CN104152479A - 猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体及其构建和表达方法，所述的共表达载体基于分子克隆技术将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白(E2c)和非结构蛋白(NS2-3c)及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白(E2b)和非结构蛋白(NS2-3b)的编码基因分别与双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1连接。本发明的共表达载体能够同时表达猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白，可用于制备多价亚单位疫苗、防控猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体，属于生物基因工程领域。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，临床上以发病急、高热稽留、全身泛发性点状出血和脾梗死为主要特征，给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，其流行趋势发生了很大的变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，以及猪瘟疫苗免疫失败的现象。牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)与猪瘟病毒同属黄病毒科、瘟病毒属成员。BVDV不仅感染牛，而且能感染猪、绵羊、山羊及野生动物，很多国家地区的研究证实了BVDV在猪群中存在不同程度的感染。猪感染BVDV可出现类似猪瘟的临床症状和病理变化，导致繁殖障碍、产仔数下降和流产。此外，先天性感染的仔猪出生后还可能形成持续感染和免疫耐受，并长期带毒。
目前，世界各国主要推广使用的猪瘟疫苗为弱毒疫苗，这种疫苗存在安全性不高，无法区分野毒感染和免疫接种，以及弱毒疫苗返强等缺陷。当前控制BVDV感染的手段为传统的灭活疫苗和基因修饰弱毒疫苗接种，但灭活疫苗只能起到部分保护，而BVDV基因修饰弱毒疫苗会抑制机体淋巴细胞和中性粒细胞的活性，产生免疫抑制，增强其他病毒的致病力。此外，在CSFV和BVDV弱毒疫苗的生产过程中，使用BVDV污染的血清，造成了疫苗的污染更增加了病毒的潜在传播。
近年来，本领域也开始尝试使用病毒活载体疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗等新型疫苗，但这类疫苗无法避免使用过程中基因重组的问题，导致其防治效果不稳定。
因此本领域亟待发明一种可以长期使用而不产生毒力返强，培养生产过程中避免使用血清，并且能有效预防和控制猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒感染的多价亚单位疫苗。
发明内容
针对现有技术的需要，本发明公开了一种猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)的主要囊膜蛋白(E2)和非结构蛋白(NS2-3)共表达载体，能够在宿主菌中同时表达CSFV主要囊膜蛋白(E2c)和非结构蛋白(NS2-3c)及BVDV主要囊膜蛋白(E2b)和非结构蛋白(NS2-3b)，并且蛋白的免疫原性不受破坏和改变。
为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体，是在同一宿主菌中表达的双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1，二者分别连接有猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因，双表达载体与编码基因的连接关系为pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b。
本发明所用的载体pETDuet-1、pRSFDuet-1是双表达载体，每一个载体上有两个启动子，属于单一载体双启动子系统，每一个蛋白的编码基因都有独立的一个启动子，每个启动子独立驱动外源蛋白的表达。
与传统的构建融合基因相比，本发明的双表达载体避免了基因之间的相互影响，保证了蛋白稳定表达，克服了串联表达表达量不足的缺点。并且通过在同一宿主菌中表达的双质粒表达系统，pETDuet-1和pRSFDuet-1作为复制子相同不相容的两个质粒，在Amp和Kana两种抗生素存在的压力下子代菌能够有效存活，不会被抗生素杀死，从而可以同时转化进入同一宿主菌后有效的表达外源基因。
为了便于规模化生产，降低培养难度，本发明所用的宿主菌为大肠杆菌，其培养简单，可以采用发酵罐实现规模化生产，从而有效控制质量，保证疫苗生产的安全性和有效性。
常规的生物工程中所用的大肠杆菌均可用于本发明，包括大肠杆菌BL21(DE3)，和BL21(DE3)PLySs等。
相应的，本发明公开了上述共表达载体的构建方法，通过将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因连接到双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1中，具体的制备过程包括下述步骤：
1)扩增猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因；
