CN104127914A - HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法；包括：第一步，将人工韧带表面超声波清洗处理，用钢砂进行摩擦，蒸馏水清洗，真空干燥；第二步，将明胶与钙源溶液混合，加入银、铜源，形成混合溶液，调节pH值，搅拌，将人工韧带浸泡混合溶液中，搅拌；第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入Na₂HPO₄溶液浸泡，搅拌，静置后滤纸吸干，重复矿化循环次数，即可。本发明通过仿生矿化的方法，在人工韧带表面以明胶作为矿化模板，形成矿化结构均匀且性能稳定的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层，该涂层修饰人工韧带，进而实现对人工韧带的表面改性，使其具有抗菌、抗炎性能，减少膝关节交叉韧带重建术后滑膜炎、感染等并发症。

Description

HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人工韧带的制备方法，具体地，涉及一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法。

背景技术

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带作为膝关节交叉韧带损伤重建的移植物选择，多项临床研究已证明其术后的中短期疗效及安全性较为满意，但仍因组织相容性问题，会出现滑膜炎、感染等并发症问题；且关节滑液内的炎症产物会破坏关节内结构，影响腱骨愈合。这些成为导致膝关节交叉韧带重建手术失败的重要因素之一。因此，提高PET材料的生物相容性，增加其抗菌、抗炎性能，减少人工韧带移植物本身材料缺陷所产生的术后移植部位炎症问题尤为重要。

在各种具有抗菌性能的无机金属离子当中,银离子和铜离子都具有较高的抗菌性。银离子和铜离子具有通过与细菌中酶蛋白的巯基-SH迅速结合的能力，使一些以此为必要功能酶失活而无法生存，从而达到杀灭细菌、修复组织、促进伤口的愈合作用，同时也具有治疗和预防细菌、真菌的作用。从目前的研究开发来看，银和铜抗菌剂具有安全性高、耐热性好、抗菌范围较广、持续杀菌的有效期长、能够促进伤口的愈合、细胞的生长及受损细胞的修复，无任何毒性反应等优点。

但是，目前仍没有利用银和铜抗菌剂对仿生人工韧带修饰的文献和专利报道。本发明针对现有技术的不足，采用明胶诱导HAp掺杂银和铜的矿化形成有机/无机杂化体的结构和性能。这种技术模拟自然骨的生物矿化机制，将天然高分子或蛋白质作为基质或模版沉积磷灰石无机盐层，在材料表面进行复合抗菌涂层，从而改善材料的生物相容性及骨传导性、且使人工韧带具有抗菌、抗炎性能，使之在生物活性和力学性能方面满足临床医学的要求。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，所述方法包括如下步骤：

第一步，人工韧带的预处理，将人工韧带表面超声波清洗处理，用钢砂进行摩擦，蒸馏水清洗，真空干燥；

第二步，将明胶与钙源溶液混合，加入银源和铜源，搅拌形成混合溶液，调节pH值，搅拌，将人工韧带浸泡混合溶液中，搅拌反应；

第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入Na₂HPO₄溶液浸泡，搅拌，静置后滤纸吸干，重复矿化循环次数，得HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层。

第二步中，调节pH值为7～8，搅拌时间为5分钟，使体系中游离的Ca与Ag和铜离子与明胶中氨基残基充分结合。

优选地，第一步中，所述超声波清洗处理的时间为20～60min。

优选地，第一步中，所述钢砂为表面粗糙度25～100um的钢砂。

优选地，第二步中，所述钙源为氯化钙、磷酸氢钙、碳酸钙、硫酸钙的一种或者几种的混合。

优选地，第二步中，所述银源为硝酸银、溴化银、氧化银中的一种或者几种的混合。

优选地，第二步中，所述铜源为硝酸铜、硫酸铜、碳酸铜、氧化铜的一种或者几种的混合。

优选地，第二步中，所述明胶为猪源明胶、牛源明胶或兔源明胶。

优选地，第三步中，所述浸泡温度为25℃，所述搅拌时间为10～45分钟。

优选地，第三步中，所述矿化循环次数为10～30次。

优选地，所述银和铜抗菌剂复合涂层厚度为10～500nm。

本发明通过利用仿生矿化的方法，在人工韧带表面以明胶作为矿化模板，形成矿化结构均匀且性能稳定的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层，该涂层修饰人工韧带，进而实现对人工韧带的表面改性，使其具有抗菌、抗炎性能，减少膝关节交叉韧带重建术后滑膜炎、感染等并发症，促进人工韧带在膝关节交叉韧带重建中的临床应用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明方法采用的仿生无机磷灰石层沉积于类似人体组织内环境条件，其成分更接近于人体骨无机质，从而提高材料的生物相容性和骨结合能力；

