CN104105707A - 医疗用途的双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

一种双特异性抗体形式，其缺少活性Fc部分，包含用于死亡受体的单价结合位点和用于B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点，其用于治疗或预防B细胞介导的自身免疫性疾病。

Description

医疗用途的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及双特异性抗体用于B细胞依赖性自身免疫疾病的新医疗用途，所述双特异性抗体不具有Fc部分或具有受损的Fc部分，并具有用于死亡受体的单价结合位点以及用于在B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点。
背景技术
CD95/Fas/Apo-1是能够诱导人类细胞凋亡的细胞表面受体。类似于这种受体的生理性配体，CD95L、激动性抗CD95抗体可诱导凋亡，如果与CD95以多聚体形式结合，例如作为五聚体IgM或自聚集IgG3。或者，抗CD95抗体可由附近的细胞上的Fc受体交联，或由二级抗体交联，以获得激动活性。
许多肿瘤细胞都表达CD95，因此，初步鉴定出原型CD95抗体之后，使用激动性抗CD95抗体用于肿瘤治疗已得到大力推行。但是，很快就变得明显的是，至少以其非常简单的形式对患者施用激动性抗CD95抗体或重组CD95L，这种方法是失败的，因为许多类型的正常细胞都表达功能性CD95并可被激动性抗体杀死。
CD20是许多淋巴瘤和自身免疫疾病(例如，多发性硬化症(MS)、类风湿关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE))中涉及的B细胞的标记。
针对B细胞相关CD20表面抗原的抗体可以以正常和恶性B细胞为目标。它们分别成功用于治疗B细胞源性白血病和淋巴瘤以及抗体介导自身免疫疾病。利妥昔(Rituximab)(商品名为Rituxan和MabThera)是抗CD20蛋白的嵌合单克隆抗体。利妥昔破坏B细胞，因此用以治疗特征为B细胞数目过多、B细胞过度活跃或B细胞功能失调的疾病。这包括许多淋巴瘤、白血病、移植排斥和一些自身免疫紊乱。
然而，利妥昔非特异性地杀死CD20阳性细胞，并证明在MS中临床有效，但受到副作用损害(例如进行性多灶性脑白质病，PML)。
以前证明了双功能F(ab’)2片段(bs-F(ab’)2)对CD95和淋巴瘤细胞上的不同目标抗原例如CD20和CD40具有特异性，其诱导对CD95和相应目标抗原呈阳性的细胞的凋亡。表达CD95但不表达目标抗原的淋巴瘤细胞未被杀死(Jung等人，Cancer Research(《癌症研究》)61,1846-1848(2001))。
Herrmann等人(Cancer Research(《癌症研究》)68(4):1221-7(2008))评估了抗体形式和目标抗原的性质对肿瘤细胞中选择性CD95介导的细胞凋亡的影响。
US2003/0232049A1描述了多特异性试剂用于选择性刺激细胞表面受体。双特异性抗体被描述用以杀死癌症细胞，所述双特异性抗体由抗原结合抗体片段构成，带有用于细胞表面受体如死亡受体例如CD95的第一结合位点和用于相同细胞目标抗原例如CD20或CD40的第二结合位点。
发明内容
本发明的目的是提供B细胞相关疾病或紊乱特别是自身免疫疾病的选择性免疫疗法。
可通过本发明要求保护的主题来实现这个目标。
本发明提供了一种双特异性抗体形式，其缺乏活性Fc部分，包含用于死亡受体的单价结合位点和用于在B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点，其用于治疗或防止自身反应性B细胞紊乱。
特别地，该抗体形式包含如图1A或图1B描绘的结构。
特别地，死亡受体选自：CD95、TRAIL受体和TNF受体，优选CD95。
特别地，细胞表面抗原选自：CD19、CD20和CD40，优选CD20。
根据一个特定的实施方式，该形式包含特异性结合CD95的单价结合位点和特异性结合CD19、CD20或CD40的至少一个结合位点。
根据一个特定的方面，提供了根据本发明使用的双特异性抗体形式，其中自身反应性B细胞紊乱由异常、过度或不希望的免疫反应导致。特别地，待治疗的疾病由正常的、激活的B细胞而非恶性B细胞导致。
本发明特别地涉及对抗自身反应性B细胞和治疗或预防与其相关的疾病状况。B细胞源性白血病和淋巴瘤与任何其它癌症类似，与B细胞过量产生和相关疾病状况有关，不论B细胞的特异性或反应活性如何。因此，这种白血病、淋巴瘤或癌症的预防和治疗特别地排除在本发明的疾病治疗之外。
特别地，自身反应性B细胞紊乱为自身免疫紊乱，优选选自：系统性红斑狼疮、Sjogren综合症、硬皮病、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、移植体对抗宿主疾病、皮肌炎、I型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、阿迪森氏病、脂泄病、克罗恩病、恶性贫血、寻常型天疱疮、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞性动脉炎、重症肌无力、多发性硬化症(MS)，优选复发缓解型MS(RRMS)、血管球性肾炎、古德帕斯丘综合症、大疱性类天疱疮、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗磷脂综合症、发作性睡病、结节病以及韦格纳氏肉芽肿。