2)利用Nde I酶切pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体，将酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1分别与pET-32a(+)载体酶切回收后的Trx-tag序列片段连接得到改造后的pETDuet-1和pRSFDuet-1载体；
3)将改造后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别进行EcoR I、Pst I双酶切和Pst I、Hind III双酶切，猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c编码基因用EcoR I、Pst I双酶切，牛粘膜病毒的非结构蛋白NS2-3b编码基因用Pst I、Hind III双酶切；将双酶切之后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别与双酶切后的猪瘟病毒主要囊膜蛋白E2c编码基因、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS2-3b编码基因连接得到表达载体pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b；
4)对步骤3)所得表达载体pETDuet-1-E2c进行BglII、Xho I双酶切，表达载体pRSFDuet-1-NS2-3b进行Nae I、Xho I双酶切，同时用Bgl II、Xho I双酶切猪瘟病毒非结构蛋白NS2-3c编码基因，用Nae I、Xho I双酶切牛病毒性腹泻病毒主要囊膜蛋白E2b编码基因，将上述双酶切后的表达载体与病毒蛋白编码基因进行连接，构建pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b双表达载体。
通过上述制备过程，将E2b和NS2-3b编码基因经酶切、连接、转化后插入双表达载体pETDuet-1，将NS2-3b和E2b编码基因插入双表达载体pRSFDuet-1，然后把携带四个蛋白对应的编码基因的两个载体共同转化入一个宿主菌，实现高线稳定的同时表达四种蛋白，这是本发明与现有技术中的其它技术方案相比所具有的突破性的技术优势。
其中，步骤1)的编码基因即可从相关的生物制品公司和实验室购买成品或者合成，也可以猪瘟病毒株、牛病毒性腹泻毒株的基因组为模版结合相应的特异性引物采用PCR方法自行扩增，可采用的引物序列对应如下所示：
E2c-F：CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC(含EcoR I酶切位点)
E2c-R：GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT(含Pst I酶切位点)
NS2-3c-F：CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG(含Bg1II酶切位点)
NS2-3c-R：CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG(含Xho I酶切位点)
NS2-3b-F：CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG(含Pst I酶切位点)
NS2-3b-R：CATAAGCTTTTACGCGTTCTGATCAAAATCAG(含Hind III酶切位点)
E2b-F：CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG(含Nae I酶切位点)
E2b-R：CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA(含Xho I酶切位点)
PCR的条件和参数采用本领域常规实验条件即可。
其中，步骤2)采用Nde I对pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)酶切，切开的pET-32a(+)的315bp小片段作为Trx-tag回收，再将切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1分别与Trx-tag小片段连接，将读码框正确插入的pETDuet-1和pRSFDuet-1在大肠杆菌中扩增。通过此种方式，本发明利用pETDuet-1、pRSFDuet-1第二个多克隆位点(MCS2)的Nde I位点插入了Trx-tag，使表达的外源蛋白在N端融合Trx标签，改善了蛋白的可溶性。
通过上述构建方法所得到的共表达载体在菌株中诱导表达的四种抗原蛋白以包涵体形式存在，纯化的蛋白经Western-blot检测表明，能够与抗CSFV和抗BVDV的阳性血清发生反应，证明表达的多种蛋白具有很好的免疫原性。
在此基础上，本发明公开了所述共表达载体的表达方法，将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接至新LB培养基中，加入IPTG进行诱导。
其中，培养最终达到OD值0.6-0.8，所用IPTG浓度为0.8mmol/L。
其中，所用的载体菌株采用适合于外源蛋白表达的菌株，优选的是BL21(DE3)、BL21(DE3)PLySs等。
与传统的疫苗相比，用本发明所涉及的共表达方法制备的疫苗可以用发酵罐规模化生产，实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效；本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题，因此不存在生物安全性问题，可大规模推广应用。