(2)本发明方法制得的银和铜抗菌剂复合涂层修饰人工韧带，改善现有人工韧带的生物相容性、力学性能，使本发明产品具有抗菌、抗炎性能，促进腱骨愈合等特性；

(3)本发明方法在低温条件下进行，条件温和，工艺易于推广；

(4)本发明方法可在结构复杂的材料上生成较为均匀的涂层，可解决前期研究中通过在材料表面应用直接人工涂覆的方法而造成的涂层不均匀、稳定性较差的问题。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1所制备的新型人工韧带对不同菌株的抑制效果对比图；

图2为实施例1表面处理前后的PET人工韧带与293T细胞共培养不同时间的MTT检测结果对比图；

图3为实施例1表面处理前后的PET人工韧带与BMCS细胞共培养不同时间的ALP检测结果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，所述方法包括如下步骤：

第一步，人工韧带的预处理，将人工韧带表面超声波清洗处理30min，用表面粗糙度为50um的钢砂反复摩擦5次，用蒸馏水冲洗3遍，真空干燥；

第二步，以水为溶剂，将1毫升25毫摩尔/升的CaSO₄、Ag源(硝酸银：溴化银＝1:1混合)和CuSO₄以及5毫升25毫克/升的牛源明胶溶液混合，调节pH值到8，25℃下搅拌5分钟，然后将人工韧带浸泡于此混合液中，搅拌反应30min，使体系中游离的Ca与Ag和铜离子与明胶中氨基残基充分结合；

第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入5毫升50毫摩尔/升新鲜制备的NaHPO₄溶液浸泡，在25℃下搅拌反应45分钟，重复以上步骤10次，得到羟基磷灰石掺杂银和铜复合明胶50～500nm的矿化涂层修饰的新型人工韧带。

检测方法

通过体外抗菌实验，将受试菌按照在各自生长适宜条件下制备好的菌悬液，控制茵液浓度为10⁵-10⁷CFU/mL，分装50mL的三角瓶，每瓶各20mL菌悬液，分别加入预先灭好菌的新型人工韧带，同时设未做表面处理的人工韧带作为阴性对照。37℃、150r/min的摇床处理2h后，采用梯度稀释平板菌落计数法计算菌悬液中活菌数。根据处理后菌悬液活菌数的差异，计算出材料对细菌的抑制率。如图1，发现经过表面涂层修饰后，新型人工韧带不仅对常见的菌株如大肠杆菌、金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑根霉菌的抑制率都在90％以上，而且对耐药病原菌如化脓链球菌、耐药肠球菌和淋球菌等的抑制率都在90％以上，说明本发明实施例1所制备的新型人工韧带具有良好的抑菌效果。

进一步的体外细胞毒性实验，将高压湿热灭菌的新型人工韧带加入10mL MEM完全培养基，37℃浸提36h，离心取上清为原始材料浸提液。复苏293T细胞，DMEM培养基生长至对数生长期，消化传代，接种96孔板。24h后待细胞贴壁长好，加入原始材料浸提液，同时设置PET人工韧带浸提液处理细胞作为对照组。继续培养不同时间后，MTT法测定细胞成活率。如图2，说明本发明实施例1所制备的新型人工韧带对细胞的生长和增殖具有极低的影响，同时涂层修饰也有效增加了细胞在表面的粘附和生长。

随后，通过培养骨髓间充质(BMCS)细胞，DMEM培养基生长至对数生长期，消化传代，24h后待细胞贴壁长好，加入原始材料浸提液，同时设置未表面处理PET人工韧带浸提液处理细胞作为对照组。继续培养不同时间后，通过碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定细胞的ALP活性。如图3，说明本发明实施例1所制备的新型人工韧带相较于未处理的PET人工韧带具有效诱导细胞的成骨分化的功能，有助于腱骨愈合。

实施例2

本实施例涉及一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，所述方法包括如下步骤：

第一步，人工韧带的预处理，将人工韧带表面超声波清洗处理30min，用表面粗糙度为50um的钢砂反复摩擦5次，用蒸馏水冲洗3遍，真空干燥；

第二步，以水为溶剂，将5毫升15毫摩尔/升的CaCO₃、AgNO₃和CuSO₄以及5毫升25毫克/升的猪源明胶溶液混合，调节pH值到7，25℃下搅拌5分钟，然后将人工韧带浸泡于此混合液中，搅拌反应45min，使体系中游离的Ca与Ag和铜离子与明胶中氨基残基充分结合；

