CN104115871A - 一种引发细胞坏死的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种引发细胞坏死的方法,其利用化学物质和温度变化增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,从而导致细胞膜破裂引发细胞坏死。应用本项发明在农业上可改进土壤条件和栽培技术,或养殖技术,通过利用化学物质和温度变化增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,以抑制真菌的生长,达到防病、防役目标。在食用菌和药用菌的生产方面,可改进培养基配方和培养条件,利用化学物质和温度变化降低细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,以提高真菌的产量和品质。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域,尤其涉及一种引发细胞坏死的方法。
背景技术
细胞坏死(necrosis)是指细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程,表现为细胞胀大,胞膜破裂,细胞内容物外溢,核变化较慢,DNA降解不充分,引起局部严重的炎症反应。目前,关于细胞坏死的信号、机理和调控以及它们对人体功能和疾病的影响,尚不清楚。
细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障,它保证了细胞内环境的相对稳定,使各种生化反应能够有序运行。细胞膜的化学成分主要是脂类,蛋白质和糖,其中磷脂双分子层是构成细胞膜的的基本支架。细胞膜在电镜下可分为三层,即在膜的靠内外两侧各有一条厚约2.5nm的电子致密带,中间夹有一条厚2.5nm的透明带,总厚度约7.0~7.5nm左右。这种结构不仅见于各种细胞膜,细胞内的各种细胞器膜如:线粒体、内质网等也具有相似的结构。
每个动物细胞质膜上约有10^9个脂分子,即每平方微米的质膜上约有5x10^6个脂分子。
膜脂质主要由磷脂、胆固醇和少量糖脂构成。在大多数细胞的膜脂质中,磷脂占总量的70%以上,胆固醇不超过30%,糖脂不超过10%。磷脂又可分为两类:甘油磷脂(phosphoglycerides)和鞘磷脂(sphingomyelin,SM)。甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱(卵磷脂)(phosphatidylcholine,PC),其次是磷脂酰丝氨酸(phosphalidylserine,PS)和磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(phosphatidylethanolamine,PE),含量最少的是磷脂酰肌醇(phosphatidylinosital,PI)。磷脂、胆固醇和糖脂都是双嗜性分子。磷脂分子中的磷酸和碱基、胆固醇分子中的羟基以及糖脂分子中的糖链等亲水性基团分别形成各自分子中的亲水端,分子的另一端则是疏水的脂肪酸烃链。这些分子以脂质双层的形式存在于质膜中,亲水端朝向细胞外液或胞质,疏水的脂肪酸烃链则彼此相对,形成膜内部的疏水区。膜脂质双层中的脂质构成是不对称的,含氨基酸的磷脂(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)主要分布在膜的近胞质的内层,而磷脂酰胆碱的大部分和全部糖脂都分布在膜的外层。
磷脂由分子层构成了膜的基本支架,这个支架不是静止的。磷脂双分子层是轻油般的液体,具有流动性.蛋白质分子有的镶在磷脂分子层表面,有的部分或全部嵌入磷脂双分子层中,有的横跨整个磷脂双分子层。大多数蛋白质分子也是可以运动的。比较经典的证明是用仙台病毒介导完成不同小鼠染色细胞的融合,一段时间后,红与绿是均匀点状分布于细胞膜周围,说明膜是具有流动性的.
磷脂分子的流动性受着一些因素的影响,主要影响因素有:
①温度:在一定温度下,磷脂分子从液晶态(能流动具有一定形状和体积的物态)转变为凝胶状(不流动)的晶态。这一能引起物相变化的温度称为相变温度。当环境温度在相变温度以上时,细胞膜磷脂分子处于流动的液晶态;而在相变温度以下时,则处于不流动的晶态。细胞膜磷脂分子相变温度越低,细胞膜磷脂分子流动性就越大;反之,相变温度越高,细胞膜磷脂分子的流动性也就越小。
②细胞膜磷脂分子的脂肪酸链:饱和程度高的脂肪酸链因紧密有序地排列,因而流动性小;而不饱和脂肪酸链由于不饱和键的存在,使分子间排列疏松而无序,相变温度降低,从而增强了膜的流动性。所以细胞膜也具有流动性。脂肪酸链的长度对细胞膜磷脂分子的流动性也有影响:随着脂肪酸链的增长,链尾相互作用的机会增多,易于凝集(相变温度增高),流动性下降。
