CN104140996B - 液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒 - Google Patents
液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104140996B CN104140996B CN201410380235.8A CN201410380235A CN104140996B CN 104140996 B CN104140996 B CN 104140996B CN 201410380235 A CN201410380235 A CN 201410380235A CN 104140996 B CN104140996 B CN 104140996B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- test kit
- polyanion
- enzyme method
- homocysteine
- liquid stabilising
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)稳定的底物系统，包括NADH循环系统与S-腺苷甲硫氨酸聚阴离子系统；2)稳定的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，提高试剂盒整体的稳定性。本发明的试剂盒提供一套S-腺苷基甲硫氨酸及还原型辅酶Ⅰ的稳定体系，并引入专利酶技术以提高试剂盒的整体稳定性，从而满足临床检验的需求的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒。同时充分克服了传统由于其底物SAM(S-腺苷甲硫氨酸)本身的稳定性差，所采用的偶联酶热稳定性不好等多种原因，导致试剂盒在临床上的应用受限的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体为一种在医学检验中使用的稳定性好的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸(Hcy)是独立的心脑血管疾病最新监测指标，可用于预测脑血管疾病发生的危险性，并与老年痴呆、肾功能衰竭、流产及糖尿病早亡有关，所以Hcy的体外检测具有重要的临床价值。
目前检测血浆中Hcy主要采用酶循环法，该法可以在自动生化分析仪上进行，测定灵敏度高，广泛应用于临床检验。其反应原理如下：
L-Met：L-甲硫氨酸
SAMT：S-腺苷甲硫氨酸转移酶(水杨酸羧基位甲基转移酶)
SAH：S-腺苷同型半胱氨酸
SAHH：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶
ADA：腺苷脱氨酶
α-KG：α-酮戊二酸
GLDH：谷氨酸脱氢酶。
目前酶法试剂盒虽在临床上应用广泛，但由于其底物SAM(S-腺苷甲硫氨酸,S-腺苷-L-蛋氨酸)本身的稳定性差，所采用的偶联酶热稳定性不好等多种原因，导致试剂盒在临床上的应用受限。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供一套S-腺苷基甲硫氨酸及还原型辅酶Ⅰ(NADH)的稳定体系，并引入专利酶技术以提高试剂盒的整体稳定性，从而满足临床检验的需求的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，该试剂盒包括：1)稳定的底物系统，包括NADH循环系统与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)聚阴离子系统；2)稳定的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，提高试剂盒整体的稳定性。
本发明上述的NADH循环系统在液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒中的各组分和用量如下：
NADH0.1-0.5g/L，
葡萄糖脱氢酶5-50KU/L，
D-葡萄糖10-100mM。
本发明上述NADH循环系统的采用，其作用在于：试剂在放置的过程中，由于NADH容易受光、热等影响，分解成NAD，从而导致试剂盒性能的下降，而通过引入以下循环反应从而确保试剂盒中NADH的含量满足测定的需求：
其中NAD为试剂盒放置过程中所生成，而D-葡萄糖/葡萄糖脱氢酶则是为了满足NADH的循环所加入的成分，均有市售。
本发明上述S-腺苷甲硫氨酸聚阴离子系统在液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒中的各组分和用量如下：
SAM聚阴离子(SAM聚阴离子是指SAM与大分子量的聚阴离子通过静电作用结合形成的盐)1-30mM；
环糊精类：1-30mM；
多糖：1-200g/L。
本发明一种稳定的底物系统——SAM底物系统，由SAM聚阴离子(聚阴离子SAM盐)及环糊精组成。常见的SAM盐有钾盐、钠盐、对甲苯磺酸硫酸盐等，但均由于SAM非常活泼，很容易分解成多种物质，故试剂盒的稳定性受限。因为，不同的阴离子对SAM盐的稳定性不同，提高阴离子的空间立体障碍可增加其稳定性。大分子量的阴离子通过静电作用与SAM结合,利用其空间位阻限制SAM氨基酸链的自由旋转,从而提高SAM的稳定性；本发明通过筛选发现水溶性聚阴离子具体指含-SO3 -(聚乙烯磺酸盐、聚苯乙烯磺酸盐如钠盐、钾盐等)、-SO4 -(聚乙烯硫酸盐如钠盐、钾盐等)、-O-PO3 2-以及-O-PO3H-(聚乙烯磷酸盐如钠盐、钾盐等)等重复单元的强酸衍生型聚阴离子和含-COO-重复单元的弱酸衍生型聚阴离子可以显著提高SAM的稳定性。聚合物的重复单位(重复单元)为3-20，重复单位低，则稳定性差，而重复单位过高，则对反应产生抑制作用。
本发明上述的SAM聚阴离子具体是SAM与大分子量的聚阴离子通过静电作用结合得到的盐，为行业常规技术，具体SAM与大分子量的聚阴离子通过静电作用获得盐的方法可参考CN85107218中具体实施例。
但是仅有聚阴离子SAM是不能满足试剂盒的长期稳定性的，另需加入一些稳定剂，稳定剂主要包括环糊精类与多糖类的一种或者多种组合。
因此，本发明上述S-腺苷甲硫氨酸聚阴离子系统中环糊精类物质包括：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及衍生物，优选β-环糊精的衍生物如羟丙基-β-环糊精及甲基-β-环糊精等，具体根据所选的聚阴离子SAM而定；多糖包括：海藻糖及甘露醇等中的一种。
本发明所采用的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，来源公告号：CN102559572B，菌种保藏编号为CGMCCNo.5654，是通过PCR技术从环境基因组文库筛选获得一高活性的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因，其序列经鉴定为嗜酸热硫化叶菌，插入到含有T7强启动子的pET28质粒中，导入大肠杆BL21中，获得高效表达的基因工程菌。采用该菌株获得的水解酶Km＝0.009±0.0009mmol/L，远低于其他方式获得酶的Km，另外，该酶的热稳定性高，在60℃加热30min酶活仅下降10％，试剂盒中应用37℃破坏实验7天，酶活没有任何损失，完全满足试剂盒的应用。
根据上述底物与酶的稳定系统所制备的完整的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，该试剂盒各组分浓度如下：
上述试剂盒中各成分均为最终浓度；试剂盒做成双试剂的形式，根据需要将试剂盒中成分分别放于试剂1或者试剂2中。
其中缓冲液为缓冲能力在6-10的缓冲液，如Tris、磷酸、GOOD’s缓冲液等；
防腐剂为试剂盒中常用防腐剂，如叠氮钠及PC系列防腐剂等。
本发明上述试剂盒各组分均为在整体以水为溶剂的试剂盒中的浓度。
本发明的优点和有益效果：
