CN104115988B - 无需热处理生产油菜蛋白分离物 - Google Patents

Abstract

处理由油菜蛋白微胶粒团沉积产生的上清液以提供一种油菜蛋白分离物，其可溶于水相酸性环境。

Description

无需热处理生产油菜蛋白分离物

本申请是2009年8月18日提交的题为“无需热处理生产油菜蛋白分离物”的国家申请号为200980142164.5(PCT/CA2009/001147)的发明专利申请的分案申请。

相关申请的参考

本申请根据35USC119(e)要求2008年8月18日提交的美国临时专利申请61/136,193的优先权。

技术领域

本发明涉及生产油菜(canola)蛋白分离物。

背景技术

具有至少100wt％(N x6.25)蛋白含量的油菜油籽蛋白分离物可通过如共同待审的2002年5月3日提交的美国专利申请10/137,391(美国专利申请公布说明书2003-0125526A1和WO02/089597)和2004年6月9日提交的美国专利申请10/476,230(美国专利申请公布说明书2004-0254353A1)中所述的过程从油籽粕中产生，所述专利申请转让给其受让人，且其公开通过引用结合到本文中。所述步骤涉及一种多步方法，其包含使用一种盐水溶液提取油菜油籽粕，从残余油籽粕中分离所产生的蛋白水溶液，通过使用选择性膜技术提高所述水溶液的蛋白浓度到至少约200g/L同时保持离子强度基本不变，稀释所得到的浓缩蛋白溶液到冷水中以引起蛋白微胶粒形成，沉降所述蛋白微胶粒以形成一种无定形、粘性、胶状、类谷蛋白的蛋白微胶粒团(PMM)，以及从具有至少约100wt％(N x6.25)蛋白含量的上清液中回收所述蛋白微胶粒团。当用于本文时，蛋白含量基于干重测定。所回收的PMM可干燥。

在所述方法的一个实施方案中，处理来自PMM沉降步骤的上清液以从所述上清液中回收油菜蛋白分离物。该步骤可通过使用超滤膜初始浓缩所述上清液和干燥所述浓缩物实现。所得到的油菜蛋白分离物具有至少约90wt％，优选地至少约100wt％(N x6.25)的蛋白含量。

美国专利申请10/137,391中所述的步骤主要是批量步骤。在共同待审的2002年11月19日提交的美国专利申请10/298,678(美国专利申请公布说明书2004-0039174A1和WO03/043439)和2005年3月5日提交的美国专利申请10/496,071(美国专利申请公布说明书2003-0015910A1)中，描述了一种生产油菜蛋白分离物的连续过程，所述专利申请转让给其受让人，且其公开通过引用结合到本文中。根据该过程，油菜油籽粕与一种盐水溶液连续混合，混合物通过管道输送同时从油菜油籽粕中提取蛋白以形成蛋白水溶液，所述蛋白水溶液通过选择性膜操作连续输送以提高所述蛋白水溶液的蛋白含量到至少约50g/L，同时保持离子强度基本不变，所得到的浓缩蛋白溶液与冷水连续混合以引起蛋白微胶粒形成，所述蛋白微胶粒不断沉降同时上清液不断溢出直至沉降容器中积累所需数量的PMM。所述PMM从沉降容器中回收并可以干燥。所述PMM的蛋白含量至少约90wt％(N x6.25)，优选地至少约100wt％。可处理溢出的上清液以回收其中的油菜蛋白分离物，如上所述。

已知油菜种子包含约10到约30wt％蛋白，并且已鉴定多种不同蛋白成分。这些蛋白包括一种12S球蛋白，称为十字花科蛋白，一种7S蛋白和一种2S储藏蛋白，称为油菜小蛋白。如共同待审的2003年4月15日提交的美国专利申请10/413,371(美国专利申请公布说明书2004-0034200A1和WO03/088760)和2005年4月29日提交的美国专利申请10/510,766(美国专利申请公布说明书2005-0249828A1)所述，涉及浓缩蛋白水溶液稀释以形成PMM和处理上清液以回收另外蛋白的上述步骤可回收不同蛋白谱的分离物，所述专利申请转让给其受让人，且其公开通过引用结合到本文中。

在这方面，源于PMM的油菜蛋白分离物的蛋白成分组成为约60到约98wt％的7S蛋白，约1到约15wt％的12S蛋白和0到约25wt％的2S蛋白。源于上清液的油菜蛋白分离物的蛋白成分组成为约60到约95wt％的2S蛋白，约5到约40wt％的7S蛋白和0到约5wt％的12S蛋白。因此，源于PMM的油菜蛋白分离物主要为7S蛋白，而源于上清液的油菜蛋白分离物主要为2S蛋白。如上述美国专利申请10/413,371所述，所述2S蛋白的分子量为约14,000道尔顿，所述7S蛋白的分子量为约145,000道尔顿，所述12S蛋白的分子量为约290,000道尔顿。

在共同待审的2005年1月21日提交的美国专利申请11/038,086(美国专利公布说明书2005-0181112A1和WO2005/067729)和2008年6月20日提交的美国专利申请12/213,500中，描述了一种步骤，其中上清液被热处理以沉积7S蛋白并产生富集2S蛋白的蛋白水溶液，所述专利申请转让给其受让人，且其公开通过引用结合到本文中。所述蛋白水溶液可干燥以产生富集2S的油菜蛋白分离物。所述油菜蛋白分离物具有多种益处，包括在广泛酸性pH值范围内的可溶性和在水相介质中的澄清性，例如使制备蛋白强化饮料成为可能，尤其是在酸性pH值，其中添加油菜蛋白分离物不损害澄清度。

油菜也称为油菜籽或芸苔(oil seed rape)。

发明内容

现在已发现可无需热处理步骤制备与富集2S蛋白的油菜蛋白分离物性质相同的产品。去除热处理步骤可改进颜色和味道并提高总产量，因为7S蛋白无需从上清液中去除。所得到的油菜蛋白分离物不仅在低pH下的水中完全可溶、透明、并且热稳定，而且通常植酸含量低。在低pH的溶液中热稳定允许热处理例如热灌装应用。所述油菜蛋白分离物可用于人类消费的产品，例如用于尤其是软饮料和运动饮料，以及其它水相系统的蛋白强化，而无蛋白沉淀。所述油菜蛋白分离物也可用于非人类食品应用，例如宠物食品和水产业。

