CN104151423B - 一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，步骤为：（1）对新鲜牛乳进行杀菌处理；（2）对杀菌后的新鲜牛乳进行脱脂处理，脱脂后即为脱脂乳产品；（3）对脱脂乳进行浓缩；（4）对微滤膜过滤截留液进行透析处理，以除去其它杂蛋白；（5）加入NaCl，间歇搅拌；（6）采用透析的方式将步骤（5）中的乳铁蛋白进行回收；（7）对透析液进行超滤处理；（8）对超滤膜截留液进行透析处理，得到牛乳蛋白浓缩液；（9）对牛乳蛋白浓缩液进行干燥处理。本发明充分利用牛乳体系中酪蛋白与乳铁蛋白的动态包裹解析机制，实现乳铁蛋白最大程度的释放，使得乳铁蛋白制备得率与现有技术相比提高15‑30%，实现技术的重大突破。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳铁蛋白的制备方法，具体涉及一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法。
背景技术
牛乳蛋白主要是酪蛋白和乳清蛋白，其中乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）主要存在于乳清蛋白中，在牛乳中的含量约为0.1-0.4mg/mL。LF具有多种重要的生物学功能，例如抗菌活性、很强的离子亲和力、抵抗病毒对机体的入侵、提高机体的免疫调节能力、促进伤口的愈合、增强机体对于病的抵抗能力、促进成骨细胞的增殖等等。广泛应用于婴幼儿配方奶粉、食品、医药、保健等领域，具有非常广泛的市场应用前景。
从1960年开始，人们就开始从不同的原料乳如牛乳、牛初乳、人乳、山羊乳和骆驼初乳等中，采用各种方法如超滤、盐析、硫酸铵沉淀、离子交换色谱法、盐析结合凝胶层析法、超滤结合离子交换色谱法、亲和色谱法、混合模式扩张床吸附法、固定化单克隆抗体等方法。Groves 采用了DEAE阴离子交换层析成功地分离出了LF，接着 Foley又对Groves的磷酸纤维素交换层析进行了改进，制备了纯度达81%的LF，随后人们又研究出更有效的羧甲基阳离子交换层析法分离LF。目前，主要采用强阳离子交换层析梯度洗脱的方法，结合超滤浓缩以及凝胶过滤层析相结合的方法分离高纯度的乳铁蛋白。如S Sepharose Fast Flow、SPSepharose Big Beads等阳离子交换树脂，通过阳离子交换树脂方法最后获得LF纯度>95%，与亲和层析法相比成本较低且应用广泛。而硫酸铵沉淀和超滤等方法则成本低廉，易操作，但获得的LF纯度（<50%）较低，所以该方法通常用于分离LF粗品及辅助阳离子交换层析和亲和层析等方法以获取高纯度LF。生产及实验中通常采用阳离子交换层析和超滤、凝胶层析等方法相结合以快速获取高纯度LF。
尽管利用上述方法可以得到纯度高达90%以上的乳铁蛋白产品，但这些方法本身也存在诸多技术局限性，如生产成本过高，生产步骤繁琐，需要对层析材料进行洗脱等。固定化单克隆抗体法分离效果好纯度高，但制备工艺复杂、成本昂贵，难以工业化生产；而超滤法操作简便，费用相对低，易形成工业化规模，但超滤膜需经常处理，其产品纯度不如层析法高。此外，乳铁蛋白本身在牛乳中的含量极低，而在酪蛋白胶体中的分布又使得存在于乳清中的乳铁蛋白(仅有30%到50%)更是少之又少，这无疑加大了处理液体的体积，增加了提取难度。因此人们最终不得不考虑在工业生产中利用其他技术方法，对牛乳中的乳铁蛋白进行分离提取。近年来，膜过滤技术被广泛应用。其2007年Jimenez-Lopez研究了微膜过滤对牛乳中各成分的影响，从而可以通过膜过滤技术对乳铁蛋白进行分离提取。