根据本发明的一个具体方面，双特异性形式是重组分子，所述重组分子包含至少2个抗体域，优选至少3、4、5、6、7或8个抗体域，以及可选的铰链区。图1B描绘了一种优选的重组双特异性抗体形式。抗体或抗体片段可包含或由这样的抗体域和铰链区构成，优选单克隆抗体、单克隆抗体片段或其它单克隆抗体形式，其包含天然的氨基酸序列或包含氨基酸序列、三级结构和可选的糖基化的一种或多种突变，例如以改善与目标结合的特异性、亲和力和/或亲合力，或改善该形式的稳定性，或提高重组分子的产生能力。
特别地，抗体域是哺乳动物来源的，例如啮齿目动物如鼠科动物，或人来源的，或非人的哺乳动物来源的嵌合或人化抗体域。
双特异性抗体形式特别地包含至少2个结合位点，所述结合位点由互补决定区(CDR)形成，优选由获自选自VH和VH/VL域对的抗体域的CDR形成，优选至少一个或两个VH域和/或至少一个或两个VH/VL域对。特别地，如Jung等人在Eur J Immunol(《欧洲免疫学杂志》)21:2431,1991中所描述的，双特异性抗体形式通过具有不同特异性的两个Fab片段的化学杂交获得。双特异性抗体形式还可通过杂交-杂交瘤技术或重组抗体技术获得。
特别地，该形式包含至少一个VH/VL结合位点和/或scFv结合位点，以及可选的至少一个抗体恒定域，特别是CH1、CL、CH2或CH3域。
根据一个优选的实施方式，该形式包含至少一个VH/VL抗体域对和至少一个scFv结合位点，可选地带有任何恒定域，特别地包括CH2、CH1和CL域，其优选用作包含特异性结合位点的可变域之间的连接物。
根据另一个优选的实施方式，该形式包含至少两个单VH抗体域，优选单VHH域。
特别地，该形式选自scFv、Fab或F(ab’)片段与一个或多个抗体可变域的组合、F(ab’)2，以及它们的组合，优选采用至少一个抗体恒定域作为连接物。
根据一个特定的实施方式，所述形式的构造包含或由以下构成：
a)由VL/VH域对和CL/CH1域对构成的Fab片段，其中Fab片段包含第一结合位点；
b)由相互连接的VH/VL域构成的scFv，以及
c)将a)的Fab片段的CH1域连接至b)的scFv的VH域的CH2域。
根据另一特定实施方式，提供了用于本发明的双特异性抗体形式，其包含或由以下构成：
-包含用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段；
-包含用于第二抗原的第二结合位点的scFv片段；
-CH2域，其中Fab片段和scFv片段通过CH2域连接，其中
a)第一抗原是CD95，第二抗原选自CD19、CD20和CD40，优选CD20；或
b)第一抗原选自CD19、CD20和CD40，优选CD20，第二抗原是CD95。
特别地，与CD20结合的结合位点包含抗体可变域的六个互补决定区(CDR1至CDR6)，其中
A)
i)CDR1包含氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)；
ii)CDR2包含氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)；
iii)CDR3包含氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)；
iv)CDR4包含氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)；
v)CDR5包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)；以及
vi)CDR6包含氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)；
或者
B)其功能活性变体，其中至少一个：
i)CDR1包含与氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
ii)CDR2包含与氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
iii)CDR3包含与氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
iv)CDR4包含与氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
v)CDR5包含与氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；和/或
vi)CDR6包含与氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
本发明特别地考虑使用包含CD20结合位点的任何抗体形式，所述CD20结合位点获自上面的序列A i)至vi)，例如轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列和/或重链可变区的CDR4、CDR5和CDR6序列，包括含有多个单可变域的构造，所述多个单可变域包含CDR1、CDR2和CDR3序列的组合，或CDR4、CDR5和CDR6序列的组合，或这些单可变域对，例如VH、VHH或VH/VL域对。
特定的实施方式涉及包含至少一个优选至少两个或至少三个A的CDR序列，以及至少一个B的CDR序列的抗体形式。
另一特定的实施方式涉及包含至少一个优选至少两个或至少三个B的CDR序列，以及至少一个A的CDR序列的抗体形式。
特定的实施方式涉及使用轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含A i)的CDR1序列、A ii)的CDR2序列以及A iii)的CDR3序列，所述重链可变区包含A iv)或B iv)的CDR4序列、A v)或B v)的CDR5序列，以及A vi)或B vi)的CDR6序列，其中CDR4、CDR5和CDR6序列中的至少一个包含B的功能活性变体。
