基因，具有在MKSCC前列腺癌数据库中的相应拷贝丧失（在右手侧上列出）。图3示出在免疫感受态小鼠中生长的前列腺上皮细胞系。
在图3A中，通过游标卡尺测量测定的PEC肿瘤直径显示为在FVB30小鼠中的接种后天数。关于N>5次分离实验的平均直径±SEM。图3B显示源自癌基因诱导系的代表性肿瘤照片。在细胞注射后15天时收获NeuT诱导的肿瘤。图3C显示在低和高放大率下的苏木精伊红染色（还参见补充数据1-4）。
图4显示癌基因转化的前列腺上皮细胞肿瘤转移至肺。图4A显示在肿瘤植入后的鼠肺的苏木精伊红染色证实肺转移的代表性例子。图4B显示在皮下注射后5周，对于c-Myc、NeuT和v-Src PEC组，在小鼠中检测肺转移的频率。比率在Ha-Ras和v-Src组中是100%频率。
图5显示微阵列基因表达的层次聚类。图5A显示四个不同的癌基因转化的细胞系的三个分离克隆的双向层次聚类概述。显示了与原代（未经转化的）PEC的比较。差异表达的基因在四个癌基因过表达的细胞系各自中组织成上和下调模式。对于总共N=30只小鼠，数据是N>3次分离实验的平均值±SEM。在四个癌基因转化的PEC系中差异表达的基因和在（图5B）高分级与低分级相比较和（图5C）晚期与早期前列腺癌相比较中差异表达的基因的热图(8)。左手侧的热图代表前列腺癌高分级和晚期标志，而右侧上的热图代表在四个前列腺癌细胞系中差异表达的基因。在每个个别前列腺癌细胞系内差异表达的这些基因的百分比连同与高分级和晚期表型的相似性程度的p值一起显示于各自的列中。
图6显示前列腺肿瘤中的c-Myc和Ha-Ras特异性癌基因标志在其他组织中是保守的。热图显示在癌基因诱导的前列腺癌细胞系与图6AHa-Ras和图6B c-Myc成纤维细胞（3T3细胞系）中差异表达的基因。在图6C中，热图显示在c-Myc前列腺癌细胞系和小鼠乳房肿瘤样品中差异表达的基因的交叉。在每个前列腺细胞系热图下显示的p值代表在前列腺和成纤维细胞/乳房肿瘤标志之间的重叠的显著性。图6D显示基于c-Myc标志的双复式分析的分类器区别在Lapointe2004数据集中的人肿瘤（红色）与正常组织（浅蓝色），连同x轴。对于E)Lapointe2004数据集和F)Taylor2010MSKCC数据集显示了关于分类器性能的ROC曲线，分别具有0.990和0.977的AUC值。
图7示出癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联。图7A显示在癌基因转移的前列腺癌细胞系中上调的人前列腺癌样品的表达概况(13)。沿着热图底部的条指出基于四个癌基因转化的细胞系各自中上调的基因，样品具有高（前第25百分位数）还是低表达（后第75百分位数）。显示了关于(图7B)c-Myc上调的基因的高和低表达群体的卡普兰迈耶曲线。
图8示出癌基因转化的前列腺癌细胞系与无复发存活的基因表达关联。
图9示出分化不良的前列腺腺癌的组织学特征。
图10A-10D示出Src增强同基因前列腺癌细胞系的3D基质胶侵入。同基因前列腺癌细胞系源自在编码癌基因NeuT、Ha-Ras或c-Src的逆转录病毒中的鼠上皮和前列腺上皮细胞转导。如图10A中所示，这些细胞表现出迁移到划痕内的能力，其中NeuT系表现出最快速的划痕关闭。同时图10A示出细胞迁移的划痕测定显示划痕，图10B示出关于N=3次分开实验的关闭定量。图10C示出在基质胶中使用前列腺癌细胞系的3-D侵入测定。图10D显示来自对于PEC系（PEC-NeuT、PEC-Ras和PEC-Src）的3次独立实验的平均侵入距离±SEM。如图10C和10D中所示，侵入到基质胶内对于c-Src转导的系更有效。所示结果的统计分析使用斯氏t检验进行。
图11A和11B证实同基因前列腺癌细胞系肿瘤是血管的。在图11A中，使用标准化的光子通量来定量肿瘤体积，对于3个系(PEC-NeuT、PEC-Ras和PEC-Src)各自在1x105细胞的皮下接种后经过3周定量在NCR裸鼠中的皮下肿瘤生长。显示了来自对于PEC系的3次独立实验的平均大小±SEM。与增强的Src激酶活性相关，该系作为NCR裸鼠中的皮下肿瘤生长；如通过光子通量测定的相对大小显示在Ras衍生的系中更快速的生长。数据的统计分析使用斯氏t检验进行。