根据本发明的一个方面，提供了一种制备具有基于干重的至少约90wt％(Nx6.25)蛋白含量的油菜蛋白分离物的方法，其包含：

向油菜蛋白微胶粒团沉淀产生的上清液中加入钙盐，优选为氯化钙，以提供约5mS到约30mS的传导率，优选约8到约10mS，以形成植酸钙沉淀，

从所得到的溶液中去除沉淀的植酸钙以产生澄清溶液，

任选调节所述澄清溶液的pH值至约2.0到约4.0，优选约2.9到约3.2，例如通过加入盐酸，

将任选调节pH的澄清溶液浓缩至蛋白含量至少约50g/L，优选约50到约500g/L，更优选约100到约250g/L，以产生澄清的浓缩油菜蛋白溶液，

任选渗滤所述澄清的浓缩油菜蛋白溶液，例如使用多倍体积的pH3的水，

任选进行脱色步骤，例如颗粒活性碳处理，以及

干燥所述浓缩蛋白溶液。

在加入钙盐之前上清液可部分浓缩至中间浓度。去除所形成的沉淀，所得到的溶液如上所述酸化，进一步浓缩至终浓度，然后任选渗滤并干燥。

备选地，上清液可首先浓缩至终浓度，向浓缩上清液中加入钙盐，去除所得到的沉淀，酸化溶液，然后任选渗滤并干燥。

在上述方法的另一种变型中，起初向上清液中加入少量钙盐，使其不形成沉淀，酸化溶液并部分浓缩至中间浓度，向部分浓缩的上清液中加入另外数量的钙盐并形成沉淀。

去除沉淀，浓缩溶液至其终浓度并任选渗滤并干燥。

在上述步骤中一种选择为省略去除沉淀，这导致产品中的植酸盐含量更高。在此步骤中，向上清液加入钙盐，部分浓缩上清液或完全浓缩上清液并且不去除沉淀。酸化导致沉淀再溶解。

另一种选择为省略酸化并在自然pH下进行溶液处理。在这种选择中，向上清液加入钙盐，部分浓缩上清液或浓缩上清液以形成沉淀并去除。然后如上所述处理所得到的溶液而没有酸化步骤。

当上清液在加入钙盐之前部分浓缩和去除沉淀之后完全浓缩时，所述上清液首先浓缩至蛋白浓度约50g/L或以下，并且在去除沉淀之后，再浓缩至浓度至少约50g/L，优选约50到约500g/L，更优选约100到约250g/L。

在本发明的一个实施方案中，钙盐可在两个阶段加入。在此实施方案中，向上清液加入少量钙以使传导率为约1mS到约3.5mS，优选约1mS到约2mS，其不足以引起沉淀形成。

酸化所得到的溶液并在上述条件下部分浓缩。向部分浓缩的溶液中加入剩余的钙盐以使传导率为约4mS到约30mS，优选约4到约10mS，以引起沉淀形成。然后去除沉淀。然后在上述条件下浓缩所得到的澄清溶液。

根据本文所述方法生产的油菜蛋白分离物可用于蛋白分离物的常规应用，例如，加工食品和饮料的蛋白强化，油的乳化，烘焙商品的成型剂和含气产品的发泡剂。另外，所述油菜蛋白分离物可形成蛋白纤维，用于人造肉，在蛋白用作粘合剂的食物产品中可用作蛋白替代物或膨胀剂。所述油菜蛋白分离物可用作营养补充剂。所述油菜蛋白分离物的其它用途还在宠物食品、动物饲料，工业和化妆品应用，以及个人护理产品中体现。

详细说明

提供油菜蛋白分离物的方法的起始步骤涉及从油菜油籽粕中溶解蛋白原料。从油菜籽粕中回收的蛋白原料可为油菜种子中天然存在的蛋白，或者所述蛋白原料可为基因操作修饰的蛋白但具有天然蛋白的特征性疏水和极性性质。所述油菜粕可为从含有不同水平的非变性蛋白的油菜油籽中去除油菜油产生的任何油菜粕，例如由热正己烷提取或冷油压榨方法产生。从油菜油籽中去除油菜油通常作为本文所述的蛋白分离物回收步骤中的一个单独操作进行。

蛋白溶解最有效地通过使用食品级盐溶液进行，因为盐的存在增强可溶性蛋白从油籽粕中去除。当油菜蛋白分离物意在用于非食品用途，可使用非食品级化学品。所述盐通常为氯化钠，尽管可使用其它盐，例如氯化钾。所述盐溶液的离子强度至少约0.05，优选至少约0.10，以进行大量蛋白的溶解。随着盐溶液离子强度升高，油籽粕中蛋白的溶解程度开始增加直至达到最大值。离子强度的任何随后升高不增加溶解的总蛋白。达到最大蛋白溶解的食品级盐溶液的离子强度随相关盐和选择的油籽粕变化。

鉴于升高离子强度的蛋白沉淀需要更大程度的稀释，通常优选使用低于约0.8的离子强度值，更优选约0.1到约0.15的值。

在分批过程中，蛋白的盐溶解在约5℃到约75℃温度进行，优选地伴随搅拌以减少溶解时间，通常约10到约60分钟。优选进行溶解以从油籽粕中提取基本上尽可能多的蛋白，由此产生总体高产品产率。

选择约5℃的低温限度是因为低于此温度溶解慢得不切实际，而选择约75℃的优选高温限度是由于某些现有蛋白的变性温度。

在连续方法中，从油菜油籽粕中提取蛋白以符合实现从油菜油籽粕中连续提取蛋白的任何方式进行。在一个实施方案中，油菜油籽粕与食品级盐溶液连续混合，所述混合物通过管道或导管输送，其长度和流速使停留时间足以根据本文所述参数进行所需提取。在这种连续过程中，盐溶解步骤在长达约10分钟的时间内快速进行，优选地进行溶解以从油菜油籽粕中提取基本上尽可能多的蛋白。在连续过程中的溶解在约10℃到约75℃之间，优选约15℃到约35℃之间的温度下进行。

所述食品级盐水溶液通常pH约5到约6.8，优选约5.3到约6.2。通过按需要使用任何便利的酸，通常为盐酸，或者碱，通常为氢氧化钠，所述盐溶液的pH可调节至约5到约6.8范围内的任何所需值用于提取步骤。

