CN104163877A - 硫酸软骨素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了硫酸软骨素的制备方法，包括：（1）水煮；（2）蒸煮；（3）酶解；（4）树脂吸附；（5）酒精沉淀；（6）脱色；（7）除杂；（8）酒精沉淀；（9）脱水烘干。本发明应用在酸性亚硝酸钠条件下，硫酸软骨素中杂质反应成溶解性好的物质通过醇沉除去，产品溶液澄清度及色泽满足注射剂要求，条件温和可控，生产过操作简单，适合规模化生产，产品质量稳定，硫酸软骨素回收率达到80%以上。

Description

硫酸软骨素的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种硫酸软骨素的制备方法。
背景技术
硫酸软骨素，英文名chondroitin sulfate，是以动物（猪、牛、马、羊、鸡、鲨鱼等）的软骨为原料的一种高分子酸性粘多糖，其分子结构为β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖通过β1→3糖苷键形成的重复二糖单位所组成的多糖链。它是一种白色或微黄色粉末，吸水性强，易溶于水而成粘稠液体，不溶于酒精、丙酮、乙醚和氯仿等有机溶剂。其盐类对热较稳定。大量研究表明，硫酸软骨素具有降血脂、抗动脉粥样硬化和抗病毒性肝炎等活性，临床中已用于防治关节炎、肾炎、神经痛、偏头痛等。作为一类重要的生物高分子，硫酸软骨素具有广泛的生物活性，作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。由于不同生物或者相同生物的不同组织所含硫酸软骨素的种类和量均不同，使其结构与活性复杂多样。作为成品的硫酸软骨素应尽可能的去除杂质，特别是影响产品溶液澄清度的杂质。
目前，硫酸软骨素通常提取纯化方法是采用酶解法、树脂吸附法以及醇沉法，主要包括以下步骤：
1）碱提、酶解：原料（软骨）加水浸没，用氢氧化钠调PH8.5，升温至55-60℃，保温4-6小时，然后加入2%的碱性蛋白酶，保持PH8.5，保温55-60℃搅拌6-8小时，升温至沸腾15分钟左右，过滤，得滤液；
2）树脂吸附：滤液经201型阴离子树脂吸附，洗脱，收集洗脱液；
3）酒精沉淀：洗脱液中按体积的2.5倍加入95%酒精，静止8小时，取沉淀；
4）脱色：按沉淀：水的重量比为1：20的比例混合水，同时加入3%重量的氯化钠，调PH9-12，加入2-4%重量双氧水，6-12小时，过滤，取滤液；
5）酒精沉淀、干燥：滤液调PH6，加入体积的1-2.5倍量酒精第二次沉淀，沉淀再用95%酒精脱水两次，干燥粉碎得到硫酸软骨素成品。
硫酸软骨素生产过程中主要应用酶解、树脂吸附、醇沉、氧化脱色方法将硫酸软骨素纯化，在此过程中仍然有部分原辅料带入的有机杂质不能够完全去除，影响产品溶液澄清度以及色泽。 
发明内容
本发明的目的在于：提供一种硫酸软骨素的制备方法，有效提高产品溶液澄清度以及色泽，操作过程简单，条件容易控制，适合连续规模化生产。
本发明的技术解决方案是该硫酸软骨素的制备方法包括下列步骤：
（1）水煮：软骨原料加水浸没，升温至80-100℃，煮12-24小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；
（2）蒸煮：将步骤（1）得到的水煮软骨放入釜中，100℃蒸4小时以上，上层油脂收集；
（3）酶解：将步骤（2）得到的软化软骨加水浸没，按水体积的3%加氯化钠，用碱调PH至8-9，升温至55-60℃，再加入水重量0.4%（w/w）2079碱性蛋白酶，保持PH8-9，保温55-60℃搅拌4-6小时，升温至沸腾12-18分钟，过滤； 
（4）树脂吸附：201阴离子树脂吸附，洗脱，收集洗脱液；
（5）酒精沉淀：将步骤（4）得到的洗脱液调PH6-7，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（6）脱色：将步骤（5）得到的沉淀物用水溶解，升温至40-60℃，调PH至8-9，加入水体积的1-3%双氧水；
（7）除杂：将步骤（6）的脱色溶液降温至0-30℃，用盐酸调PH1-4，加入脱色溶液体积的0.5-3%亚硝酸钠，搅拌1-3小时；
（8）酒精沉淀：将步骤（7）得到的除杂溶液调PH6-7，加其体积5%的氯化钠，过滤，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（9）脱水烘干：步骤（8）沉淀结束后弃去上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品。
本发明的效果是：1、应用酸性条件下亚硝酸钠与硫酸软骨素中杂质反应生成水溶性更好的物质，而硫酸软骨素基本结构保持完整；2、硫酸软骨素中杂质容易去除，生产过操作简单，适合规模化生产，效率高，产品质量稳定，产品完全符合注射剂澄清度要求。
具体实施方式
    下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
实施例1：依以下步骤生产精品硫酸软骨素
（1）水煮：100公斤软骨原料加水浸没，升温至80℃，煮24小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；
（2）蒸煮：将步骤（1）得到的水煮软骨放入釜中，100℃蒸4小时以上，上层油脂收集；
（3）酶解：将步骤（2）得到的软化软骨加100升水浸没，加3公斤氯化钠，用碱调PH至8，升温至55℃，再加入0.4公斤的2079碱性蛋白酶，保持PH8，保温55℃搅拌6小时，升温至沸腾12分钟，过滤； 
（4）树脂吸附：80升201阴离子树脂吸附，洗脱，收集洗脱液；
（5）酒精沉淀：将步骤（4）得到的洗脱液调PH6，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（6）脱色：将步骤（5）得到的沉淀物用20升水溶解，升温至40℃，调PH至8，加入200毫升双氧水；
（7）除杂：将步骤（6）的脱色溶液降温至0℃，用盐酸调PH1，加入100克？亚硝酸钠，搅拌4小时；
（8）酒精沉淀：将步骤（7）得到的除杂溶液调PH6，加1公斤？的氯化钠，过滤，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（9）脱水烘干：步骤（8）沉淀结束后弃去上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品8.6公斤。
实施例2：依以下步骤生产精品硫酸软骨素
（1）水煮：100公斤软骨原料加水浸没，升温至90℃，煮18小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；
（2）蒸煮：将步骤（1）得到的水煮软骨放入釜中，100℃蒸4小时以上，上层油脂收集；
（3）酶解：将步骤（2）得到的软化软骨加100升水浸没，加3公斤氯化钠，用碱调PH至8.5，升温至57.5℃，再加0.4公斤2079碱性蛋白酶，保持PH8.5，保温57.5℃搅拌5小时，升温至沸腾15分钟，过滤； 
（4）树脂吸附：80升201阴离子树脂吸附，洗脱，收集洗脱液；
（5）酒精沉淀：将步骤（4）得到的洗脱液调PH6.5，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（6）脱色：将步骤（5）得到的沉淀物用20升水溶解，升温至50℃，调PH至8.5，加入400毫升双氧水；
（7）除杂：将步骤（6）的脱色溶液降温至15℃，用盐酸调PH2.5，加入250克亚硝酸钠，搅拌2小时；
（8）酒精沉淀：将步骤（7）得到的除杂溶液调PH6.5，加1公斤氯化钠，过滤，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（9）脱水烘干：步骤（8）沉淀结束后弃去上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品8.2公斤。
实施例3：依以下步骤生产精品硫酸软骨素
（1）水煮：100公斤软骨原料加水浸没，升温至100℃，煮12小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；
（2）蒸煮：将步骤（1）得到的水煮软骨放入釜中，100℃蒸4小时以上，上层油脂收集；
（3）酶解：将步骤（2）得到的软化软骨加100升水浸没，加3公斤氯化钠，用碱调PH至9，升温至60℃，再加入400克2079碱性蛋白酶，保持PH9，保温60℃搅拌4小时，升温至沸腾18分钟，过滤； 
（4）树脂吸附：80升201阴离子树脂吸附，洗脱，收集洗脱液；
（5）酒精沉淀：将步骤（4）得到的洗脱液调PH7，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（6）脱色：将步骤（5）得到的沉淀物用20升水溶解，升温至60℃，调PH至9，加入600毫升双氧水；
（7）除杂：将步骤（6）的脱色溶液降温至30℃，用盐酸调PH4，加入600克亚硝酸钠，搅拌1小时；
（8）酒精沉淀：将步骤（7）得到的除杂溶液调PH7，加1公斤氯化钠，过滤，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（9）脱水烘干：步骤（8）沉淀结束后弃去上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品8.5公斤。