在图11B中，关于血管性血友病因子(WF)的免疫组织化学染色显示具有Ras系的增强VWF染色的该系血管分布。换言之，Ras系增强的肿瘤生长速率与增加的血管生成相关，如通过增加的血管性血友病因子(VWF)染色证明的。
图12A-12E证实前列腺癌系发展转移。番茄红。对于每个细胞系，将细胞注射到16只小鼠的左心室内。在异种移植后14天获得且定量生物发光图像。代表性小鼠体内图像显示于图12A中。如所示的，在肿瘤经由心脏的左心室（I.C.注射）引入动脉循环内之后，肿瘤在注射两周内在多个器官中快速发展，所述器官包括肝、脑、膀胱、肾上腺和肾。
图12B显示在同基因前列腺癌系的心内注射后，在小鼠中的脑转移的代表性图像。
图12C显示作为具有肿瘤的小鼠比例的生物发光成像(BLI)的定量（平均值±SEM，n=6）。（统计比较使用斯氏t检验进行，伴随用于异质性的方差的Welch’s校正）
图12D显示对于同基因系各自作为转移性脑肿瘤负荷的量度的平均总质子通量（数据是平均值±SEM，n=5）。
图12E显示在PEC-Src和PEC-NeuT心内注射2周后形成的脑转移的H&E染色。此外，CK14染色确证在脑内前列腺上皮细胞的存在（箭头）。
光子发射证明在用Ras和Src前列腺癌细胞系注射的小鼠脑中的转移。对于用NeuT系注射的小鼠脑发生较不频繁的转移。在小鼠中的相对转移频率证实100%的Ha-Ras和Src系在小鼠中发展肿瘤，并且相对肿瘤负荷对于Ras是1x109，在c-Src中是5x108，对于NeuT具有1x104。如图3E中所示，用Ras或Src PEC系注射的小鼠的脑转移的组织学分析显示原发性组织学是腺癌。
图13A-13C证实前列腺肿瘤细胞系的肝转移。将表达Luc2-番茄红融合蛋白的同基因PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且定量体内生物发光信号。图12A示出具有肝肿瘤的小鼠百分比。用Ras和Src PEC系注射的小鼠中的肝脏转移发展肝转移（～100%的动物）。尽管NeuT肿瘤皮下生长，但无一发展肝转移。图12B示出通过光子通量测定的肿瘤大小，并且图13C示出显示肝转移的代表性小鼠图像。
在用Ras和Src衍生的系注射的小鼠中鉴定肾转移。图13D示出具有肾肿瘤的小鼠百分比。图13E示出通过光子通量的肾肿瘤大小，并且图13F示出肾转移的代表性图像。
图14A-14C证实同基因前列腺癌细胞系发展溶骨性骨转移。图14A示出FVB小鼠的代表性体内图像，所述FVB小鼠经历表达Luc2-番茄红融合蛋白的PEC系的心内注射，并且定量体内生物发光信号。
如图14A中所示，小鼠的骨转移在性质中是溶骨性的。图14B显示作为具有肿瘤的小鼠比例的BLI的定量（平均值±SEM，n=6）。如示出的，用c-Src肿瘤注射的100%小鼠发展骨转移，在Ha-Ras中65%，和在NeuT中15%。骨光子通量在c-Src肿瘤中急剧增强，其中总光子通量5x107与Ha-Ras1x106和NeuT1x104相比较。图14C示出在光子通量上的肿瘤团块大小。前列腺肿瘤的溶骨性骨病灶的组织学分析证明类似原发性肿瘤的腺癌。
图15A-15F证实Src增强溶骨性前列腺癌骨转移。在PEC-Src心内注射后2周，FVB小鼠发展溶骨性骨病灶。图15A显示与PEC-Ras和PEC-NeuT相比较，骨中的肿瘤面积在PEC-Src组中显著增加。与Ras驱动的肿瘤相比较，肿瘤面积在c-Src中是六倍大。
图15B示出在细胞的心内注射前(t0)和后14天(t14)的代表性X射线。低密度区与转移性肿瘤（箭头）共定位，指出溶骨性病灶。骨病灶主要在两周时作为溶骨性病灶在骺结处发现。
组织学分析证实在骨转移部位处的腺癌。图15C中所示的耐酒石酸盐酸性磷酸酶(“TRAP”)染色确证骨-肿瘤界面中成骨细胞（箭头）的存在。图15D显示骨转移形成后的苏木精伊红(“H&E”)染色。图15E和15F分别显示细胞角蛋白(CK)14染色和CK8染色，两者均确证在骨内上皮细胞的存在。