在溶解步骤中食品级盐溶液中油籽粕的浓度可广泛变化。通常浓度值为约5到约15％w/v。

使用盐水溶液的蛋白提取步骤具有溶解油菜粕中可能存在的脂肪的附加作用，其随之导致水相中存在脂肪。

提取步骤产生的蛋白溶液通常蛋白浓度为约5到约40g/L，优选约10到约30g/L。

所述盐水溶液可包含抗氧化剂。所述抗氧化剂可为任何便利的抗氧化剂，例如亚硫酸钠或抗坏血酸。使用的抗氧化剂的量可在溶液的约0.01到约1wt％之间变化，优选约0.05wt％。所述抗氧化剂用于抑制蛋白溶液中酚的氧化。

然后提取步骤产生的水相可以任何便利的方式从残余油菜粕中分离，例如通过使用沉降式离心机，然后通过圆盘离心和/或过滤去除残余粕。分离的残余粕可干燥弃用。

最终油菜蛋白分离物的颜色可改进为浅色或淡黄色，其通过将粉末活性碳或其它色素吸附剂与分离的蛋白水溶液混合，随后通过过滤方便地去除吸附剂，以提供蛋白溶液。渗滤也可用于去除色素。

这种色素去除步骤可使用任何合适的色素吸附剂在任何便利的条件下进行，通常在分离的蛋白水溶液的环境温度下进行。对于粉末活性碳，使用的量为约0.025％到约5％w/v，优选约0.05％到约2％w/v。

如美国专利5,844,086和6,005,076所述，当油菜籽粕包含大量脂肪时，则其中所述的脱脂步骤可在下述分离的蛋白水溶液和浓缩的蛋白水溶液中进行，所述专利申请转让给其受让人，且其公开通过引用结合到本文中。当进行颜色改进步骤时，该步骤可在第一次脱脂步骤之后进行。

作为使用盐水溶液提取油籽粕的一种替代，可单独使用水进行提取，虽然单独使用水倾向于比盐水溶液从油籽粕中提取的蛋白少。当使用该替代时，为了在下述浓缩步骤中保持溶液中的蛋白，在蛋白溶液从残余油籽粕中分离后可加入上述浓度的盐。当进行第一次脱脂步骤时，通常在该操作完成后加入盐。

另一种替代方法为使用高于约6.8的相对高pH值的食品级盐溶液提取油籽粕，通常高达约9.9。食品级盐溶液的pH可使用任何便利的食品级碱，例如氢氧化钠水溶液调节至所需碱性值。备选地，可使用低于约pH5的相对低pH的盐溶液提取油籽粕，通常低至约pH3。当使用该替代时，则油籽粕提取步骤产生的水相以任何便利的方式从残余油菜粕中分离，例如通过使用沉降式离心，然后通过圆盘离心和/或过滤去除残余粕。分离的残余粕可干燥弃用。

然后高或低pH提取步骤产生的蛋白水溶液在下述进一步处理之前如上所述调节pH至约5到约6.8的范围，优选约5.3到约6.2的范围。视情况可使用任何便利的酸，例如盐酸，或者碱，例如氢氧化钠，进行该pH调节。

浓缩蛋白水溶液以提高其蛋白浓度，同时保持其离子强度基本恒定。通常进行该浓缩以产生浓缩的蛋白溶液，其蛋白浓度至少约50g/L，优选至少约200g/L，更优选至少约250g/L。

浓缩步骤可根据分批或连续操作以任何便利的方式进行，例如通过使用任何便利的选择性膜技术，例如超滤或渗滤，使用的膜例如中空纤维膜或螺旋卷式膜，其根据不同膜材料和构造具有合适的分子量截断值，例如约3,000到约100,000道尔顿，优选约5,000到约10,000道尔顿，并且对于连续操作，其尺寸允许所需的浓度级别使蛋白水溶液通过膜。

众所周知，超滤和类似的选择性膜技术允许低分子量种类通过膜同时防止高分子量种类通过膜。低分子量种类不仅包括食品级盐的离子种类，而且包括从原料中提取的低分子量物质，例如糖类、色素和抗营养因子，以及蛋白的任何低分子量形式。根据不同膜材料和构造，通常选择膜的分子量截断值以确保在溶液中保留蛋白的大部分，同时允许杂质通过。

然后使用与提取溶液相同极性和pH的盐水溶液对浓缩蛋白溶液进行渗滤步骤。所述渗滤可使用约2到约20体积的渗滤溶液，优选约5到约10体积的渗滤溶液进行。在渗滤操作中，通过使渗透物穿过膜从蛋白水溶液中去除更多杂质。可进行该渗滤操作直至渗透物中不含明显更多杂质和可见颜色。可使用与浓缩步骤相同的膜进行所述渗滤。但是，如果需要，可使用具有不同分子量截断值的单独的膜进行所述渗滤步骤，例如根据不同膜材料和构造，使用分子量截断值范围在约3,000到约100,000道尔顿，优选约5,000到约10,000道尔顿的膜。

在至少部分渗滤步骤中在渗滤介质中可存在抗氧化剂。所述抗氧化剂可为任何便利的抗氧化剂，例如亚硫酸钠或抗坏血酸。在渗滤介质中使用的抗氧化剂的量取决于使用的材料，可在约0.01到约1wt％之间变化，优选约0.05wt％。抗氧化剂用于抑制浓缩油菜蛋白分离物溶液中存在的酚的氧化。

浓缩步骤和渗滤步骤可在任何便利的温度进行，通常约20℃到约60℃，优选约20到约30℃，并持续一段时间以达到所需浓度级别。使用的温度和其它条件某种程度上取决于进行浓缩使用的膜装备和所需的溶液蛋白浓度。

如果需要，浓缩以及任选渗滤的蛋白溶液可进行进一步脱脂操作，如美国专利5,844,086和6,005,076中所述。

浓缩以及任选渗滤的蛋白溶液可进行脱色操作，作为上述脱色操作的替代。此处可使用粉末活性碳以及颗粒活性碳(GAC)。可用作颜色吸附剂的另一种材料为聚乙烯吡咯烷酮。

颜色吸附剂处理步骤可在任何便利的条件下进行，通常在油菜蛋白溶液的环境温度。对于粉末活性碳，可用的量为约0.025％到约5％w/v，优选约0.05％到约2％w/v。当聚乙烯吡咯烷酮用作颜色吸附剂时，可用的量为约0.5％到约5％w/v，优选约2％到约3％w/v。颜色吸附剂可通过任何便利的方式从油菜蛋白溶液中去除，例如通过过滤。