附图说明
图1为pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b的酶切结果，其中1为pRSFDuet-NS2-3b-E2b的双酶切，2是pETDuet-E2c-NS2-3c的双酶切，M是10000bp Marker；
图2是共表达载体在大肠杆菌中表达的四种免疫蛋白表达的SDS-PAGE图，其中：M为蛋白质分子质量标准；1为未诱导的菌体；2为质粒pETDuet-E2c-NS2-3c；3为质粒pRSFDuet-NS2-3b-E2b；4为质粒pETDuet-E2c-NS2-3c和质粒pRSFDuet-NS2-3b-E2b
图3是四种表达的蛋白抗原性效果图，其中1是未诱导的菌体；2为表达的蛋白与标签抗体的反应；3为表达的蛋白与阳性血清的反应；4为表达的蛋白与阴性血清的反应。
具体实施方式
在下述实施例中，申请人提供了一种具体的共表达载体构建和表达过程，并且详细描述了所用原料的来源，仅为示意，并非构成特别限定。本领域技术人员采用符合公知定义的相关原料和实验条件也可实现本发明的发明目的。
在下述实施中，所用原料来源如下：
猪瘟病毒株：石门株(Shimen)，实验室常规保存，也可从其他实验室或国家菌种保藏中心购买。
牛病毒性腹泻毒株：VEDEVAC，实验室保存，也可从其他实验室或国家菌种保藏中心购买。
pETDuet-1和pRSFDuet-1双表达载体，pET-32a(+)载体，均购自Novagen公司。
BL21(DE3)是四个外源蛋白的表达宿主菌，购自北京全式金生物技术有限公司。
所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
所用酶和试剂：限制性内切酶Nde I、Bgl II、EcoR I、Pst I、Hind III、Nae I、Xho I，T4DNA连接酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶和AMV反转录酶均购自大连宝生物有限公司；IPTG、SDS(十二烷基磺酸钠)、核酸Marker、Agarose DNA extraction kit、DNA快速纯化回收试剂盒和质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit，购自QIAGEN公司；琼脂糖购自Invitrogen公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司。
实施例1：共表达载体的构建
1.E2c、NS2-3c、NS2-3b和E2b蛋白编码基因的扩增
按QIAamp Viral RNA Mini Kit操作说明提取Shimen株PK15细胞上清和VEDEVAC株MDBK细胞培养上清的病毒RNA。以E2c-R、NS2-3c-R、NS2-3b-R、E2b-R为反转录引物进行反转录，合成cDNA。然后分别以此为模板扩增出各个目的基因。
RT-PCR 25μL反应体系：PrimeSTAR 0.25μL，5×PrimeSTAR缓冲液5μL，dNTP 2μL，上、下游引物各1μL，模板3μL，去离子水12.75μL。PCR产物用DNA胶回收试剂盒回收，从而得到四个蛋白目的蛋白的编码基因。
2.pETDuet-1和pRSFDuet-1载体的改造
将pETDuet-1和pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体分别用Nde I酶切，40μL酶切体系：10×H缓冲液4μL，Nde I各2μL，载体24μL，去离子水10μL。
用胶回收试剂盒回收切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1，将切开的pET-32a(+)的315bp小片段(即Trx-tag编码基因)也同样回收；再将切开的pETDuet-1和pRSFDuet-1分别与315bp的Trx-tag编码基因连接，连接体系：10×T4DNALigaseBuffer 2.5μL，Trx-tag编码基因胶回收产物14μL，pETDuet-1或者pRSFDuet-12μL，T4DNALigase 1μL，去离子水5.5μL。对改造后的载体进行测序。
3.pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b载体的构建
pETDuet-1和pRSFDuet-1两个载体分别进行EcoR I、Pst I双酶切和Pst I、Hind III双酶切，40μL酶切体系：10×H或10×M缓冲液4μL，对应的限制性内切酶各2μL，载体24μL，去离子水10μL。
酶切产物经1％琼脂糖电泳后胶回收。
E2c编码基因用EcoR I、Pst I双酶切，NS2-3b编码基因用Pst I、Hind III双酶切；40μL酶切体系：10×H或10×M缓冲液4μL，对应的限制性内切酶各2μL，目的基因24μL，去离子水10μL。
酶切产物经1％琼脂糖电泳后胶回收，然后分别与双酶切的pETDuet-1、pRSFDuet-1的载体连接，两个连接体系分别是：①10×T4DNA Ligase Buffer 2.5μL，E2c编码基因胶回收产物14μL，pETDuet-12μL，T4DNALigase 1μL，去离子水5.5μL；②10×T4DNALigase Buffer 2.5μL，NS2-3b编码基因胶回收产物14μL，pRSFDuet-12μL，T4DNALigase 1μL，去离子水5.5μL。