图16A-16G证实溶骨性前列腺癌细胞系表达功能CCL5和骨桥蛋白(“OPN”)受体。图16A-16D显示在PEC系上的CCR5表达的荧光激活细胞分选(“FACS”)分析。如所示的，使用CCR5特异性抗体的FACS分析证实在PEC系中CCR5受体的存在。
图16E和16F显示使用OPN作为CD44配体和CCL5作为CCR5配体进行的PEC-Src系的基质胶侵入测定结果，并且定量为平均值+SEM(图16G)。如图16D和16E中所示，OPN或CCR5的添加增强PEC侵入到基质胶内。对于与组织的比较，在癌基因转化的PEC中的体内肿瘤基因表达与具有相同品系的小鼠的背外侧腹侧前列腺中的体内表达相比较。图16F显示在组织培养中的前列腺肿瘤细胞系的趋化因子受体和配体基因表达。并且图16G显示在皮下植入后的前列腺肿瘤细胞系的趋化因子受体和配体基因表达。基因表达显示细胞因子和趋化因子的显著体内上调。具体地，在c-Myc、NeuT和Src PEC系中观察到CCR5和CCR2的上调。观察到受体配体CCL2、CCL7和CCL8的上调（2至3倍）。CCL7、CCL8和CCL5是关于CCR5的配体，CCL8和CCL5是关于CCR1的配体（图15H）。这些研究指出与以红色方块标记的组织培养物相比较，在体内的PEC肿瘤中的细胞因子受体和配体表达的诱导。
因此，当PEC系在体内与组织培养相比较生长时，基于微阵列的基因表达概况分析显示CCR5信号传导分子的激活。
CCL2结合CCR2和CCR4。考虑到在体内在PEC中诱导CCR5及其配体CCL5、CCL7和CCL8，检查CCR5拮抗剂对前列腺肿瘤生长的作用。
图17A-17D证实CCR5拮抗剂阻断脊柱溶骨性前列腺癌转移。将用表达Luc2-番茄红融合蛋白的载体转导的PEC系注射到FVB小鼠的心室内，并且在2周后定量体内生物发光信号。用口服马拉维若(8mg/kg)或对照处理小鼠。图17A示出来自每组小鼠的代表性例子。图17B示出作为总肿瘤团块的体积分析的光子通量，并且图17C示出小鼠中的下肢骨质量。显示的数据是关于每个组中的N=8只分离小鼠的平均值+SEM，P<0.05。
如图17A和17B中所示，CCR5拮抗剂马拉维若(8mg/kg口服)使全身转移负荷减少>50%，并且使骨转移减少>50%（参见图17C和17D）。进一步地，与X射线分析关联的氟-18，氟化钠(“F-18-NaF”)成像证实脊柱转移的存在（图18A-18H）。用马拉维若的每日口服处理使脊柱转移减少>90%（图19A和19B）。
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Claims (31)

1.一种包含原代哺乳动物上皮细胞中的至少一种或一组的哺乳动物前列腺癌细胞系，所述细胞已感染携带癌基因的逆转录病毒载体，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合，并且在所述细胞中表达所述基因。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物前列腺癌细胞系，其中所述原代哺乳动物上皮细胞包括原代鼠上皮细胞。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的哺乳动物前列腺癌细胞系，其中所述原代哺乳动物上皮细胞源自一个免疫感受态小鼠或多个免疫感受态小鼠。
4.一种人前列腺癌的动物模型，所述动物模型包括植入根据权利要求1-3中任一项所述的哺乳动物前列腺癌细胞系的免疫感受态非人哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物选自啮齿类动物例如大鼠、豚鼠和小鼠；和农场动物例如猪、绵羊、山羊、马和牛。
6.根据权利要求4所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物是啮齿类动物。
7.根据权利要求4和5中任一项所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物是小鼠。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的动物模型，其中所述非人哺乳动物是FVB/N小鼠。