任选的脱色步骤得到的浓缩以及任选渗滤的蛋白溶液可进行巴氏消毒以减少微生物载量。所述巴氏消毒可在任何所需的巴氏消毒条件下进行。通常，浓缩以及任选渗滤的蛋白溶液加热至温度约55℃到70℃，优选约60℃到约65℃，持续时间约10到约15分钟，优选约10分钟。然后巴氏消毒的浓缩蛋白溶液可冷却用于下述进一步处理，优选冷却至温度约25℃到约40℃。

取决于浓缩步骤和任选渗滤步骤使用的温度，以及是否进行巴氏消毒步骤，浓缩蛋白溶液可加热至温度至少约20℃，及高达约60℃，优选约25℃到约40℃，以降低浓缩蛋白溶液的粘度，以利于进行随后的稀释步骤和微胶粒形成。浓缩蛋白溶液不应加热超过一定温度，在该温度之上用冷水稀释不能发生微胶粒形成。

然后浓缩步骤、和任选的渗滤步骤、任选的脱色步骤、任选的巴氏消毒步骤以及任选的脱脂步骤产生的浓缩蛋白溶液被稀释以进行微胶粒形成，其通过混合该浓缩蛋白溶液与达到所需稀释程度必需体积的冷水。取决于需要通过微胶粒途径获得的油菜蛋白的比例和来自上清液的油菜蛋白的比例，浓缩蛋白溶液的稀释程度可变化。通常，在较低稀释水平，较大比例的油菜蛋白保留在水相中。

当需要通过微胶粒途径提供最大比例的蛋白时，该浓缩蛋白溶液被稀释约5倍到约25倍，优选约10倍到约20倍。

与浓缩蛋白溶液混合的冷水温度低于约15℃，通常约1℃到约15℃，优选低于约10℃，因为在使用的稀释倍数下在所述较冷温度下获得了蛋白微胶粒团形式的蛋白分离物的改进产率。

在分批操作中，浓缩蛋白溶液分批加入到所需体积冷水的静态水体中，如上所述。浓缩蛋白溶液的稀释和随后离子强度的降低导致以微胶粒形式形成离散蛋白小滴形式的高度关联蛋白分子云状团。在分批步骤中，蛋白微胶粒允许在冷水水体中沉降以形成聚集的、结合的、密集的、无定形粘性的类谷蛋白的蛋白微胶粒团(PMM)。沉降可例如通过离心协助。所述诱导的沉降降低蛋白微胶粒团的液体含量，由此降低含水量，其通常从以微胶粒团总重量计约70％到以重量计约95％降至通常以重量计约50％到以重量计约80％。以此方式降低微胶粒团的含水量也降低微胶粒团的吸收盐含量，并因此降低干燥分离物的盐含量。

备选地，稀释操作可连续进行，其通过使浓缩蛋白溶液连续通过T形管的一个入口，而稀释水供应到T形管的另一个入口，允许在管中混合来进行。稀释水供应到T形管的速率足以达到所需的浓缩蛋白溶液稀释程度。

浓缩蛋白溶液和稀释水在管中的混合启动蛋白微胶粒的形成，且混合物从T形管出口连续供应到沉降容器，当充满时，上清液允许从其中溢出。优选地以将液体的波动减至最小的方式将混合物供应到沉降容器液体中。

在连续过程中，蛋白微胶粒允许在沉降容器中沉降以形成聚集的、结合的、密集的、无定形的、粘性的、类谷蛋白的蛋白微胶粒团(PMM)，且该过程持续直至所需量的PMM积累在沉降容器的底部，然后积累的PMM从沉降容器移除。作为通过沉淀进行沉降的替代，PMM可通过离心连续分离。

根据从初始粕提取物中回收蛋白微胶粒团形式的蛋白而言，浓缩蛋白溶液至优选的至少约200g/L蛋白含量的方法参数组合和使用约10到约20的稀释倍数产生更高的产率，通常是显著更高的产率，以及根据蛋白含量而言，其产生比使用上述美国专利所述的任何已知现有技术的蛋白分离物形成方法获得的分离物更纯的分离物。

与分批方法比较，通过使用回收油菜蛋白分离物的连续方法，对于相同蛋白提取水平，起始蛋白提取步骤可显著减少时间，并可在提取步骤中使用明显更高的温度。另外，在连续操作中比在分批过程中更少机会污染，产生更高的产品质量，并且该方法可在更紧凑的设备中进行。

沉降的PMM从残余水相或上清液中分离，例如通过将残余水相从沉降团中倾析或通过离心。PMM可以潮湿形式使用，或者可通过任何便利的技术，例如喷雾干燥或冻干，干燥成干燥形式。干燥PMM蛋白含量高，超过约90wt％蛋白，优选地至少约100wt％蛋白(以Nx6.25计算)，并基本上未变性(由差示扫描量热法确定)。从脂肪油籽粕中分离的干燥PMM也具有低残留脂肪含量，如果必需，当使用美国专利5,844,086和6,005,076的方法时，其可低于约1wt％。

如上述美国专利申请10/413,371所述，PMM主要由7S油菜蛋白组成，其蛋白成分组成为约60到98wt％的7S蛋白，约1到约15wt％的12S蛋白和0到约25wt％的2S蛋白。

来自PMM形成和沉降步骤的上清液包含大量油菜蛋白，其未在稀释步骤沉淀，并被处理以从其中回收油菜蛋白分离物。如上述美国专利申请10/413,371所述，源自上清液的油菜蛋白分离物主要由2S油菜蛋白组成，其蛋白成分组成为约60到约95wt％的2S蛋白，约5到约40wt％的7S蛋白和0到约5wt％的12S蛋白。

在本发明中，向上清液中加入钙盐，优选地为氯化钙，上清液可以下述方法首先浓缩或部分浓缩，以使传导率为约5mS到约30mS，优选为8mS到约10mS。加到上清液中的氯化钙可为任何所需形式，例如其浓缩水溶液。