③胆固醇:胆固醇对细胞膜磷脂分子流动性的调节作用随温度的不同而改变。在相变温度以上,它能使磷脂的脂肪酸链的运动性减弱,从而降低细胞膜磷脂分子的流动性。而在相变温度以下时,胆固醇可通过阻止磷脂脂肪酸链的相互作用,缓解低温所引起的细胞膜磷脂分子流动性剧烈下降。
④卵磷脂/鞘磷脂比值,比值越高,膜流动性越大
⑤脂双层中嵌入的蛋白质越多,膜流动性越大
除以上因素外,细胞膜磷脂分子与膜蛋白的结合程度、环境中的离子强度、pH值等都会影响细胞膜磷脂分子的流动性。
膜脂的流动是造成细胞膜流动的主要因素,概括起来,膜脂的运动方式主要有四种。
①侧向扩散(lateral diffusion);
②旋转运动(rotation);
③伸缩运动(flex);
④翻转扩散(transverse diffusion),又称为翻转(flip-flop)
⑤左右摆动
⑥旋转异构运动
目前,在生物学,医学,农业种植业和养殖业,食品加工,工业,防腐材料,精密仪器等方面,尚没有利用细胞膜上不饱和脂肪酸碳链(碳-碳二氢键,烯结构)在外界化学条件和一定温度下的流动性,来设计、开发出相应的药物或技术破坏靶细胞(如肿瘤细胞,癌细胞),也没有利用这个靶点设计相应的药物或技术修复靶细胞(如神经细胞,上皮细胞,内皮细胞,内脏器官组织细胞)。没有利用这个靶点设计相应的抗菌素对病原生物或寄生生物进行抑制或灭杀。没有利用这个靶点设计相应的抗菌材料。在农业生产方面,特别是在动植物保护方面,没有考虑到这个靶点对细胞的致死作用,从而改变种养条件,控制病原真菌及其他寄生动物。在食用菌、药用菌培养方面,以及微生物工业方面,没有考虑到培养基中的磷酸类化合物会引起细胞坏死,从而导致目标培养物种群数量受到抑制。在天然产物的提取方面,也没有充分注意到磷酸不饱和脂肪酸的巨大潜在价值,从而加以充分利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种引发细胞坏死的方法,以选择性地诱发细胞的死亡,从而达到杀死有害细胞的目的。
本发明的引发细胞坏死的方法,其利用化学物质和温度变化增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,从而导致细胞膜破裂引发细胞坏死。
优选的,所述化学物质为磷酸盐。
优选的,所述磷酸盐为正磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐和/或缩聚磷酸盐。
优选的,使细胞处于磷浓度30ppm以上,温度20℃~60℃,pH值7~8条件下7~180天的环境中,以增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,从而导致细胞膜破裂引发细胞坏死。
本发明还提供了一种抑制混合菌环境中的真菌的方法,通过增加环境中的含磷浓度和提高温度,使真菌的细胞膜破裂引发细胞坏死,从而抑制混合菌环境中的真菌。
优选的,上述抑制混合菌环境中的真菌的方法使混合菌环境处于温度35℃~45℃的温度环境中,有效磷含量100ppm~500ppm之间。
优选的,上述抑制混合菌环境中的真菌的方法使混合菌环境处于温度40℃的温度环境中,有效磷含量500ppm。
本发明的引发细胞坏死的方法的有益效果体现:
在农业上,应用本项发明,在农业上可改进土壤条件和栽培技术,或养殖技术,通过利用化学物质和温度变化增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,以抑制真菌的生长,达到防病、防役目标。例如,在海产品养殖业中,由于病原生物的细胞膜中含不饱和脂肪酸,可改变养殖水体的化学成份和环境温度,有效控制病原生物,提高海洋动物的产量和品质。在食用菌和药用菌的生产方面,可改进培养基配方和培养条件,提高真菌的产量。冬虫夏草是一种传统的名贵滋补中药材,是麦角菌科真菌(Cordyceps sinensis)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。冬虫夏草的化学成份中脂肪占8.4%,其中饱和脂肪酸为13.0%,不饱和脂肪酸为82.2.%,因此虫草菌对磷酸盐浓度会很敏感,可通过改进培养基配方,把培养底料中的磷控制在一定比例下会更有利用于虫草的生长。
附图说明
图1为自2006-2010年的多次田间取样,土壤中真菌数量与无机磷酸根离子浓度关系图(U表示未施肥、CF表示化肥、OF表示有机肥、FL表示休闲地、FA表示农田、GH表示温室),由图1可以看出真菌磷酸脂肪酸浓度随土壤中速效磷浓度的上升而下降。
具体实施方式
根据田间实验的观察结果,可以实验出细菌和真菌在高磷高温条件下存活率的变化范围。在40℃下,当有效磷含量500ppm时,细菌的数量会成倍增加,而真菌的存活率可能下降到40%~20%。见表1。
