CN104152539A - 利用dfna5基因调控区两个甲基化位点作为乳腺癌早期分子筛查的标记物 - Google Patents

利用dfna5基因调控区两个甲基化位点作为乳腺癌早期分子筛查的标记物 Download PDF

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    • C12Q2600/154—Methylation markers

Abstract

本发明提供了一种利用DFNA5基因调控区两个甲基化位点作为乳腺癌早期分子筛查的方法。在我们对两个乳腺癌细胞系的甲基化芯片数据分析过程中，我们发现DFNA5基因调控区中两个CpG的甲基化明显低于其它基因，我们推测该基因的去甲基化是乳腺癌发病的一个重要特征，这两个甲基化位点可用于乳腺癌早期筛查的一个标记。本发明有可能成为廉价乳腺癌早期分子筛查的标记物。

Description

利用DFNA5基因调控区两个甲基化位点作为乳腺癌早期分子筛查的标记物
所属技术领域
本发明涉及一种乳腺癌早期分子筛查的标记物。DFNA5基因调控区两个甲基化位点可用于乳腺癌早期筛查的一个预警标记。 
背景技术
乳腺癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤，定期的乳腺X线检查可以降低40岁以上妇女乳腺癌的死亡率，因此是迄今为止唯一证实有效的乳腺普查措施。尽管乳腺X线检查在乳腺癌的早期发现中具有较高的应用价值，但它可能存在漏诊，而且在判断异常病灶的良恶性方面的应用价值也十分有限，目前对于乳腺X线普查间歇期内发生乳腺癌是漏诊还是新发生的病例尚无有效的区分方法。所以，一种简单、迅速、廉价的乳腺癌早期筛查方法将会为中国数以亿计的妇女造福。 
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase，Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2-7％。一般说来，DNA的甲基化会抑制基因的表达。甲基化的模式是当前研究的重要课题。在正常组织内，基因的甲基化主要分布在缺少CpG位点的编码区。 
肿瘤的特征是不平衡的甲基化。在肿瘤中，伴随基因组的低甲基化是区域性的高甲基化，及DNA甲基化转移酶的基因表现上升。有证据显示基因组的低甲基化可以导致染色体的不稳定及增加突变机会，在细胞中的整体甲基化状态可能是引发癌症的促进因素。某些基因的甲基化状态会是肿瘤生成的生物标志，比如说，谷胱甘肽S转移酶Pi基因的甲基化已被建议作为前列腺癌的诊断指标。环境因素(厨房油烟，汽车尾气等)会改变表观遗传形状(CpG甲基化或去甲基化)，造成基因不正常的表达或沉默。普遍认为，这种变化可能与癌症的起因有直接的关系。 
我们认为，DFNA5基因调控区CpG的甲基化程度与乳腺癌的发病有直接关系，可能成为早期乳腺癌分子筛查的分子标记物。 
发明内容
本发明利用Illumina芯片对人全基因组27332个CpG位点的甲基化状况进行探测，用两个乳腺癌细胞系进行扫描得出结果。如下表所示，数据显示DFNA5基因调控区CpG的甲基化程度明显低于其它基因调控区的CpG岛。我们认为，这种低甲基化与乳腺癌细胞的快速生长有密切关系。因此，我们可能通过检测此CpG岛的甲基化程度，预警乳腺癌的发病。 
本发明所述两个甲基化位点在人基因组的位置(DNFA5基因Exon1在人第七染色体上的位置)如下： 
DNFA5Exon1(Chromosome7)： 
Start position24，763，851 
End position24，764，165 
cg24805239： 
CpG position24，764，011 
SourceSeq： 
CGGTTCAACCAGGAAAGTCCAAGGCCTGTCCAGCCTGTGGGAGCCCCTAA 
cg04770504： 
CpG position24,763,888 
SourceSeq： 
TCGGGACTCACCCGGGAGATGTCGGGGCCTCTCGGGAAGAGTGGGCTGCG 
具体实施方式
DNA甲基化：是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的表观遗传修饰，常见于基因的5′-CG-3′序列，它在人的正常发育、X染色体失活、衰老、肿瘤及许多疾病过程中发挥重要作用。 
Infinium Methylation Assay：利用重亚硫酸盐转化胞嘧啶→尿嘧啶原理检测gDNA是否被甲基化。重亚硫酸盐作用于gDNA后，gDNA中未被甲基化的胞嘧啶将转变为尿嘧啶，而已经甲基化的胞嘧啶仍然保持原样。Infinium Methylation Assay设计的两条位点特异性探针，一条与甲基化的位点配对，一条与未甲基化的位点配对，配对后的探针单碱基延伸，随后荧光试剂染色，gDNA甲基化程度就可以通过捕捉到的荧光信号来判断。 