加入氯化钙的作用为以植酸钙形式从上清液中沉淀植酸，并保留上清液的球蛋白和白蛋白部分。从上清液中去除沉淀的植酸盐，例如通过离心和/或过滤，以留下澄清溶液。如果需要，可不去除沉淀的植酸盐，在此情况下，进一步的处理产生具有较高植酸盐含量的产品。

然后该溶液的pH调节至约2.0到约4.0，优选约2.9到3.2的值。pH调节可以任何便利的方法进行，例如通过加入盐酸。如果需要，该酸化步骤可从本文所述的多种可选方案中删除。

已调节pH的澄清溶液，如果尚未浓缩，则浓缩以提高其蛋白浓度。所述浓缩使用任何便利的选择性膜技术进行，例如超滤，使用具有合适的分子量截断值的膜，其允许低分子量种类，包括盐、糖类、色素和从蛋白原料提取的其它低分子量物质通过膜，同时在溶液中保留大部分油菜蛋白。根据不同膜材料和构造，可使用分子量截断值约3,000到100,000道尔顿，优选约5,000到约10,000道尔顿的超滤膜。以这种方式浓缩上清液也减少了干燥以回收蛋白的所需液体体积。在干燥之前，上清液通常浓缩至蛋白浓度至少约50g/L，优选约50到约500g/L，更优选约100到约250g/L。所述浓缩操作可以分批模式或连续操作进行，如上述蛋白溶液浓缩步骤所述。

当上清液在加入钙盐之前部分浓缩和去除沉淀之后完全浓缩时，该上清液首先浓缩至蛋白浓度约50g/L或以下，并且在去除沉淀之后，再浓缩至浓度至少约50g/L，优选约50到约500g/L，更优选约100到约250g/L。

在本发明的一个实施方案中，所述钙盐可在两个阶段加入。在此实施方案中，向上清液加入少量钙以使传导率为约1mS到约3.5mS，优选约1mS到约2mS，其不足以引起沉淀形成。

酸化所得到的溶液并在上述条件下部分浓缩。向部分浓缩的溶液中加入剩余的钙盐以使传导率为约4mS到约30mS，优选约4到约10mS，以引起沉淀形成。然后去除沉淀。然后在上述条件下浓缩所得到的澄清溶液。

然后可用水使浓缩上清液进行渗滤步骤。水可为其天然pH，与所渗滤的蛋白溶液相同的pH，或两者之间的任意pH。所述渗滤可使用约2到约20体积的渗滤溶液，优选约5到约10体积的渗滤溶液进行。在渗滤操作中，通过使渗透物穿过膜从水相上清液中去除更多杂质。可进行该渗滤操作直至渗透物中不含明显更多杂质和可见颜色。可使用与浓缩步骤相同的膜进行所述渗滤。但是，如果需要，可使用具有不同分子量截断值的单独的膜进行所述渗滤步骤，例如根据不同膜材料和构造，使用分子量截断值范围在约3,000到约100,000道尔顿，优选约5,000到约10,000道尔顿的膜。

在至少部分渗滤步骤中在渗滤介质中可存在抗氧化剂。所述抗氧化剂可为任何便利的抗氧化剂，例如亚硫酸钠或抗坏血酸。在渗滤介质中使用的抗氧化剂的量取决于使用的材料，可在约0.01到约1wt％之间变化，优选约0.05wt％。抗氧化剂用于抑制浓缩油菜蛋白分离物溶液中存在的酚的氧化。

浓缩以及任选渗滤的蛋白溶液可进行脱色操作，作为上述脱色操作的替代。此处可使用粉末活性碳以及颗粒活性碳(GAC)。可用作颜色吸附剂的另一种材料为聚乙烯吡咯烷酮。

颜色吸附剂处理步骤可在任何便利的条件下进行，通常在油菜蛋白溶液的环境温度下进行。对于粉末活性碳，可用的量为约0.025％到约5％w/v，优选约0.05％到约2％w/v。当聚乙烯吡咯烷酮用作颜色吸附剂时，可用的量为约0.5％到约5％w/v，优选约2％到约3％w/v。颜色吸附剂可通过任何便利的方式从油菜蛋白溶液中去除，例如通过过滤。

浓缩以及任选渗滤和任选脱色处理的蛋白溶液通过任何便利的技术，例如喷雾干燥或冻干，干燥成干燥形式。干燥的油菜蛋白分离物蛋白含量高，超过约90wt％(N x6.25)d.b.，优选至少约100wt％，并基本上未变性(由差示扫描量热法确定)。该油菜蛋白分离物通常植酸含量低，以重量计通常低于约1.5％。

本文生产的油菜蛋白分离物包含白蛋白和球蛋白部分并可溶于酸性水环境，使该分离物适合添加到碳酸和非碳酸饮料中，以为其提供蛋白强化。此类饮料具有广泛的酸性pH值范围，从约2.5到约5。本文提供的油菜蛋白分离物可以任何便利的量添加到此类饮料中以对此类饮料提供蛋白强化，例如每12液盎司量至少约5g该油菜蛋白分离物。加入的油菜蛋白分离物完全溶解于饮料并且不损害饮料的澄清度，即使经过热处理。在通过溶于水还原饮料之前该油菜蛋白分离物可与干饮料混合。

实施例

实施例1：

本实施例描述了根据本发明的一个实施方案的新颖油菜蛋白分离物的生产，其中向上清液中加入钙盐，去除沉淀，然后酸化溶液并进一步处理。

‘a’kg的油菜粕在室温加入到‘b’L的‘c’M NaCl溶液并搅拌30分钟以产生蛋白水溶液。去除残余的油菜粕，所得到的蛋白溶液通过离心部分澄清以产生‘d’L的部分澄清的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘e’％。过滤部分澄清的蛋白溶液以进一步澄清该蛋白溶液，产生‘f’L体积的溶液，其蛋白含量以重量计为‘g’％。

‘h’L等分量的蛋白提取溶液在分子量截断值为‘j’道尔顿的聚醚砜(PES)膜上浓缩至‘i’。所得到的浓缩蛋白溶液的蛋白含量以重量计为‘k’％。浓缩的蛋白溶液在60℃下经巴氏消毒‘l’分钟以产生‘m’kg的巴氏消毒的浓缩蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘n’％。

‘o’℃下的浓缩溶液以‘p’稀释到温度‘q’℃的冷RO水中。白色混浊立即形成并沉降。去除上层稀释水并通过离心回收沉淀的粘性团(PMM)，产率为过滤蛋白溶液的‘r’wt％。发现源自干燥PMM的蛋白的蛋白含量为‘s’％(N x6.25)d.b.。该产物命名为‘t’C307C。