本发明的试剂盒提供一套S-腺苷基甲硫氨酸及还原型辅酶Ⅰ(NADH)的稳定体系，并引入专利酶技术以提高试剂盒的整体稳定性，从而满足临床检验的需求的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒。该试剂盒充分克服了传统由于其底物SAM(S-腺苷甲硫氨酸)本身的稳定性差、所采用的偶联酶热稳定性不好等多种原因导致的试剂盒在临床上的应用受限的缺陷；使得试剂盒稳定性高，应用范围不受限制。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
本发明实施例中采用的SAM聚阴离子，可参考CN85107218，《S-腺苷-L-蛋氨酸与聚阴离子的稳定盐的制备方法及其应用》中具体实施例的方法获得，然后应用到本发明的具体实施例中。
实施例1：
NADH循环系统：
NADH0.3g/L
葡萄糖脱氢酶：30KU/L
D-葡萄糖：25mM
实施例2：
SAM聚阴离子系统：
SAM聚苯乙烯磺酸钠10mM
甲基β-环糊精15mM
甘露醇5g/L
实施例3：
Hcy试剂盒：
R1：
R2
采用上述试剂盒检测样本Hcy浓度的方法如下表1所示：
表1
采用本专利所制备的试剂盒稳定性好，4摄氏度放置一年及37摄氏度7天破坏实验均仅有5％的损失，完全满足临床的需求。
实施例4：
Hcy试剂盒：
R1：
R2：
样本中Hcy浓度检测同实施例3。
实施例所用的原料，除另有说明外，均为普通市售分析纯试剂。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，
该试剂盒包括：1）稳定的底物系统，包括NADH循环系统与S-腺苷甲硫氨酸聚阴离子系统；2）稳定的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，提高试剂盒整体的稳定性；
所述的NADH循环系统在液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒中的各组分和用量如下：
NADH0.1-0.5g/L，
葡萄糖脱氢酶5-50KU/L，
D-葡萄糖10-100mM；
所述的S-腺苷甲硫氨酸聚阴离子系统在液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒中的各组分和用量如下：
SAM聚阴离子1-30mM；
环糊精类：1-30mM；
多糖：1-200g/L；
所述的SAM聚阴离子为含-SO3 -、-SO4 2-、-O-PO3 2-或-O-PO3H-重复单元的强酸衍生型聚阴离子或含-COO-重复单元的弱酸衍生型聚阴离子中的一种;所述的重复单元为3-20;所述的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，来源公告号：CN102559572B，菌种保藏编号为CGMCCNo.5654，是通过PCR技术从环境基因组文库筛选获得一高活性的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因，其序列经鉴定为嗜酸热硫化叶菌，插入到含有T7强启动子的pET28质粒中，导入大肠杆BL21中，获得高效表达的基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，该试剂盒各组分浓度如下：
缓冲液pH6-1010-200mM，
三(2-羧乙基)膦0.5-15mM，
NADH0.1-0.5g/L，
D-葡萄糖10-100mM，
葡萄糖脱氢酶5-50KU/L，
α-酮戊二酸10-100mM，
谷氨酸脱氢酶5-200KU/L，
SAM聚阴离子1-30mM，
环糊精类1-30mM，
S-腺苷甲硫氨酸转移酶0.5-5KU/L，
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶0.5-5KU/L，
腺苷脱氨酶2-50KU/L，
防腐剂0.01-1%，
多糖1-200g/L。
3.根据权利要求2所述的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述的环糊精类物质包括：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精及衍生物中的一种。
4.根据权利要求2所述的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述的多糖为海藻糖。
5.根据权利要求2所述的液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为缓冲能力在6-10的Tris、磷酸、GOOD’s缓冲液中的一种；所述的防腐剂为叠氮钠或PC系列防腐剂中的一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410380235.8A CN104140996B (zh) | 2014-08-04 | 2014-08-04 | 液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410380235.8A CN104140996B (zh) | 2014-08-04 | 2014-08-04 | 液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104140996A CN104140996A (zh) | 2014-11-12 |
| CN104140996B true CN104140996B (zh) | 2016-06-01 |
Family
ID=51850337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410380235.8A Active CN104140996B (zh) | 2014-08-04 | 2014-08-04 | 液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104140996B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296596A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-02-03 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒 |
| CN106053830A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-10-26 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定同型半胱氨酸的试剂盒及其制备方法 |
| CN109988816A (zh) * | 2019-04-12 | 2019-07-09 | 浙江夸克生物科技有限公司 | 一种腺苷脱氨酶测定试剂盒 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1548547A (zh) * | 2003-05-23 | 2004-11-24 | 上海特康生物工程有限公司 | 酶法分析试剂及其制法 |
| US7097968B2 (en) * | 2003-07-10 | 2006-08-29 | General Atomics | Methods and compositions for assaying homocysteine |
| TR201802640T4 (tr) * | 2007-01-25 | 2018-03-21 | Mitsubishi Gas Chemical Co | Mükemmel saklama stabilitesine sahip olan ve s-adenozil-l-metiyonin içeren kuru mayanın üretilmesi için yöntem, yöntem yoluyla üretilen ürün ve kuru mayanın kalıplanmış bileşimi. |