Claims (1)

1.硫酸软骨素的制备方法，其特征是该硫酸软骨素的制备方法包括下列步骤：
（1）水煮：软骨原料加水浸没，升温至80-100℃，煮12-24小时，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，捞出软骨；
（2）蒸煮：将步骤（1）得到的水煮软骨放入釜中，100℃蒸4小时以上，上层油脂收集；
（3）酶解：将步骤（2）得到的软化软骨加水浸没，按水体积的3%加氯化钠，用碱调PH至8-9，升温至55-60℃，再加入水重量0.4%（w/w）2079碱性蛋白酶，保持PH8-9，保温55-60℃搅拌4-6小时，升温至沸腾12-18分钟，过滤； 
（4）树脂吸附：201阴离子树脂吸附，洗脱，收集洗脱液；
（5）酒精沉淀：将步骤（4）得到的洗脱液调PH6-7，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（6）脱色：将步骤（5）得到的沉淀物用水溶解，升温至40-60℃，调PH至8-9，加入水体积的1-3%双氧水；
（7）除杂：将步骤（6）的脱色溶液降温至0-30℃，用盐酸调PH1-4，加脱色溶液体积0.5-3%亚硝酸钠，搅拌1-3小时；
（8）酒精沉淀：将步骤（7）得到的除杂溶液调PH6-7，加其体积5%的氯化钠，过滤，再加入酒精使溶液酒精质量浓度达到60%，沉淀16小时以上；
（9）脱水烘干：步骤（8）沉淀结束后弃去上层酒精，收集沉淀，脱水干燥，得硫酸软骨素成品。
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