16℃连接过夜，分别转化Trans109感受态细胞，挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定，并对构建的载体测序，确定成功构建了pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b表达载体。
4.pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b载体的构建
对pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b分别进行Bgl II、Xho I和Nae I、Xho I双酶切，40μL酶切体系：10×H或10×L缓冲液4μL，限制性内切酶各2μL，载体24μL，去离子水10μL。
酶切产物经1％琼脂糖电泳后胶回收。
用Bgl II、Xho I双酶切NS2-3c编码的基因，用Nae I、Xho I双酶切E2b编码的基因，40μL酶切体系：10×H或10×L缓冲液4μL，限制性内切酶各2μL，目的基因24μL，去离子水10μL。
酶切产物经1％琼脂糖电泳后胶回收。回收的酶切产物分别与双酶切后的pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b载体连接，两个连接体系分别是：①10×T4DNALigase Buffer 2.5μL，NS2-3c编码基因回收产物14μL，pETDuet-1-E2c回收产物2μL，T4DNALigase 1μL，去离子水5.5μL；②10×T4DNALigase Buffer 2.5μL，E2b的编码基因胶回收产物14μL，pRSFDuet-1-NS2-3b回收产物2μL，T4DNA Ligase 1μL，去离子水5.5μL。
16℃连接过夜，分别转化Trans109感受态细胞，挑取单克隆菌落分别进行菌液PCR鉴定、酶切鉴定，并对构建的载体测序，确定成功构建了pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b表达载体(参考图1)。
实施例2：共表达载体的表达
将pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b表达载体各0.5μL，同时转化BL21(DE3)宿主菌，涂板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种于新鲜10mL LB培养基中，摇菌过夜，按1∶100比例转接新鲜10mL LB培养基中，OD值达0.6-0.8时取1mL菌液作为未诱导样品，其余加入终浓度0.8mM的IPTG，诱导4h，每小时收取1mL菌液样品。
表达完成后，进行SDS-PAGE检测以确定表达是否有效。
SDS-PAGE溶液组成如下：
Tris-甘氨酸缓冲液：25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(pH 8.0)、0.1％SDS。
2×SDS Loading buffer：100mmol/L Tris Cl(pH8.0)、200mmol/L巯基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油。
考马斯亮蓝染色液：45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R250。
脱色液：30％甲醇、10％冰乙酸，蒸馏水补体积至100mL。
SDS-PAGE检测过程如下：
(1)洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0％琼脂糖封边。常规方法配制15％的分离胶5mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖1mL双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入2mL 5％的浓缩胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。
(2)小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。
(3)收集的菌液12000rpm离心2min，用50μLpH7.4的PBS悬浮，加入等体积的2×SDS上样buffer，混匀，水浴煮沸10min，用微量进样器上样10μL，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。
(4)染色：取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放在脱色摇床上室温染色3h。
(5)脱色：用30％甲醇、10％冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换染色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。
结果如附图2所示，由附图2可见，成功实现了四种蛋白的共表达。