第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入10毫升50毫摩尔/升新鲜制备的NaHPO₄溶液浸泡，在25℃下搅拌反应45分钟，重复以上步骤20次，得到羟基磷灰石掺杂银和铜复合明胶50-500nm的矿化涂层修饰的新型人工韧带。

本实施例测试方法与实施例1相同。

实施例3

本实施例涉及一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，所述方法包括如下步骤：

第一步，人工韧带的预处理，将人工韧带表面超声波清洗处理30min，用表面粗糙度为25-50um的钢砂反复摩擦10次，用蒸馏水冲洗3遍，真空干燥；

第二步，以水为溶剂，将5毫升15毫摩尔/升的CaCO₃、AgNO₃和铜源(硝酸铜：硫酸铜＝2:1混合)以及5毫升25毫克/升的兔源明胶溶液混合，调节pH值到8，25℃下搅拌5分钟，然后将人工韧带浸泡于此混合液中，搅拌反应15min，使体系中游离的Ca与Ag和铜离子与明胶中氨基残基充分结合；

第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入20毫升25毫摩尔/升新鲜制备的NaHPO₄溶液浸泡，在25℃下搅拌反应10分钟，重复以上步骤30次，得到羟基磷灰石掺杂银和铜复合明胶50-500nm的矿化涂层修饰的新型人工韧带。

本实施例测试方法与实施例1相同。

实施例4

本实施例涉及一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，所述方法包括如下步骤：

第一步，人工韧带的预处理，将人工韧带表面超声波清洗处理30min，用表面粗糙度为50-100um的钢砂反复摩擦10次，用蒸馏水冲洗3遍，真空干燥；

第二步，以水为溶剂，将5毫升15毫摩尔/升的CaSO₄、银源(硝酸银：溴化银＝1:1混合)和铜源(硝酸铜：硫酸铜＝2:1混合)以及5毫升25毫克/升的兔源明胶溶液混合，调节pH值到8，25℃下搅拌5分钟，然后将人工韧带浸泡于此混合液中，搅拌反应15min，使体系中游离的Ca与Ag和铜离子与明胶中氨基残基充分结合；

第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入20毫升25毫摩尔/升新鲜制备的NaHPO₄溶液浸泡，在25℃下搅拌反应10分钟，重复以上步骤30次，得到羟基磷灰石掺杂银和铜复合明胶50-500nm的矿化涂层修饰的新型人工韧带。

本实施例测试方法与实施例1相同。

综上所述，本发明通过利用仿生矿化的方法，在人工韧带表面以明胶作为矿化模板，形成矿化结构均匀且性能稳定的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层，该涂层修饰人工韧带，进而实现对人工韧带的表面改性，使其具有抗菌、抗炎性能，减少膝关节交叉韧带重建术后滑膜炎、感染等并发症，促进人工韧带在膝关节交叉韧带重建中的临床应用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

第一步，人工韧带的预处理，将人工韧带表面超声波清洗处理，用钢砂进行摩擦，蒸馏水清洗，真空干燥；

第二步，将明胶与钙源溶液混合，加入银源和铜源，搅拌形成混合溶液，调节pH值，搅拌，将人工韧带浸泡混合溶液中，搅拌反应；

第三步，取出人工韧带用，滤纸吸干，放入Na₂HPO₄溶液浸泡，搅拌，静置后滤纸吸干，重复矿化循环次数，得HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层。

2.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第一步中，所述超声波清洗处理的时间为20～60min。

3.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第一步中，所述钢砂为表面粗糙度25～100um的钢砂。

4.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第二步中，所述钙源为氯化钙、磷酸氢钙、碳酸钙、硫酸钙的一种或者几种的混合。

5.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第二步中，所述银源为硝酸银、溴化银、氧化银中的一种或者几种的混合。

6.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第二步中，所述铜源为硝酸铜、硫酸铜、碳酸铜、氧化铜的一种或者几种的混合。

7.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第二步中，所述明胶为猪源明胶、牛源明胶或兔源明胶。

8.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第三步中，所述浸泡温度为25℃，所述搅拌时间为10～45分钟。

9.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，第三步中，所述矿化循环次数为10～30次。

10.如权利要求1所述的HAp掺合银和铜抗菌剂复合涂层的制备方法，其特征在于，所述银和铜抗菌剂复合涂层厚度为10～500nm。