-
2014
- 2014-08-04 CN CN201410380235.8A patent/CN104140996B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104140996A (zh) | 2014-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cronan | Assembly of lipoic acid on its cognate enzymes: an extraordinary and essential biosynthetic pathway | |
| Liu et al. | Biosynthesis of 4-thiouridine in tRNA in the methanogenic archaeon Methanococcus maripaludis | |
| Bonnington et al. | Outer membrane vesicle production facilitates LPS remodeling and outer membrane maintenance in Salmonella during environmental transitions | |
| Helm et al. | Posttranscriptional RNA modifications: playing metabolic games in a cell’s chemical Legoland | |
| Burrichter et al. | Anaerobic degradation of the plant sugar sulfoquinovose concomitant with H2S production: Escherichia coli K-12 and Desulfovibrio sp. strain DF1 as co-culture model | |
| Lin et al. | Biotin synthesis begins by hijacking the fatty acid synthetic pathway | |
| Hanson et al. | Sulfoquinovose is a select nutrient of prominent bacteria and a source of hydrogen sulfide in the human gut | |
| CN104140996B (zh) | 液体稳定酶法同型半胱氨酸试剂盒 | |
| Xu et al. | Protein acetylation and butyrylation regulate the phenotype and metabolic shifts of the endospore-forming Clostridium acetobutylicum | |
| Boutigny et al. | Physical and functional interactions of a monothiol glutaredoxin and an iron sulfur cluster carrier protein with the sulfur-donating radical S-adenosyl-L-methionine enzyme MiaB | |
| US10428368B2 (en) | Methods for enriching for a population of RNA molecules | |
| US20230022745A1 (en) | Methods for Labeling a Population of RNA Molecules | |
| Mesbah et al. | Determination of the G+ C content of prokaryotes | |
| Christ et al. | Analytical polyphosphate extraction from Saccharomyces cerevisiae | |
| Su et al. | Discovery and characterization of a novel C-terminal peptide carboxyl methyltransferase in a lassomycin-like lasso peptide biosynthetic pathway | |
| Delvaux et al. | Structural determinants of specificity and catalytic mechanism in mammalian 25-kDa thiamine triphosphatase | |
| Zhu et al. | Global lysine acetylation and 2-Hydroxyisobutyrylation profiling reveals the metabolism conversion mechanism in Giardia lamblia | |
| Zhu et al. | Quantitative lipidomic insights in the inhibitory response of Pichia stipitis to vanillin, 5-hydroxymethylfurfural, and acetic acid | |
| Matic et al. | Alamethicin permeabilizes the plasma membrane and mitochondria but not the tonoplast in tobacco (Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow) suspension cells | |
| Jenkins et al. | A continuous fluorescent enzyme assay for early steps of lipid A biosynthesis | |
| Fang et al. | Reciprocal regulation of phosphatidylcholine synthesis and H3K36 methylation programs metabolic adaptation | |
| JP5468299B2 (ja) | Ｉｍｐｄｈ含有組成物及びｉｍｐｄｈの安定化方法 | |
| Aktas et al. | In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens | |
| CN109142747A (zh) | 一种同型半胱氨酸检测试剂盒 | |
| Mistry et al. | Polysaccharide sulfotransferases: the identification of putative sequences and respective functional characterisation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 315104 Ningbo, Yinzhou, Central District, No. Qiming South Road, No. 299 Patentee after: Meikang biological Polytron Technologies Inc Address before: 315104 Ningbo, Yinzhou, Central District, No. Qiming South Road, No. 299 Patentee before: Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd. |