CN104128169A

CN104128169A - 一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备

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Publication number: CN104128169A
Application number: CN201410356144.0A
Authority: CN
Inventors: 谷雪; 鲁阳芳; 薛芸; 汪慧; 王彦; 阎超
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-07-24
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2034-07-24
Also published as: CN104128169B

Abstract

本发明涉及毛细管柱制备领域，特别是涉及一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法及其用途。本发明提供一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，包括如下步骤：（1）采用改良的采St?ber法合成了亚微米粒径的表面光滑、均匀且单分散性良好的亚微米无孔二氧化硅微球；（2）采用(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷为连接臂将β-环糊精键合到步骤1所得亚微米无孔二氧化硅微球上，加入苯异氰酸酯对环糊精进行衍生化制备出手性固定相；（3）色谱柱的装填。本发明所提供的亚微米手性毛细管柱手性分离效果好、柱效高、分析速度快、机械性能好、且使用寿命长。

Description

一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备

技术领域

本发明涉及毛细管柱制备领域，特别是涉及一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法及其用途。

背景技术

目前临床常用的1850多种药物中超过半数为手性药物，而大多数以外消旋的形式投放市场。研究发现，药物对映体通常具有不同的药理作用、药代动力学行为及毒性作用。目前商品化的液相色谱手性填料粒径多为3μm、5μm和10μm。根据Van Deemter方程，在液相色谱中，降低固定相的粒径能够获得更高的分离柱效和更快的分析速度。近年来，1.7～2μm的小粒径色谱固定相倍受青睐，并成功实现了商品化。然而由于小粒径填料在此类色谱柱中反压过高而限制了其在传统液相色谱中的发展。Jerkovich A D等研究称当固定相粒径降低到1.5μm时，柱反压会达到55.16Mpa。

一些研究小组对1-2μm粒径的填料的制备及应用曾进行了一定的研究。亚微米二氧化硅填料在非手性的色谱中也有应用，主要是在毛细管电色谱(CEC)中的应用，亚微米二氧化硅在手性色谱中的应用还不十分常见，Feng AI等合成出了600-900nm的介孔环糊精键合二氧化硅填料，在超高液相色谱(UPLC)中实现了对手性药物的分离。Lai ShengLi等用巯基硅烷化试剂为连接臂制备出了粒径为500-800nm介孔环糊精键合的固定相，在毛细管电色谱(CEC)模式下分离了多种对映体。

和普通微米级粒径大小的填料相比，亚微米粒径填料有更高的柱效和更快的分析速度。和介孔填料和全多孔填料相比，无孔填料有更好的机械强度，使用寿命较长。而亚微米无孔手性毛细管柱的制备，及在加压毛细管电色谱的应用还未见报道。本发明为手性色谱填料向亚微米及纳米粒径方向的发展和其在加压毛细管电色谱中的应用提供了新思考，有较好的应用前景。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于制备一种手性分离效果好，柱效高，分析速度快，机械性能好，使用寿命长的亚微米手性毛细管柱，并将其应用在加压毛细管电色谱中，为手性色谱填料向亚微米及纳米粒径方向的发展提供新思路。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，包括如下步骤：

(1)采用改良的采法合成了亚微米粒径的表面光滑、均匀且单分散性良好的无孔二氧化硅微球：按比例将乙醇、TEOS(正硅酸四乙酯，CAS号：78-10-4)、氨水、水混合，常温搅拌反应15.7-16.3h，陈化后洗涤固相物、干燥；将所得固相物与盐酸混合，常温搅拌11.7-12.3h，固相物依次用去离子水、乙醇洗涤至中性，干燥即得盐酸活化的无孔二氧化硅微球；所述乙醇、TEOS、氨水、水的质量比为62-64：6.5-6.7：10.3-10.7：10.6-11.0；