有研究表明，在牛乳体系中乳铁蛋白以两种形式存在，一种是自由乳铁蛋白，即自由存在于牛乳乳清蛋白中；一种是与酪蛋白胶体（Casein micelles, CM）相互作用的固定乳铁蛋白，形成酪蛋白胶体与乳铁蛋白复合物（LF-CM）。根据L. Phelebon的研究结果表明，二者之间存在着一个可逆平衡。酪蛋白(Casein, CN)在牛乳条件下并不是以单分子形式存在的，而是主要由4种不同类型的酪蛋白αs1-、αs2-、β-、κ-CN相互结合形成酪蛋白胶体复合物（Casein micelles,CM）。利用牛乳体系中酪蛋白与乳铁蛋白的动态包裹解析机制，可以在工业化生产中开发一种新型的乳铁蛋白纯化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，充分利用牛乳体系中酪蛋白与乳铁蛋白的动态包裹解析机制，实现乳铁蛋白最大程度的释放，使得乳铁蛋白制备得率与现有技术相比提高15%-30%，实现技术的重大突破。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，包括如下步骤：
（1）对新鲜牛乳进行杀菌处理；
（2）对杀菌后的新鲜牛乳进行脱脂处理，脱脂后即为脱脂乳产品；
（3）采用0.1μm的微滤膜过滤方法对脱脂乳进行浓缩，温度控制在35-55℃，将浓缩倍数控制在1-3倍；
（4）对微滤膜过滤截留液进行透析处理，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在35-55℃，采用去离子水作为透析溶液，控制截留溶液中总蛋白浓度为20-50g/L；
（5）向截留溶液中加入 100-500 mmol/L的NaCl，并将pH值调为6.0-7.0，温度控制在25-35℃；经过调配后在4-6℃条件下间歇搅拌2-8h；
（6）采用透析的方式将步骤（5）中的乳铁蛋白进行回收，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在35-55℃，采用去离子水作为透析溶液；
（7）采用截留分子量为5-10kDa的超滤膜对透析液进行超滤处理，达到固形物含量15-50wt.%，温度控制在35-55℃；
（8）对超滤膜截留液进行透析处理，得到牛乳蛋白浓缩液，透析膜规格为3500-1000Da，采用去离子水作为透析溶液；
（9）对牛乳蛋白浓缩液进行干燥处理。
本发明根据“一种是与酪蛋白胶体（Casein micelles, CM）相互作用的乳铁蛋白，形成酪蛋白胶体与乳铁蛋白复合物（LF-CM），两者之间存在可逆的动态平衡”理论，通过调控牛乳体系因素，如pH、离子强度和温度等因素，实现了对CM与LF结合和释放过程的控制；通过工艺技术工艺参数优化，可将原本包裹在酪蛋白胶束中的乳铁蛋白（占总乳铁蛋白含量的15%-30%）从LF-CM复合物中释放出来，并进一步通过膜分离技术提取出来，从而使得乳铁蛋白的提取率较传统技术提高15%-30%；而且本发明的工艺技术中无需经过离子交换等耗时环节，大大提高了生产效率。因此，本发明对于科研和工作生产中能高效提取制备LF具有重要的科学意义和经济效益。
附图说明
图1为乳铁蛋白制备工艺流程图。
具体实施方式
具体实施方式一：如图1所示，本实施方式提供了一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，具体步骤如下：
一、乳铁蛋白的制备
（1）杀菌处理：新鲜牛乳经过低温长时巴氏杀菌（62-65℃保持25-35min）、高温短时巴氏杀菌（72-75℃保持10-20s），或者经过1.4 μm的微滤膜除菌，或者先经过巴式杀菌再经过膜过滤除菌。
（2）牛乳样品处理：杀菌后的新鲜牛乳于4-6℃条件下，5000-10000rpm离心15-30min脱除脂肪，脱脂后即为脱脂乳产品。
（3）微滤膜过滤：采用0.1μm的微滤膜进行过滤，温度控制在35-55℃，酪蛋白和乳铁蛋白得到同样程度的浓缩，将浓缩倍数控制在1-3倍，即膜过滤截留液中总蛋白质浓度变为初始浓度的1-3倍。
（4）透析处理：对膜过滤截留液进行透析处理，以除去其它杂蛋白，保留乳铁蛋白和酪蛋白，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在35-55℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的4-6倍，并采用凯氏定氮法监测截留溶液中的总蛋白浓度，控制截留溶液中总蛋白浓度为20-50g/L。