Day1： 
Start Bisulfite Conversion 
事先准备工作： 
750μl超纯水，210μl M-Dilution Buffer加入装有CT conversion reagent粉末的棕色EP管，旋涡振荡混匀10min。 
Notice：(1)每管CT conversion reagent可以做10个DNA sample； 
(2)CT conversion reagent需要避光放置，未用完的CT conversion reagent放置于-20℃最长一个月时间，以后拿出来使用时必须先37℃预热后再混匀使用。 
2、24ml的无水乙醇加入6ml的M-Wash Buffer混匀。 
3、PCR管、EP管若干。 
4、DNA sample(bisulfite conversion需要DNA sample有500ng的量)。 
实验开始： 
准备10个PCR管并编号，每管的反应终体积用50μl，其中M-Dilution Buffer5μl，DNA sample(500ng)按照浓度换算体积，余下体积用超纯水补足。： 
混匀混合液并离心，防止少量液体吸附在管壁上。 
37℃培养15min。 
每管加入100μl CT conversion reagent，混匀混合液并离心。 
(95℃30sec，50℃60min)*16cycles，4℃over。 
Notice：此步做完后的样品必须在4℃培养10min后才能进行后续步骤。 
Day2： 
Step1：接Day1的后续步骤(用Zymo EZ DNA Methylation Kit做) 
事先准备工作： 
解冻M-Binding Buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer、M-Elution Buffer至室温并混匀。 
实验开始： 
1、400μl M-Binding Buffer加入至Zymo收集管(收集管上放有吸附柱)。 
2、样品加入至(1)的收集管中，上下颠倒混匀。 
3、＞10000rpm30sec4℃离心，弃去废液。 
4、100μl M-Wash Buffer加入至吸附柱中，＞10000rpm30sec4℃离心。 
5、200μl M-Desulphonation Buffer加入至吸附柱中，室温(20℃-30℃)培养15-20min。 
6、＞10000rpm30sec4℃离心，倒掉废液。 
7、200μl M-Wash Buffer加入至吸附柱中，＞10000rpm30sec4℃离心；再加200μl M-Wash Buffer至吸附柱中，＞10000rpm30sec4℃离心。 
8、吸附柱放置于1.5ml EP管中，加入10μl M-Elution Buffer，＞10000rpm30sec4℃离心，得到bisulfite conversion后的DNA。 
Notice：此步做完后的DNA样品需要测定浓度以保证后续实验的可靠性。 
Step2：Make MSA2 
事先准备工作： 
1、将hybridization oven调至37℃处于稳定状态。 
2、将MSA2标签纸贴在MIDI板上(0.8ml深度的96孔板)。 
3、解冻MA1、MA2、MSM至室温并混匀。 
4、配制0.1N NaOH100ml(称取质量0.4g)。 
实验开始： 
1、20μlMA1加入MSA2板各孔。 
2、4μl step1得到的DNA sample加入MSA2板。 
3、4μl0.1NNaOH加入MSA2板。 
4、MSA2板用96孔cap mat密封。 
5、vortex1600rpm1min。 
6、280*g1min4℃离心。 
7、室温培养10min。 
8、68μl MA2加入MSA2板各孔。 
9、75μl MSM加入MSA2板各孔。 
10、MSA2板用96孔cap mat密封。 
11、MSA2板上下颠倒10次混匀。 
12、280*g1min4℃离心。 
13、hybridization oven37℃培养20-24hours。 
Notice：涉及到芯片操作过程的仪器都要用alconox清洗。 
Day3： 
Step1：Fragment MSA2 
事先准备工作： 
1、预热MIDI plate heat block至37℃处于稳定状态。 
2、解冻FMS至室温并混匀。 
实验开始： 
1、MSA2板从hybridization oven拿出后50*g1min离心。 
2、50μl FMS加入MSA2板各孔。 
3、MSA2板用96孔cap mat密封。 
4、vortex1600rpm 1min。 
5、50*g1min22℃离心。 
6、MSA2板放置在heat block上1h。 
Notice：如果暂时不进行后续步骤，可将封口后的MSA2板保存在-20℃。 
Step2：Precip MSA2 