表1.细菌和真菌在高磷高温培养条件下的存活率变化范围(%)
通过分析细胞内无机聚磷酸酯polyP的积累也可以推断出细胞对环境中磷酸根离子水平的耐受性。polyP广泛分布于细菌中。在约氏不动杆菌和积磷小月菌中,polyP高达生物干重的50%。在约氏不动杆菌210A(Bonting,1993),polyP的浓度是200mmol/L。在低等真核生物(酵母、霉菌和藻类),高等动物和人类的细胞中,也有polyP的存在,但其浓度比细菌低很多。在人体脑、肝、心、肾和肺的浓度为25-120umol/L。
室内实验证明,细菌的吸磷能力比真菌要高出五至一万倍左右。细菌按E.coli计(大肠埃希菌,在细菌中其聚磷能力可能是最低的),在10uM的Pi中对磷的吸收率为359uMp/min,是曲霉菌(Aspergillus nidulans,半知菌纲)对磷的吸收率(71uMp/min)的五倍。曲霉的磷吸收率仅仅比植物(按小麦作物计,为40uMp/min)高一点。如果按约氏不动杆菌中无机聚磷酸酯的浓度(200mmol/L)推算,约氏不动杆菌的吸磷率与大肠埃希菌相比,最大可增加2000倍。土壤是微生物最丰富的温床。土壤生物的生物量碳,有80-90%是由微生物构成。在森林土壤中,土壤微生物以真菌为主。与森林土壤相比,由于在耕作管理过程中施入大量的无机化肥和有机肥,农田土壤中的无机磷(速效磷)浓度很高。但在这种高磷浓度环境下,真菌标记物(磷酸脂肪酸)的含量很低。据Joergensen(2008)统计,含18:2ω6,9真菌的相对摩尔浓度(18:2ω6,9浓度占PLFA总浓度的比例),在农田为2.5mol%,在草地为3.1mol%,在森林凋落物层为10.7mol%,平均水平为6.2mol%.可见在农田的比例是最低的。在我们自已观测的数据中,这个比例降为0-0.16%(见表1)。自2006-2010年的多次田间取样,分析结果表明,土壤中真菌数量与无机磷酸根离子浓度呈反比,见图1。
(3)举例
上述推断,在我们的田间观察中得到验证。
在河北曲周农田,5月和9月取样时,温度较高,所以速效磷浓度高的有机肥处理(OF)土壤中真菌PLFA相对浓度低。而在11月,有机肥处理土壤真菌PLFA相对浓度高于化肥处理(CF)和未施肥对照(U)处理。与5月和9月的结果正好相反(表2)。原因有二。其一,10月玉米收获后的翻耕破坏了土壤真菌菌丝,它们需要重新生长。这样,在5月和9月,比OF土壤真菌数量较高的CF和U处理,不能显示出连续的优势。其二,在生长过程中,由于气温下降,OF处理土壤磷酸根离子对真菌细胞膜的破坏性不如高温下(5月和9月)那么明显,而土壤中丰富的碳和氮又有利于真菌的生长,这就是OF处理中真菌PLFA浓度高于CF和U的原因。
这个例子,完整地说明了磷离子浓度和环境温度这两个条件对真菌细胞的影响。当这两个因子叠加时,对真菌的致死作用是最大的。
表2.曲周农田土壤中真菌磷酸脂肪酸相对于PLFA总量的浓度(n mol%)
*OF:有机肥处理;CF:化肥处理;U:未施肥对照处理。
**小写字母a,b等表示处理间的差异显著。(p<0.05)
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种引发细胞坏死的方法,其特征在于,其利用化学物质和温度变化增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,从而导致细胞膜破裂引发细胞坏死。
2.根据权利要求1所述的引发细胞坏死的方法,其特征在于,所述细胞的为细胞膜中含不饱和脂肪酸碳链的真菌细胞。
3.根据权利要求1所述的引发细胞坏死的方法,其特征在于,所述化学物质为磷酸盐。
4.根据权利要求3所述的引发细胞坏死的方法,其特征在于,所述磷酸盐为正磷酸盐、焦磷酸盐、偏磷酸盐和/或缩聚磷酸盐。
5.根据权利要求1所述的引发细胞坏死的方法,其特征在于,使细胞处于磷浓度30ppm以上,温度20℃~60℃,pH值7~8条件下7~180天的环境中,以增加细胞膜上不饱和脂肪酸碳链的流动性,从而导致细胞膜破裂引发细胞坏死。
6.一种抑制混合菌环境中的真菌的方法,其特征在于,通过增加环境中的含磷浓度和提高温度,使真菌的细胞膜破裂引发细胞坏死,从而抑制混合菌环境中的真菌。
7.根据权利要求6所述的抑制混合菌环境中的真菌的方法,其特征在于,使混合菌环境处于温度35℃~45℃的温度环境中,有效磷含量100ppm~500ppm之间。
8.根据权利要求7所述的抑制混合菌环境中的真菌的方法,其特征在于,使混合菌环境处于温度40℃的温度环境中,有效磷含量500ppm。
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