下表I中显示三次运行的参数‘a’到‘t’：

表I

t	BW-SA082-F09-08A	BW-SA082-F11-08A	BW-SD084-F18-08A
				a	20	20	20
b	200	200	200
				c	0.15	0.15	0.15
d	161	164	162.5
				e	1.41	1.50	1.81
f	172	174	187.8
				g	1.14	1.25	1.30
h	172	174	187.8
				i	7.45L	8.46kg	9.24kg
j	100,000	100,000	100,000
				k	21.41	21.72	22.51
l	1	0	0
				m	7.9
n	20.11
				o	30	30	29.2
p	1∶15	1∶15	1∶15
				q	4	4	4
r	49.5	48.2	59.4
				s	99.31	103.34	102.09

然后对PMM沉积产生的上清液进行本申请描述的氯化钙添加。

通过加入氯化钙调节‘u’L上清液至传导率‘v’mS。然后将该溶液离心和/或过滤以去除沉淀的植酸盐物质，产生‘w’L的减少植酸盐含量、澄清的蛋白溶液，其蛋白浓度以重量计为‘x’％。然后通过加入HCl调节所述减少植酸盐含量、澄清的蛋白溶液至pH‘y’，并使用分子量截断值为‘aa’道尔顿的聚醚砜(PES)膜通过超滤减少体积至‘z’L。然后所述浓缩物在相同膜上使用‘ab’体积的pH3反渗透纯化(RO)水渗滤。渗滤的浓缩物包含以重量计‘ac’％的蛋白。连同从上清液中回收的其它蛋白，过滤蛋白溶液的总蛋白回收率为‘ad’wt％。所述浓缩物的‘ae’L部分进行脱色步骤，通过将其在pH3下以速率为‘ag’BV/hr通过‘af’L柱体积(BV)的颗粒活性碳。然后脱色且蛋白含量以重量计为‘ai’％的‘ah’L GAC处理的溶液被喷雾干燥并命名为‘t’C200CaC。所述C200CaC的蛋白含量为‘aj’(N x6.25)d.b.。不进行进一步纯化步骤，剩余的‘ak’的浓缩物被喷雾干燥以产生命名为‘t’C200Ca的终产物，其蛋白含量为‘al’％(N x6.25)d.b.。下表II中显示三次运行的参数‘t’到‘al’：

表II

t	BW-SA082-F09-08A	BW-SA082-F11-08A	BW-SD084-F18-08A
				u	119	126	137
v	18.69	19.05	8.15
				w	115	120	145
x	0.54	0.57	0.35
				y	3.06	1.95	3.12
z	5	4.5	5
				aa	10,000	10,000	10,000
ab	5	5	5
				ac	8.76	11.53	9.13
ad	71.9	72.0	77.0
				ae	2.45	2.25	0
af	0.3	0.3
				ag	2.5	2.5
ah	2.5	2.35
				ai	7.76	10.65
aj	94.52	94.45
				ak	2.2L	2.25L	4.74kg
al	93.52	94.04	90.36

注-来自运行BW-SA082-F09-08A的渗滤的浓缩处理的上清液在碳处理和干燥之前通过过滤处理。

实施例2：

本实施例描述了浓缩油菜蛋白溶液的生产，如果不进行进一步处理而干燥，应产生根据本发明的一个实施方案的分离物，其中在酸化和进一步处理之前不去除通过向上清液中加入钙盐形成的沉淀。

‘a’kg的油菜粕在室温加入到‘b’L的‘c’M NaCl溶液并搅拌30分钟以产生蛋白水溶液。去除残余的油菜粕，所得到的蛋白溶液通过离心部分澄清以产生‘d’L的部分澄清的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘e’％。过滤部分澄清的蛋白溶液以进一步澄清该蛋白溶液，产生‘f’L体积的溶液，其蛋白含量以重量计为‘g’％。

‘h’L等分量的蛋白提取溶液在分子量截断值为‘j’道尔顿的聚醚砜(PES)膜上浓缩至‘i’kg。所得到的浓缩蛋白溶液的蛋白含量以重量计为‘k’％。该浓缩的蛋白溶液在60℃下巴氏消毒1分钟以产生‘l’kg的巴氏消毒的浓缩蛋白溶液，其包含以重量计为‘m’％的蛋白含量。

‘n’℃下的巴氏消毒的浓缩溶液以‘o’稀释到温度‘p’℃的冷RO水中。白色混浊立即形成并沉降。去除上层稀释水并通过离心回收沉淀的粘性团(PMM)，产率为过滤蛋白溶液的‘q’wt％。发现源自干燥PMM的蛋白的蛋白含量为‘r’％(N x6.25)d.b.。该产物命名为‘s’C300。

下表III中显示一次运行的参数‘a’到‘s’：

表III

s	BW-SA077-A23-08A
		a	20
b	200
		c	0.15
d	144.5
		e	1.70
f	150
		g	1.41
h	150
		i	7.80
j	100,000
		k	20.88
l	7.62
		m	20.66
n	29.6
		o	1∶15
p	3.5
		q	36.3
r	103.05

然后对PMM沉积产生的上清液进行本申请描述的氯化钙添加。

通过加入氯化钙调节‘t’L蛋白含量以重量计为‘u’％的上清液至传导率‘v’mS，导致混浊形成。然后通过加入HCl调节所述蛋白溶液至pH‘w’，且样品澄清。然后使用分子量截断值为‘z’道尔顿的聚醚砜(PES)膜通过超滤将‘x’L等分量的该溶液减少体积至‘y’L。然后所述浓缩物在相同膜上使用‘aa’体积的pH3RO水渗滤，获得包含以重量计‘ac’％蛋白的‘ab’kg渗滤浓缩物。连同从上清液中回收的其它蛋白，过滤蛋白溶液的总蛋白回收率为‘ad’wt％。下表IV中显示一次运行的参数‘s’到‘ad’：

表IV

s	BW-SA077-A23-08A
		t	132.5
u	0.60
		v	18.91
w	2.97
		x	110
y	5
		z	10,000
aa	6
		ab	4.6
ac	11.08
		ad	60.4