9.一种发展前列腺肿瘤的免疫感受态转基因小鼠，其中所述前列腺肿瘤产生一组癌基因中的一种或多种特有的分子遗传标志，所述癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
10.一种用于体外生产根据权利要求1-3中任一项所述的永生化原代哺乳动物上皮细胞的方法，所述方法包括用逆转录病毒载体感染原代哺乳动物上皮细胞，所述逆转录病毒载体携带选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的癌基因，以提供受感染细胞，其中所述原代哺乳动物上皮细胞能够被所述逆转录病毒载体和在这样的条件下感染，由此在所述受感染细胞中表达c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
11.一种用于诊断受试者中的前列腺癌的方法，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中，所述方法包括：
(a)提供来自受试者的生物学测试样品，所述受试者患有前列腺癌或怀疑具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中；
(b)基于得自所述受试者的生物学测试样品中的基因表达模式，测定至少一种生物标记的水平，其中所述基因表达模式与选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一种或多种癌基因的组相关；
(c)比较所述生物学测试样品中的所述至少一种生物标记的水平与对照样品中的所述生物标记的水平，
其中相对于所述对照样品中的所述生物标记的水平，所述测试样品中的所述生物标记的水平升高是所述受试者中的前列腺癌存在的诊断指示物。
12.根据权利要求11所述的用于诊断前列腺癌的方法，其中遗传材料源自所述前列腺癌或与前列腺有关的生物流体，包括前列腺、尿和血液。
13.一种将前列腺癌/肿瘤分类成不同前列腺癌亚类的方法，所述前列腺癌亚类具有选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合的一种或多种癌基因的组特有的基因表达模式，所述方法包括：
(a)提供前列腺癌/肿瘤样品；
(b)检测源自所述样品中的所述一种或多种癌基因的组的基因表达模式或活性的分子遗传标记；和
(c)基于所述检测步骤(b)的结果，将所述前列腺肿瘤分类为属于癌症/肿瘤亚类。
14.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述步骤(c)的分类步骤包括使所述样品中的分子遗传标记与所述前列腺癌的组织病理学分级关联。
15.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述c-Myc癌基因特有的基因表达模式。
16.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述Ha-Ras癌基因特有的基因表达模式。
17.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述NeuT癌基因特有的基因表达模式。
18.根据权利要求13所述的分类前列腺癌/肿瘤的方法，其中所述前列腺癌亚类具有所述c-Src癌基因特有的基因表达模式。
19.一种将具有前列腺肿瘤的受试者分层用于临床试验的方法，所述方法包括：
(a)提供源自具有前列腺肿瘤的受试者的样品；
(b)检测源自所述样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和
(c)基于所述检测步骤(b)的结果，将所述受试者分层用于临床试验。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述(c)中的分层步骤在比较所述(b)中的检测步骤的结果与得自对照样品的结果后进行。