（5）释放乳铁蛋白：向截留溶液中加入 100-500 mmol/L的NaCl，并将pH值调为6.0-7.0，温度控制在25-35℃；经过调配后在4-6℃条件下间歇搅拌2-8h，得到乳铁蛋白与酪蛋白复合物。
（6）透析处理回收乳铁蛋白：采用透析的方式将乳铁蛋白进行回收，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在35-55℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的3-6倍。
（7）超滤处理：采用截留分子量为5-10kDa的超滤膜对乳铁蛋白进行超滤处理，一方面脱出乳铁蛋白中残留的NaCl，另一方面使乳铁蛋白溶液得到浓缩，达到固形物含量（即质量浓度）为15-50%，温度控制在35-55℃。
（8）透析处理：对超滤膜截留液进行透析处理以进一步除去盐，实现保留乳铁蛋白和酪蛋白，透析膜规格为3500-1000Da，采用去离子水作为透析溶液，使用量为超滤膜截留液体积的3-6倍，最终保持固形物含量为15-50wt.%。
（9）乳铁蛋白干燥：采用喷雾干燥技术对牛乳蛋白浓缩液进行干燥，进口温度130-170℃，出口温度60-90℃，进行喷雾干燥之前的浓缩液固形物含量在15-50%。
也可以采用低温喷雾干燥的方式进行干燥，进风温度60-80℃，出风温度30-45℃；进行低温喷雾干燥之前的浓缩液固形物含量要求15-50%。
也可以采用真空冷冻干燥的方式，冷阱温度-73~-40℃，真空度0.01~0.5mbar，时间3~24h。
干燥之后的产品水分含量控制在5%以内。
二、主要相关测定方法
（1）蛋白质测定
采用自动凯氏定氮仪法进行测定。计算的时候氮的换算为蛋白质的系数为6.38。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1 g/100 g时，结果保留三位有效数字。
（2）免疫扩散方法 (IDR)测定乳铁蛋白含量
IDR方法是利用乳铁蛋白与对应抗体的免疫反应而对样品中乳铁蛋白定量的一种方法。测量中所需的试剂盒和标准乳铁蛋白购买自Sigma公司。乳铁蛋白含量根据如下公式进行计算：
mLF =[LFtotal]×V样品=[LFtotal]×(m样品/ρ样品) 。
式中mLF—总乳铁蛋白质量(g)；[LFtotal]—乳铁蛋白总含量(g.L-1)；
V样品—样品体积(L)；m样品——样品质量(g)；ρ样品——样品密度(g.L-1)。
（3）反相高效液相色谱 RP-HPLC测定蛋白质组成
最终样品的蛋白质组成成分分析，采用反相高效液相色谱法 HPLC-RP。在本课题研究过程中，这种方法被运用于确定样品中的不同种类的可溶性蛋白质含量。样品首先进行超速离心处理 (100000×g，1 h)，取其离心液，为进一步去除其中的微量酪蛋白，加入三氟乙酸 (0.2%体积质量)进行酸沉淀处理，进行第二次离心处理(13000×g，5 min)，取最终离心液进行分析。
三、检测结果
本发明中的工艺参数具有多种组合，相应的乳铁蛋白产品的组成相差较大，乳铁蛋白的含量范围为23~87.3%，α-乳白蛋白3.5~16%，β-乳球蛋白3.2~15%，血清蛋白1~12%，免疫球蛋白1~13%，β-酪蛋白0~17%，水分3%，灰分1%。
具体实施方式二： 本实施方式提供了一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，具体步骤如下：
（1）杀菌处理：新鲜牛乳经过低温长时巴氏杀菌（62-65℃保持30min）。
（2）牛乳样品处理：杀菌后的新鲜牛乳于4-6℃条件下，6000离心15 min脱除脂肪，脱脂后即为脱脂乳产品。
（3）微滤膜过滤：采用0.1μm的微滤膜进行过滤，温度35℃，该过程的操作终点通过“膜过滤截留液中总蛋白质浓度变为初始浓度的3倍”判断。