实施例3：

本实施例描述了浓缩油菜蛋白溶液的生产，如果不进行进一步处理而干燥，应产生根据本发明的一个实施方案的分离物，其中向部分浓缩的上清液中加入钙盐，去除沉淀并酸化样品。

‘a’kg的油菜粕在室温加入到‘b’L的‘c’M NaCl溶液并搅拌30分钟以产生蛋白水溶液。去除残余的油菜粕，所得到的蛋白溶液通过离心部分澄清以产生‘d’L的部分澄清的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘e’％。过滤部分澄清的蛋白溶液以进一步澄清该蛋白溶液，产生‘f’L体积的溶液，其蛋白含量以重量计为‘g’％。

‘h’L等分量的蛋白提取溶液在分子量截断值为‘j’道尔顿的聚醚砜(PES)膜上浓缩至‘i’kg。所得到的浓缩蛋白溶液的蛋白含量以重量计为‘k’％。

‘l’℃下的浓缩溶液以‘m’稀释到温度‘n’℃的冷RO水中。白色混浊立即形成并沉降。去除上层稀释水并通过离心回收沉淀的粘性团(PMM)，产率为过滤蛋白溶液的‘o’wt％。发现源自干燥PMM的蛋白的蛋白含量为‘p’％(N x6.25)d.b.。该产物命名为‘q’C302。

下表V中显示一次运行的参数‘a’到‘q’：

表V

q	BW-SA082-G30-08A
		a	60
b	600
		c	0.15
d	440
		e	1.52
f	505
		g	1.49
h	505
		i	33.18
j	100,000
		k	15.66
l	30.2
		m	1∶15
n	1.8
		o	32.4
p	101.71

然后对PMM沉积产生的部分浓缩的上清液进行本申请描述的氯化钙添加。

使用分子量截断值为‘t’道尔顿的聚醚砜(PES)膜通过超滤将蛋白含量以重量计为‘s’％的‘r’L上清液浓缩至减少系数为7的体积。然后体积为‘u’L、蛋白含量以重量计为‘v’％的部分浓缩的上清液通过加入以蛋白重量计3.5％的氯化钙调节至传导率‘w’mS，导致混浊形成。然后将该溶液离心和/或过滤以去除沉淀的植酸盐物质，产生‘x’L减少植酸盐含量、澄清的、部分浓缩的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘y’％。然后通过加入HCl调节所述减少植酸盐含量、澄清的、部分浓缩的蛋白溶液至pH‘z’，并使用与用于初始浓缩上清液的相同的膜通过超滤进一步浓缩至‘aa’L。然后所述浓缩溶液在相同膜上使用‘ab’体积的pH3RO水渗滤。渗滤的保留物澄清，重量为‘ac’kg，蛋白含量以重量计为‘ad’％，产生过滤蛋白溶液的产率为‘ae’wt％。

下表VI中显示一次运行的参数‘r’到‘ae’：

表VI

p	BW-SA082-G30-08A
		r	511
s	0.54
		t	10,000
u	72
		v	2.70
w	2.32
		x	72
y	2.49
		z	3.14
aa	25
		ab	5.6
ac	20.24
		ad	8.05
ae	54.1

实施例4：

本实施例描述了根据本发明的一个实施方案的油菜蛋白分离物的生产，其中向上清液以及部分浓缩的上清液中加入钙盐，并在第二次添加之后去除形成的沉淀。

‘a’kg的油菜粕在室温加入到‘b’L的‘c’M NaCl溶液并搅拌30分钟以产生蛋白水溶液。去除残余的油菜粕，所得到的蛋白溶液通过离心部分澄清以产生‘d’L的部分澄清的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘e’％。过滤该部分澄清的蛋白溶液以进一步澄清该蛋白溶液，产生‘f’L体积的溶液，其蛋白含量以重量计为‘g’％。

‘h’L等分量的蛋白提取溶液在分子量截断值为‘j’道尔顿的聚醚砜(PES)膜上浓缩至‘i’。所得到的浓缩蛋白溶液的蛋白含量以重量计为‘k’％。该浓缩的蛋白溶液在与用于浓缩步骤的相同的膜上使用‘l’体积的‘c’M NaCl渗滤。渗滤的浓缩物包含以重量计‘m’％的蛋白。

‘n’℃下的浓缩溶液以‘o’稀释到温度‘p’℃的冷RO水中。白色混浊立即形成并沉降。去除上层稀释水并通过离心回收沉淀的粘性团(PMM)，产率为过滤蛋白溶液的‘q’wt％。发现源自干燥PMM的蛋白的蛋白含量为‘r’％(N x6.25)d.b.。该产物命名为‘s’C307C。

下表VII中显示两次运行的参数‘a’到‘s’：

表VII

s	BW-SD084-H27-08A	BW-SD084-I08-08A
			a	20	60
b	200	600
			c	0.15	0.15
d	159.4	495
			e	1.69	1.77
f	170	520
			g	1.39	1.47
h	170	520
			i	8.25L	30L
j	100,000	100,000
			k	21.39	21.17
l	0	10
			m		21.42
n	30.1	29.9
			o	1∶15	1∶15
p	7.5	4.4
			q	45.3	43.4
r	101.04	98.52

然后对PMM沉积产生的上清液和部分浓缩的上清液进行本申请描述的氯化钙添加。

通过加入以蛋白重量计2.5％的氯化钙调节‘t’L蛋白含量以重量计为‘u’％的上清液至传导率‘v’mS，未形成混浊。然后通过加入HCl调节所述溶液至pH‘w’。使用分子量截断值为‘y’道尔顿的聚醚砜(PES)膜通过超滤将‘x’L的氯化钙处理并调节pH后的上清液浓缩至减少系数为7的体积。然后体积为‘z’L、蛋白含量以重量计为‘aa’％的部分浓缩的上清液通过加入以蛋白重量计2.5％的氯化钙调节至传导率‘ab’mS，导致混浊形成。然后将该溶液离心和/或过滤以去除沉淀物质，产生‘ac’L澄清的、部分浓缩的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘ad’％。然后使用与用于初始浓缩上清液的相同的膜通过超滤将所述澄清的、部分浓缩的蛋白溶液进一步浓缩至‘ae’L。然后所述浓缩溶液在相同膜上使用‘af’体积的pH3RO水渗滤。渗滤的浓缩物包含以重量计‘ag’％的蛋白。连同从上清液中回收的其它蛋白，过滤蛋白溶液的总蛋白回收率为‘ah’wt％。‘ai’kg等分量的浓缩物进行脱色步骤，通过将其在pH3下以速率为‘ak’BV/hr通过‘aj’L BV的颗粒活性碳进行。然后脱色且蛋白含量以重量计为‘am’％的‘al’kgGAC处理后的溶液被喷雾干燥并命名为‘s’C200CaC。所述C200CaC的蛋白含量为‘an’％wt(N x6.25)d.b.。不进行进一步纯化步骤，剩余的‘ao’的浓缩物被喷雾干燥以产生命名为‘s’C200Ca的终产物，其蛋白含量为‘ap’％(N x6.25)d.b.。