21.一种选择用于具有前列腺癌/肿瘤的受试者的治疗的方法，所述方法包括：
(a)提供源自具有前列腺癌/肿瘤的受试者的样品；
(b)检测源自所述样品中的一组基因中的一种或多种的基因表达模式或活性的分子遗传标志，其中所述基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合；和
(c)基于所述检测步骤(b)的结果选择治疗。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述(c)中的选择步骤在比较所述(b)中的检测步骤的结果与得自对照样品的结果后进行。
23.一种通过用一种或多种外源癌基因转化细胞产生的非天然存在的细胞，允许所述细胞分裂至少一次，其中所述细胞是被含有所述外源癌基因的载体转化的人细胞，其中所述一种或多种外源癌基因选自c-Myc、Ha-Ras、NeuT、c-Src及其组合。
24.根据权利要求23所述的非天然存在的细胞，其中所述细胞是原代哺乳动物上皮细胞。
25.一种用于选择用于具有癌症的受试者的治疗的方法，所述方法包括：
(a)在得自需要治疗癌症的受试者的样品中，测定编码本文描述的基因标志或其修饰物的核酸的表达水平；和
(b)基于所测定的基因标志选择用于所述受试者的治疗，其中所述基因标志源自选自c-Myc、Ras、ErbB2和Src的癌基因。
26.一种测定具有前列腺癌的人受试者是否患有转移或处于发展转移的危险中的方法，所述方法包括：
(a)从具有前列腺癌或处于发展前列腺癌的危险中的人受试者获得生物样品；和
(b)测定所述样品中CCR5的表达水平和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种的表达水平，其中所述样品中的CCR5和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种的表达水平如果高于对照表达水平，则指示所述人受试者可能患有转移或处于发展转移的危险中。
27.一种在处于发展癌症或癌症转移的危险中的受试者中预防癌症或抑制对治疗敏感的癌症转移的方法，所述方法包括给有此需要的所述受试者施用CCR5拮抗剂。
28.根据权利要求28所述的方法，其中所述CCR5拮抗剂是马拉维若或维立韦罗。
29.根据权利要求27或28中任一项所述的方法，其中所述CCR5拮抗剂抑制选自下述的一种或多种器官中的肿瘤转移：肝、脑、膀胱、肺、肾上腺、肾、骨及其组合。
30.一种鉴定选择性干扰癌细胞的增殖或活力的候选化合物的方法，所述癌细胞具有升高水平的CCR5和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种，所述方法包括：
使候选化合物与具有升高水平的CCR5和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种的癌细胞接触，和
如果与不具有升高水平的CCR5和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种的对照细胞相比较，具有升高水平的CCR5和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种的所述癌细胞的增殖或活力降低，则
将所述候选化合物鉴定为干扰具有升高水平的CCR5和/或其配体（例如CCL5、CCL8、CCL7）中的至少一种的所述癌细胞增殖或活力的化合物。
31.一种用于下调一种或多种前列腺癌细胞系的组中的CCR5表达的体内方法，所述前列腺癌细胞系源自在编码选自NeuT、Ha-Ras、c-Src及其组合的至少一种癌基因的逆转录病毒中的鼠上皮和前列腺上皮细胞转导，所述方法包括：
(a)给根据权利要求4-8中任一项所述的动物模型施用候选化合物；
(b)和测量所述动物模型中的CCR5RNA或蛋白质表达水平，其中所述动物模型中的所述CCR5表达水平低于未用所述候选化合物处理的对照动物模型中的所述CCR5表达水平。
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