（4）透析处理：对膜过滤截留液进行透析处理，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在35℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的4倍。
（5）释放乳铁蛋白：控制截留溶液中总蛋白浓度为20g/L，加入 200 mmol/L的NaCl，并将pH值调为6.4，温度控制在25℃；4℃条件下搅拌3h。
（6）透析处理回收乳铁蛋白：透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度35℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的3倍。
（7）超滤处理：采用截留分子量为5kDa的超滤膜对乳铁蛋白进行超滤处理，达到固形物含量（即质量浓度）为20%，温度控制在35℃。
（8）透析处理：对超滤膜截留液进行透析处理以进一步除去盐，透析膜规格为5000Da，采用去离子水作为透析溶液，使用量为超滤膜截留液体积的3倍。
（9）乳铁蛋白干燥：采用喷雾干燥技术对牛乳蛋白浓缩液进行干燥，进口温度170℃，出口温度70℃，进行喷雾干燥之前的浓缩液固形物含量在30%。
经过上述工序操作，最终得到的乳铁蛋白粉组成及成份含量如下：乳铁蛋白的含量为23%，α-乳白蛋白16%，β-乳球蛋白15%，血清蛋白12%，免疫球蛋白13%，β-酪蛋白17%，水分3%，灰分1%。
具体实施方式三：本实施方式提供了一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，具体步骤如下：
（1）杀菌处理：新鲜牛乳经高温短时巴氏杀菌（72-75℃保持10-20s）再经过膜过滤除菌。
（2）牛乳样品处理：杀菌后的新鲜牛乳于4℃条件下，8000rpm离心20 min脱除脂肪，脱脂后即为脱脂乳产品。
（3）微滤膜过滤：采用0.1μm的微滤膜进行过滤，温度控制在45℃，该过程的操作终点通过“膜过滤截留液中总蛋白质浓度变为初始浓度的3倍”判断。
（4）透析处理：对膜过滤截留液进行透析处理，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在45℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的6倍，并采用凯氏定氮法监测截留溶液中的总蛋白浓度。
（5）释放乳铁蛋白：控制截留溶液中总蛋白浓度为40g/L，加入 300 mmol/L的NaCl，并将pH值调为6.6，温度控制在35℃；经过调配后在4℃条件下间歇搅拌8h。
（6）透析处理回收乳铁蛋白：透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在55℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的4倍。
（7）超滤处理：采用截留分子量为10kDa的超滤膜对乳铁蛋白进行超滤处理；对截留液再用分子量为30kDa的超滤膜进行处理，使截留液中固形物含量（即质量浓度）达到30%时终止，温度控制在55℃。
（8）透析处理：透析膜规格为5000Da，采用去离子水作为透析溶液，使用量为超滤膜截留液体积的4倍。
（9）乳铁蛋白干燥：采用低温喷雾干燥的方式进行干燥，进风温度80℃，出风温度45℃；进行低温喷雾干燥之前的浓缩液固形物含量要求50%。
经过上述工序操作，最终得到的乳铁蛋白粉组成及成份含量如下：乳铁蛋白的含量为87.3%，α-乳白蛋白3.4%，β-乳球蛋白3.2%，血清蛋白1%，免疫球蛋白1%，水分3.2%，灰分0.9%。
具体实施方式四：本实施方式提供了一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，具体步骤如下：
（1）杀菌处理：新鲜牛乳经过低温长时巴氏杀菌（62℃保持30min）、再经过1.4 μm的微滤膜除菌。
（2）牛乳样品处理：杀菌后的新鲜牛乳于4℃条件下， 10000rpm离心15 min脱除脂肪，脱脂后即为脱脂乳产品。