在上述基础上，本发明还进行了四种蛋白的免疫原性检测(Western Blot)，SDS-PAGE结束后，取下凝胶，切掉浓缩胶，根据分离胶的大小裁剪PVDF膜，然后将膜在甲醇中浸泡20s，转移至去离子水中漂洗一下，最后置于蛋白转移液中浸泡5min。在蛋白转移液中按照滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序铺好，注意凝胶对应负极，膜对应正极，夹紧夹子，放入转移槽内，接通电源，350mA转渍150min，将蛋白转印至PVDF膜上。将膜置于5％脱脂奶粉中封闭非特异性蛋白质，室温，2h。将膜置于标签抗体或阳性血清工作液中，在摇床上4℃摇晃过夜，PBST洗膜4次，每次15min，将膜置于二抗工作液中，在摇床上，室温摇晃孵育1.5h，PBST洗膜4次，每次15min。洗涤结束后，用去离子水清洗PVDF膜一次，稍微晾干，将膜置于塑料保鲜膜内，在暗室中等量混合ECL显色系统中A、B液，滴加至PVDF膜上，作用1min；裁剪X-胶片，放在膜上，盖上胶片夹，曝光适当时间，取出胶片显影，定影，扫描胶片，进行分析。
参考图3所示，显示了本发明的共表达载体表达的蛋白与血清的免疫反应效果，显示了本发明共表达的四种蛋白具有良好的免疫原性。
Claims (8)
1.猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白和非结构蛋白共表达载体，其特征在于在同一宿主菌中表达的双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1上分别连接有猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因，双表达载体与编码基因的连接关系为pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b。
2.根据权利要求1的共表达载体，其特征在于宿主菌为大肠杆菌。
3.权利要求1的共表达载体的构建方法，其特征在于包括将猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因连接到双表达载体pETDuet-1、pRSFDuet-1的步骤。
4.根据权利要求3的构建方法，其特征在于具体包括下述步骤：1)扩增猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c及牛病毒性腹泻病毒的主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因；2)利用Nde I酶切pETDuet-1、pRSFDuet-1和pET-32a(+)载体，将酶切后的pETDuet-1、pRSFDuet-1分别与pET-32a(+)载体酶切回收后的Trx-tag序列片段连接得到改造后的pETDuet-1和pRSFDuet-1载体；3)将改造后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别进行EcoR I、Pst I双酶切和Pst I、HindIII双酶切，猪瘟病毒的主要囊膜蛋白E2c编码基因用EcoR I、Pst I双酶切，牛粘膜病毒的非结构蛋白NS2-3b编码基因用Pst I、Hind III双酶切；将双酶切之后的pETDuet-1、pRSFDuet-1载体分别与双酶切后的猪瘟病毒主要囊膜蛋白E2c编码基因、牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白NS2-3b编码基因连接得到表达载体pETDuet-1-E2c和pRSFDuet-1-NS2-3b；4)对步骤3)所得表达载体pETDuet-1-E2c进行Bgl II、Xho I双酶切，表达载体pRSFDuet-1-NS2-3b进行Nae I、Xho I双酶切，同时用BglII、Xho I双酶切猪瘟病毒非结构蛋白NS2-3c编码基因，用Nae I、Xho I双酶切牛病毒性腹泻病毒主要囊膜蛋白E2b编码基因，将上述双酶切后的表达载体与病毒蛋白编码基因进行连接，构建pETDuet-E2c-NS2-3c和pRSFDuet-NS2-3b-E2b双表达载体。
5.根据权利要求4的构建方法，其特征在于步骤1)以猪瘟病毒基因组为模版，扩增出主要囊膜蛋白E2c和非结构蛋白NS2-3c的编码基因，以牛病毒性腹泻病毒基因组为模版，扩增出主要囊膜蛋白E2b和非结构蛋白NS2-3b的编码基因。
6.根据权利要求5的构建方法，其特征在于各编码基因对应的引物分别为
E2c-F：CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC
E2c-R：GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT
NS2-3c-F：CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG
NS2-3c-R：CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG
NS2-3h-F：CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG
NS2-3h-R：CATAAGCTTITACGCGTTCTGATCAAAATCAG
E2h-F：CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG
E2h-R：CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA。
7.权利要求1的共表达载体的表达方法，其特征在于将共表达载体转化到同一宿主菌进行涂板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，摇菌过夜，转接至新LB培养基中，加入IPTG进行诱导。
8.根据权利要求7的表达方法，其特征在于培养最终达到OD值0.6-0.8，所用IPTG浓度为0.8mmol/L。
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