事先准备工作： 
1、预热MIDI plate heat block至37℃处于稳定状态。 
2、解冻PM1至室温并混匀。 
3、打开离心机并调至4℃。 
4、打开heat sealer预热20min。 
实验开始： 
1、100μl PM1加入MSA2板各孔，cap mat密封。 
2、vortex1600rpm 1min。 
3、37℃培养5min。 
4、50*g1min22℃离心。 
5、300μl100％异丙醇加入MSA2板各孔，新的cap mat密封，上下颠倒10次混匀。 
6、4℃培养30min。 
7、3000*g20min4℃离心。 
8、离心后，迅速的把MSA2板倒扣于吸水纸上(防止蓝色沉淀物重新成为悬浮液)，弃去上清，轻拍MSA2板底，确保弃去所有液体。 
9、将MSA2板倒扣于tube rack上室温放置1h以干燥蓝色沉淀物。 
Notice：如果暂时不进行后续步骤，可将封口后的MSA2板保存在-20℃。 
Step3：Resuspend MSA2 
事先准备工作： 
1、预热hybridization oven至48℃处于稳定状态。 
2、解冻RA1至室温并混匀。 
3、打开heat sealer预热20min。 
实验开始： 
1、42μl RA1加入MSA2板各孔。 
2、热封膜盖在MSA2板上，heat sealer用劲向下压5sec封口。 
3、封口后的MSA2板放置于hybridization oven中48℃培养1h。 
4、vortex1800rpm1min。 
5、280*g1min离心。 
Notice：如果暂时不进行后续步骤，可将封口后的MSA2板保存在-20℃。 
Step4：Hyb Multi Beadchip 
事先准备工作： 
1、预热MIDI plate heat block至95℃处于稳定状态。 
2、预热hybridization oven至48℃处于稳定状态，rocker speed5。 
3、解冻PB2至室温并混匀。 
4、准备好beadchips、hyb chambers、hyb chamber gaskets、hyb chamber inserts。 
实验开始： 
准备hyb chamber： 
1、将hyb chamber gasket放入hyb chamber下托盘(下托盘上刻有illumina条纹的一侧靠向自己)。 
2、hyb chamber的8个凹槽中加入200μl PB2(保证后续Hyb Multi Beadchip的环境湿度)。 
3、盖上hyb chamber上盖(对角扣上)，室温放置于工作台。 
4、beadchip从冰箱中拿出来室温放置先不打开。 
Hyb Multi Beadchip： 
MSA2板置于heat block上95℃20min，后室温冷却30min。 
280*g1min离心。 
拆掉beadchip包装，将beadchip放在hyb chamber insert上，hyb chamber insert放在hyb chamber上。 
往Beadchip12个槽中依次加入12μl DNA sample(缓慢加样，不要产生气泡，确保样品完全渗透beadchip的每个槽内)。 
盖上hyb chamber上盖，对角扣上clamp。 
hyb chamber放置于hybridization oven中(illumina logo朝向自己)48℃培养16-24h(如果有multiple hyb chamber可将它们叠放，最多4块)。 
Notice：当天工作完成后，需要为第二天配制如下溶液： 
将330ml100％EtOH加入到XC4中，用力摇15sec后室温放置过夜。 
配制10ml95％formamide/1mM EDTA(9.5ml formamide+0.0029g EDTA+超纯水补足) 
Day4： 
Step1：Wash BC2 
事先准备工作： 
1、解冻WB1至室温并混匀。 
2、往wash dish(玻璃制的槽)中倒入200ml WB1，贴标签注明。 
3、往wash dish(玻璃制的槽)中倒入200ml PB1，贴标签注明。 
4、往Beadchip Alignment Fixture中倒入150ml PB1。 
5、准备好plastic spacer。 
6、glass back plate在使用前用稀释了10倍的漂白剂泡一小时后再清洗。 
实验开始： 
1、hyb chamber从hybridization oven拿出后室温放置25min。 
2、beadchip从chamber中拿出(配合镊子和刀，手不要碰到beadchip的表面和边缘，捏住条形码部分)后放到wash rack上(与wash dish配套)，浸没于WB1中。 
3、将wash rack重复拎起、浸没动作1min。 
4、wash rack移至PB1，完全浸没，重复拎起、浸没动作1min。 
Step2： 