（3）微滤膜过滤：采用0.1μm的微滤膜进行过滤，温度控制在55℃，将浓缩倍数控制在3倍。
（4）透析处理：对膜过滤截留液进行透析处理，透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在55℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的5倍，并采用凯氏定氮法监测截留溶液中的总蛋白浓度。
（5）释放乳铁蛋白：控制截留溶液中总蛋白浓度为30g/L，加入 200 mmol/L的NaCl，并将pH值调为6.8，温度控制在35℃；经过调配后在4℃条件下间歇搅拌6h。
（6）透析处理回收乳铁蛋白：透析膜规格为0.1μm的微滤膜，温度控制在55℃，采用去离子水作为透析溶液，使用量为脱脂后牛乳体积的5倍。
（7）超滤处理：采用截留分子量为5kDa的超滤膜对乳铁蛋白进行超滤处理，达到固形物含量（即质量浓度）为40%，温度控制在50℃。
（8）透析处理：透析膜规格为3500Da，采用去离子水作为透析溶液，使用量为超滤膜截留液体积的5倍。
（9）乳铁蛋白干燥：采用真空冷冻干燥的方式，冷阱温度-73℃，真空度0.01mbar，时间24h。
经过上述工序操作，最终得到的乳铁蛋白粉组成及成份含量如下：乳铁蛋白的含量为56%，α-乳白蛋白16%，β-乳球蛋白16%，血清蛋白4%，免疫球蛋白4%，水分3%，灰分1%。
Claims (1)
1.一种基于酪蛋白与乳铁蛋白动态吸附解析机制的乳铁蛋白制备方法，其特征在于所述乳铁蛋白制备方法为：
（1）新鲜牛乳经72-75℃，10-20s的巴氏杀菌后，再经过膜过滤除菌，得到除菌后的新鲜牛乳;
（2）将所述步骤（1）得到的除菌后的新鲜牛乳于4℃条件下，8000rpm离心20 min脱除脂肪，得到脱脂乳产品;
（3）将所述步骤（2）得到的脱脂乳产品采用0.1μm的微滤膜进行过滤，温度控制在45℃，得到膜过滤截留液；所述过滤的操作终点通过“膜过滤截留液中总蛋白质浓度变为初始浓度的3倍”判断;
（4）将所述步骤（3）得到的膜过滤截留液进行透析处理，得到透析后的乳产品；所述透析处理采用的透析膜的规格为0.1μm的微滤膜，所述透析处理的温度控制在45℃，所述透析处理过程中采用去离子水作为透析溶液，所述透析溶液的使用量为脱脂后乳产品体积的6倍，采用凯氏定氮法监测截留溶液中的总蛋白浓度;
（5）将所述步骤（4）得到的透析后的乳产品进行释放乳铁蛋白处理，得到含乳铁蛋白的乳产品；所述释放乳铁蛋白处理的条件为控制截留溶液中总蛋白浓度为40g/L，加入 300mmol/L的NaCl，并将pH值调为6.6，温度控制在35℃，经过调配后在4℃条件下间歇搅拌8h;
（6）将所述步骤（5）得到的含乳铁蛋白的乳产品进行再次透析处理，得到乳铁蛋白；所述再次透析处理采用的透析膜规格为0.1μm的微滤膜，所述再次透析处理的温度控制在55℃，所述再次透析处理采用去离子水作为再次透析溶液，所述再次透析溶液的使用量为脱脂后乳产品体积的4倍;
（7）将所述步骤（6）得到的乳铁蛋白进行超滤处理，得到超滤膜截留液；所述超滤处理的过程为：采用截留分子量为10kDa的超滤膜对所述乳铁蛋白进行一次超滤处理，得到一次截留液，采用截留分子量为30kDa的超滤膜对一次截留液再次超滤处理，得到二次截留液；当所述二次截留液中固形物质量浓度达到30%时终止，所述超滤处理的温度控制在55℃;
（8）将所述步骤（7）得到的超滤膜截留液进行三次透析处理，得到三次透析后的乳铁蛋白；所述三次透析处理采用透析膜的规格为5000Da，所述三次透析处理过程中采用去离子水作为三次透析溶液，所述三次透析溶液的使用量为超滤膜截留液体积的4倍;
（9）将所述步骤（8）得到的三次透析后的乳铁蛋白进行干燥处理，得到乳铁蛋白；所述干燥处理的过程为：采用低温喷雾干燥的方式对所述三次透析后的乳铁蛋白进行干燥，所述干燥处理的进风温度为80℃，所述干燥处理的出风温度为45℃；进行低温喷雾干燥之前的浓缩液固形物含量要求50%。
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