(2)采用(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷为连接臂将β-环糊精(CAS号：24801-88-5)键合到步骤1所得无孔二氧化硅微球上，加入苯异氰酸酯对环糊精进行衍生化制备出手性固定相：按比例将β-环糊精、(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷置于吡啶中，气体保护下78-82℃反应11.7-12.3h，然后加入盐酸活化的无孔二氧化硅微球，所述β-环糊精、(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷、吡啶、活化无孔二氧化硅微球的质量比例为9.8-10.2：2.9-3.1：146-148：2.9-3.1，再补加吡啶，升温至98-102℃，气体保护下，继续反应19.7-20.3h；反应所得固相物依次用吡啶、甲苯、甲醇、乙醚洗涤得固定相CSP1，干燥备用；取CSP1、苯异氰酸酯置于吡啶中，CSP1、苯异氰酸酯、吡啶的质量比为0.95-1.05：5.4-5.6：73.4-73.6，88-92℃反应11.7-12.3h；反应所得固相物依次用吡啶、甲苯、甲醇、水、乙醚洗涤，得手性固定相CSP2；

本发明亚微米手性填料的合成过程为：采用改良的采法合成了粒径为800nm的表面光滑、均匀且单分散性良好的无孔二氧化硅微球，然后以(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷为连接臂将β-环糊精键合到二氧化硅微球上，加入苯异氰酸酯对环糊精进行衍生化制备出手性固定相，其技术路线如图2所示；

(3)色谱柱的装填：截取毛细管，将二氧化硅微球填入毛细管的一端，用加热器烧结成临时柱塞；将CSP2(800nm的环糊精手性填料)分散在乙醇(乙醇为分散液和顶替液)中制备得混悬液，灌入匀浆罐中制备获得匀浆液，将匀浆液打入毛细管中，填充至所需有效长度后用水打实，烧结柱塞和窗口，即得所述亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱。

在制备过程中，(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷为硅烷化试剂，苯异氰酸酯为环糊精衍生化试剂。

优选的，所述步骤1中，所述无孔二氧化硅微球的粒径为780-820nm。

反应的搅拌方式可采用本领域各种常用的搅拌方式，比如磁力搅拌等。

优选的，所述步骤1中，陈化后洗涤、干燥中，干燥的具体条件为80℃真空干燥。

优选的，所述步骤1中，固相物洗涤至中性、干燥中，干燥的具体条件为60℃真空干燥。

优选的，所述步骤1中，陈化的时间为11.7-12.3h。

优选的，所述步骤1中，盐酸的浓度为2.9-3.1mol/L。

更优选的，所述步骤1中，所述将所得固相物与盐酸混合时，固相物与盐酸的投料比为每1g固相物对应使用20ml盐酸。

优选的，所述步骤2中，补加的吡啶的量为先前使用的吡啶的量的30-35％。

优选的，所述步骤2中，气体保护所使用的气体为N₂。

优选的，所述步骤2中，β-环糊精取用前需先进行干燥。

优选的，所述步骤2中，盐酸活化的无孔二氧化硅微球使用前放在马弗炉中300℃干燥2h。

优选的，所述步骤2中，依次用吡啶、甲苯、甲醇、乙醚洗涤后得固定相CSP1。

优选的，所述吡啶为无水吡啶，所述甲苯为无水甲苯，所述甲醇为无水甲醇，所述乙醚为无水乙醚，所述乙醇为无水乙醇。

优选的，所述步骤2中，固定相CSP1干燥的具体条件为60℃真空干燥。

优选的，所述步骤2中，依次用吡啶、甲苯、甲醇、水、乙醚洗涤后得手性固定相CSP2。

优选的，所述步骤3中，毛细管的内径为50-280μm，长度为395-405mm，本领域技术人员可根据经验选择不同规格的毛细管内径。

优选的，所述步骤3中，二氧化硅微球预先经过液体硅酸钠润湿，粒径为2.9-3.1μm。

优选的，所述步骤3中，将二氧化硅微球填入毛细管的一端1.9-2.1mm。此处使用的二氧化硅微球为通过市售途径可直接购买获得的未经官能团修饰的二氧化硅微球。

优选的，所述步骤3中，将匀浆液打入毛细管中时使用高压气动泵，打入时起始压力为29-31MPa，之后逐渐上升到59-61MPa。

优选的，所述步骤3中，将匀浆液打入毛细管中，填充至有效长度99-101mm后用水打实。

本发明第二方面提供所述亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法在毛细管制备领域的用途。

如上所述，本发明所提供的亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法具有以下有益效果：

(1)根据Van Deemter方程，在液相色谱中，降低固定相的粒径能够获得更高的分离柱效和更快的分析速度。目前商品化的手性液相色谱填料多为3μm、5μm。本发明制备了亚微米手性固定相应用到加压毛细管电色谱(pCEC)中，柱效达170 000理论塔板数/米，其中在分离盐酸克伦特罗对映体时柱效达120 000理论塔板数/米，在分离酒石酸美托洛尔时柱效达140000理论塔板数/米。