Assemble Flow-Through Chamber： 
1、black frame放在Beadchip Alignment Fixture的一个槽中，beadchip放在black frame上，spacer放在beadchip上，Alignment Bar横向卡住Alignment Fixture。 
2、70％乙醇擦拭glass back plate后将其放置于spacer上，凹槽向内。 
3、两个金属夹子固定chamber，剪刀修剪spacer多余的部分。 
Step3：XStain BC2 
事先准备工作： 
1、水浴调至44℃(水浴连着chamber rack，chamber rack外接temperature probe，确保温度44℃处于稳定状态)。 
2、搬起chamber rack翻转赶走其中的气泡。 
3、解冻RA1、XC1、XC2、TEM、XC3、STM、ATM、PB1、XC4、EtOH、95％formamide/1Mm EDTA至室温并混匀。 
Single-Base Extension： 
1、待chamber rack稳定达到44℃，迅速将组装后的beadchip移至chamber rack。 
2、按照如下步骤依次加入试剂： 
a、150μl RA130sec，重复5次； 
b、450μl XC110min； 
c、450μl XC210min； 
d、200μl TEM15min； 
e、450μl95％formamide/1Mm EDTA 1min，重复1次； 
f、培养5min(也就是这次用6min)； 
g、上步快要结束的时候将温度调至32℃(按照STM包装要求)； 
h、450μlXC31min，重复1次。 
3、直到chamber rack稳定达到32℃，才可以进行后续染色。 
Stain Beadchip： 
1、如果随后就image beadchip，现在就需要打开beadarray reader。 
2、按照如下步骤依次加入试剂： 
a、250μl STM10min； 
b、450μl XC31min，重复1次，然后培养5min； 
c、250μl ATM10min； 
d、450l XC31min，重复1次，然后培养5min； 
e、250μl STM10min； 
f、450μl XC31min，重复1次，然后培养5min； 
g、250μl ATM10min； 
h、450μl XC31min，重复1次，然后培养5min； 
i、250μl STM10min； 
j、450μl XC31min，重复1次，然后培养5min。 
3、培养5min。 
4、chamber移至室温放置。 
Wash and Coat： 
1、往wash dish(白色塑胶框)中倒入310mlPB1。 
2、将staining rack放到PB1中。 
3、利用剪刀和镊子等工具卸下assemble装置，迅速的将beadchip放置在staining rack上(beadchip背对自己)浸没于PB1中。 
4、将staining rack重复拎起、浸没动作10次。 
5、staining rack浸没于PB15min。 
6、往wash dish(白色塑胶框)中倒入310ml XC4(放置时间不要超过10min)。 
7、将staining rack放到XC4中，重复拎起、浸没动作10次。 
8、staining rack浸没于XC45min。 
9、staining rack从溶液中提出，beadchip正面朝上搁在tube rack上晾干。 
10、beadchip放在真空泵中抽干50min(508mm Hg0.68bar)。 
11、beadchip背面用kimwipes沾湿70％EtOH擦拭以保证底部足够平整。 
12、扫描后的beadchip放在slide storage box中避光室温保存。 

Claims (3)

1.DFNA5基因调控区CpG的甲基化水平作为乳腺癌早期分子筛查的标记。
2.DFNA5基因调控区CpG的甲基化水平作为癌症早期分子筛查的标记物。
3.文献中，DFNA5基因也被认为与耳聋有关，因此，DFNA5基因调控区CpG的甲基化程度，也可能用作耳聋筛查。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107400704A (zh) * 2016-05-20 2017-11-28 博尔诚（北京）科技有限公司 一种用于乳腺癌筛查的组合物及其应用
WO2020178315A1 (en) * 2019-03-04 2020-09-10 Universiteit Antwerpen Methylation status of gasdermin e gene as cancer biomarker

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