下表VIII中显示两次运行的参数‘s’到‘ap’：

表VIII

s	BW-SD084-H27-08A	BW-SD084-I08-08A
			t	133	473
u	0.58	0.63
			v	1.22	1.10
w	3.11	3.07
			x	143	451
y	10,000	10,000
			z	29	64
aa	2.93	4.29
			ab	4.44	4.64
ac	27
			ad	2.27	3.96
ae	5	25
			af	5	5
ag	9.44	8.00
			ah	63.6	70.7
ai	0	25.46
			aj		2.5
ak		2.5
			al		26.0
am		6.32
			an		96.85
ao	4.6	0
			ap	91.23

实施例5：

本实施例描述了根据本发明的一个实施方案的新颖油菜蛋白分离物的生产，其中没有酸化步骤。

‘a’克油菜粕在室温加入到‘b’ml的‘c’M NaCl溶液并搅拌30分钟以产生蛋白水溶液。去除残余的油菜粕，所得到的蛋白溶液通过离心和过滤澄清以产生‘d’ml的蛋白溶液，其蛋白含量以重量计为‘e’％。‘f’ml等分量的蛋白提取溶液通过在分子量截断值为‘h’道尔顿的纤维素膜上浓缩减少体积至‘g’ml。所得到的浓缩蛋白溶液的蛋白含量以重量计为‘i’％。

‘j’℃下的浓缩溶液以‘k’稀释到温度‘l’℃的冷RO水中。白色混浊立即形成并沉降。去除上层稀释水并通过离心回收沉淀的粘性团(PMM)。发现源自干燥PMM的蛋白的蛋白含量为‘m’％(N x6.25)d.b.。

下表IX中显示该次运行的参数‘a’到‘m’：

表IX

		a	150
b	1500
		c	0.15
d	1200
		e	1.29
f	1200
		g	95
h	10,000
		i	11.39
j	30
		k	1∶15
l	4
		m	103％

然后对该上清液进行本申请描述的氯化钙添加。

通过加入氯化钙浓缩溶液调节‘n’ml上清液至传导率‘o’mS。然后将该溶液离心和/或过滤以去除沉淀的植酸盐物质，产生‘p’ml减少植酸盐含量、澄清的蛋白溶液，其浓度以重量计为‘q’％。然后使用分子量截断值为‘s’道尔顿的纤维素膜通过超滤将所达减少植酸盐含量、澄清的上清液减少体积至‘r’ml。然后该浓缩物在相同膜上使用‘t’体积的水渗滤。该渗滤的浓缩物包含以重量计‘u’％的蛋白，且体积为‘v’ml。不进行进一步纯化步骤，该溶液被冻干以形成终产物，其蛋白含量为‘w’％(N x6.25)d.b.。下表X中显示该次运行的参数‘n’到‘w’：

表X

n	1400
		o	9
p	1350
		q	0.30
r	60
		s	10,000
t	5
		u	4.5
v	40
		w	92.15

该冻干的产物在天然pH的水中重新溶解。在600nm的吸光度(A600)被确定为澄清度的指标。然后该溶液对分成两份，一半调节至pH3，另一半调节至pH6。再次读取各自的A600。下表XI中显示获得的结果：

表XI

	A600	LECO蛋白质
			天然pH样品	0.073	2.60
pH3样品	0.047	2.55
			pH6样品	0.151	2.58

所有样品外观澄清。

本公开总结

总结本公开，生产了2S为主要成分的油菜蛋白分离物，其具有与通过热处理PMM形成和沉积产生的上清液生产的2S为主要成分的油菜蛋白分离物的相同性质。在本发明的范围内可以有改型。

Claims (5)

1.一种制备具有基于干重以N x 6.25计至少90 wt%蛋白含量的油菜蛋白分离物的方法，其特征在于：

（a）任选

（i）部分浓缩油菜蛋白微胶粒团沉淀产生的上清液至浓度50 g/L以下，或者

（ii）将油菜蛋白微胶粒团沉淀产生的上清液浓缩至浓度至少50 g/L；

（b）

（i）向油菜蛋白微胶粒团沉淀产生的上清液中加入起始量钙盐，以使传导率为1到3.5mS，并且不足以引起植酸钙沉淀，

（ii）调节从步骤(b)(i)中所得到的溶液的pH至2.0到4.0，以形成酸化溶液，

（iii）部分浓缩所述酸化溶液至浓度50 g/L以下，

（iv） 向所得到的部分浓缩的溶液中加入更多量钙盐，以使传导率为4 mS到30 mS，并引起沉淀形成，

（v）从所得到的溶液中去除沉淀以产生澄清的调节pH的溶液，和

（vi）将所述澄清的调节pH的溶液浓缩至浓度至少50 g/L，以产生浓缩油菜蛋白溶液；

（c） 任选渗滤澄清的浓缩油菜蛋白溶液，

（d）任选对任选渗滤的澄清浓缩油菜蛋白溶液进行脱色步骤，以及

（e） 干燥任选脱色且任选渗滤的澄清浓缩蛋白溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（a）（ii）中，或在步骤（b）(vi）中，所得到的溶液的浓度为50到500 g/L。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤（a）（ii）中，或在步骤（b）(vi）中，所得到的溶液的浓度为100到250 g/L。

4.如权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(b)（i）中，所述钙盐为氯化钙，并加入到上清液中以使传导率为1到2 mS，以及，在步骤(b)（iv）中，所述钙盐为氯化钙，并加入到部分浓缩的溶液中以使传导率为4到10 mS。

5.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其特征在于，在步骤(b)（ii）中，将pH调节至 2.9到3.2。