(2)本发明所制备的亚微米手性填料因其特殊的无孔结构，使其具有更好的机械强度和更长的使用寿命。该亚微米填料进样400次后，和3μm全多孔填料柱子进样400次后对比，扫描电镜(SEM)显示，前者并未出现明显破损，而后者有近一半的微球表面发生了明显破损，且硅胶微球表面的微孔孔径大小不均。无孔二氧化硅颗粒的机械强度较全多孔的好，有更好的抗压能力，使命寿命也较全多孔二氧化硅颗粒的长。

(3)由于亚微米填料在传统液相色谱中容易产生高反压而限制了其在传统液相色谱中的发展，本发明所制备的手性填料特别适用在pCEC中，可以利用电渗流和压力流联合驱动，解决亚微米填料所产生的反压过高问题。

附图说明

图1显示为本发明亚微米无孔二氧化硅微球的电镜扫描图。

图2显示为本发明手性固定相CSP2的合成路线图。

图3显示为本发明无孔亚微米手性固定相的TG曲线图。

图4显示为本发明盐酸艾司洛尔的在pCEC系统中的手性分离图。

图5显示为本发明酒石酸美托洛尔的在pCEC系统中的手性分离图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本发明所述的固定相可以适用于加压毛细管电色谱(pCEC)、毛细管液相色谱(cLC)、电色谱(CEC)及超高效液相色谱(UPLC)，本发明所述的手性毛细管柱尤其适用于pCEC模式。

实施例1：

将一定比例的乙醇，TEOS(正硅酸四乙酯)，氨水(TEOS浓度0.25mol/L，氨水浓度3.0mol/L，反应温度20℃，采用磁力搅拌的方式)，水一次加入到圆底烧瓶中，所述乙醇、TEOS、氨水、水的质量比为62-64:6.5-6.7:10.3-10.7:10.6-11.0，常温磁力搅拌反应16h，陈化12h，依次用去离子水，无水乙醇洗涤，80℃真空干燥。取二氧化硅微球4g用3mol/L盐酸80ml常温搅拌12h，后洗涤至中性，60℃真空干燥即得盐酸活化的无孔二氧化硅微球，备用。二氧化硅颗粒场发射扫描电镜表征如图1。取干燥后的β-环糊精2g放入圆底烧瓶中，加入无水吡啶30ml，(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷0.6ml，N₂保护，80℃反应12h。然后加入0.6g盐酸活化的无孔二氧化硅微球(使用前放在马弗炉中300℃干燥2h)，补加吡啶10ml，升温至100℃，N₂保护，继续反应20h。反应停止后依次用无水吡啶，无水甲苯，甲醇，无水乙醚洗涤得固定相CSP1，60℃真空干燥备用。取CSP10.4g放入圆底烧瓶中，加入无水吡啶30ml，苯异氰酸酯2ml，90℃反应12h。反应停止后用无水吡啶，无水甲苯，甲醇，水，无水乙醚洗涤，得手性固定相CSP2。对所制得的二氧化硅微球进行BET法比较面积测试，结果为比表面积为15m²/g，孔径<2nm。对所制得的手性填料进行热重分析(图3)和元素分析(C2.99％，H1.33％，N<0.3％)，估算出环糊精的键合量为3.78μmol/m²。

实施例2：

色谱柱的装填：截取100μm内径的毛细管40cm，将液体硅酸钠润湿过的3μm二氧化硅微球(市售)填入毛细管的一端2mm左右，用加热器烧结成临时柱塞。将800nm的环糊精手性填料CSP2分散在无水乙醇中制备得混悬液，灌入匀浆罐中，用高压气动泵将匀浆液打入毛细管中，起始压力为30MPa，之后逐渐上升到60MPa，填充至有效长度为10cm后停止，用水打实，烧结柱塞和窗口，备用。

实施例3：

在加压毛细管电色谱(pCEC)模式下，通过电渗流和压力流联合驱动，实现了对多种手性药物的理想分离。例：图4为对盐酸艾司洛尔(消旋体，CAS No81161-17-3)的分离，检测条件：盐酸艾司洛尔用水溶解配制成0.5mg/mL样品溶液，将实施例2所得色谱柱装填于TriSep-2100GV加压毛细管电色谱仪(Unimicro Technologies,Inc.,Pleasanton,CA,USA)中，检测波长：262nm，进样量：1μL，分流管：50μm内径的毛细管2m，分流比：500:1，流动相：ACN/H₂O(30/70,V/V)含5mmol/L乙酸铵溶液，pH4，施加电压3kV，泵流速：0.03ml/min。

图5为对酒石酸美托洛尔的分离。检测条件：酒石酸美托洛尔(消旋体，CAS No56392-17-7)用水溶解配制成0.5mg/mL样品溶液，将实施例2所得色谱柱装填于TriSep-2100GV加压毛细管电色谱仪(Unimicro Technologies,Inc.,Pleasanton,CA,USA)中，检测波长：274nm，进样量：1μL，分流管：50μm内径的毛细管2m，分流比：500:1，流动相：ACN/H₂O(30/70,V/V)含5mmol/L乙酸铵溶液，pH4，施加电压3kV,泵流速：0.03ml/min。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，包括如下步骤：

(1)按比例将乙醇、TEOS、氨水、水混合，常温搅拌反应15.7-16.3h，陈化11.7-12.3h后，洗涤反应所得的固相物、干燥；将所得固相物与盐酸混合，常温搅拌11.7-12.3h，固相物依次用去离子水、乙醇洗涤至中性，干燥即得盐酸活化的无孔二氧化硅微球；所述乙醇、TEOS、氨水、水的质量比为62-64：6.5-6.7：10.3-10.7：10.6-11.0；

(2)按比例将β-环糊精、(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷置于吡啶中，气体保护下78-82℃反应11.7-12.3h，然后加入盐酸活化的无孔二氧化硅微球，所述β-环糊精、(3-异氰基丙基)三乙氧基硅烷、吡啶、活化的无孔二氧化硅微球的质量比例为9.8-10.2：2.9-3.1：146-148：2.9-3.1，再补加适量吡啶，升温至98-102℃，气体保护下，继续反应19.7-20.3h；反应所得固相物依次用吡啶、甲苯、甲醇、乙醚洗涤得固定相CSP1，干燥备用；取CSP1、苯异氰酸酯置于吡啶中，CSP1、苯异氰酸酯、吡啶的质量比为0.95-1.05：5.4-5.6：73.4-73.6，88-92℃反应11.7-12.3h；反应所得固相物依次用吡啶、甲苯、甲醇、水、乙醚洗涤，得手性固定相CSP2；

(3)截取毛细管，将二氧化硅微球填入毛细管的一端，用加热器烧结成临时柱塞；将CSP2分散在乙醇中制备得混悬液，灌入匀浆罐中制备获得匀浆液，将匀浆液打入毛细管中，填充至所需有效长度后用水打实，烧结柱塞和窗口，即得所述亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱。

2.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤1中，所述无孔二氧化硅微球的粒径为780-820nm。

3.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤1中，陈化的时间为11.7-12.3h。

4.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤1中，盐酸的浓度为2.9-3.1mol/L。

5.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤2中，盐酸活化的无孔二氧化硅微球使用前放在马弗炉中干燥。

6.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤3中，毛细管的内径为50-280μm，总长度为395-405mm。

7.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤3中，二氧化硅微球预先经过液体硅酸钠润湿，粒径为2.9-3.1μm，将二氧化硅微球填入毛细管的一端1.9-2.1mm。

8.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤3中，将匀浆液打入毛细管中时使用高压气动泵，打入时起始压力为29-31MPa，之后逐渐上升到59-61MPa。

9.如权利要求1所述的一种亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法，其特征在于，

所述步骤3中，将匀浆液打入毛细管中，填充至有效长度99-101mm后用水打实。

10.如权利要求1-9任一权利要求所述的亚微米无孔环糊精键合手性毛细管柱的制备方法在毛细管制备领域的用途。