特定的实施方式涉及使用重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含A iv)的CDR4序列、A v)序列的CDR5以及A vi)的CDR6序列，所述轻链可变区包含A i)或B i)的CDR1序列、A ii)或B ii)的CDR2序列以及A iii)或B iii)的CDR3序列，其中CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个包含B的功能活性变体。
B的变体可选地包含列出的特定CDR序列，其包含例如通过氨基酸残基的插入、删除、取代或化学衍化而导致的一个、两个或三个点突变。
如果与CD20(特别是人CD20，特别是具有高亲和力例如Kd<10-8M的CD20)结合，CD20结合物的变体被视为功能活性变体。
另一功能活性变体具有靶向激活的B细胞的功能活性，例如凋亡活性，如实施例中描述的试验中确定的。
根据一个特定的实施方式，抗体形式包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体，所述VL域包含SEQ ID 11的氨基酸序列或由SEQ ID 11的氨基酸序列构成，所述VH域包含SEQ ID 15的氨基酸序列或由SEQ ID 15的氨基酸序列构成。
特别地，该变体是包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 19的氨基酸序列或由SEQ ID 19的氨基酸序列构成，所述VH域包含SEQ ID20的氨基酸序列或由SEQ ID 20的氨基酸序列构成。
特别地，与CD95结合的结合位点包含可变抗体域的六个互补决定区(CDR1至CDR6)，其中
A)
i)CDR1包含氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)；
ii)CDR2包含氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)；
iii)CDR3包含氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)；
iv)CDR4包含氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)；
v)CDR5包含氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)；以及
vi)CDR6包含氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)；
或者
B)其功能活性变体，其中至少一个
i)CDR1包含与氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
ii)CDR2包含与氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
iii)CDR3包含与氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
iv)CDR4包含与氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；
v)CDR5包含与氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列；和/或
vi)CDR6包含与氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)至少70％，或至少80％或至少90％的序列一致性的氨基酸序列。
本发明特别地考虑使用包含CD95结合位点的任何抗体形式，所述CD95结合位点获自上面的序列A i)至vi)，例如轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列和/或重链可变区的CDR4、CDR5和CDR6序列，包括含有多个单可变域的构造，所述多个单可变域包含CDR1、CDR2和CDR3序列的组合，或CDR4、CDR5和CDR6序列的组合，或这些单可变域对，例如VH、VHH或VH/VL域对。
特定的实施方式涉及包含至少一个优选至少两个或至少三个A的CDR序列，以及至少一个B的CDR序列的抗体形式。
另一特定的实施方式涉及包含至少一个优选至少两个或至少三个B的CDR序列，以及至少一个A的CDR序列的抗体形式。
特定的实施方式涉及使用轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含A i)的CDR1序列、A ii)的CDR2序列以及A iii)的CDR3序列，所述重链可变区包含A iv)或B iv)的CDR4序列、A v)或B v)的CDR5序列，以及A vi)或B vi)的CDR6序列，其中CDR4、CDR5和CDR6序列中的至少一个包含B的功能活性变体。
另一特定的实施方式涉及使用重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含A iv)的CDR4序列、A v)序列的CDR5以及A vi)的CDR6序列，所述轻链可变区包含A i)或B i)的CDR1序列、A ii)或B ii)的CDR2序列以及A iii)或B iii)的CDR3序列，其中CDR1、CDR2和CDR3序列中的至少一个包含B的功能活性变体。
B的变体可选地包含列出的特定CDR序列，其包含例如通过氨基酸残基的插入、删除、取代或化学衍化而导致的一个、两个或三个点突变。
如果与CD95(特别是人CD95，特别是具有高亲和力例如Kd<10-8M的CD95)结合，CD95结合物的变体被视为功能活性变体。
另一功能活性变体具有靶向激活的B细胞的功能活性，例如凋亡活性，如实施例中描述的试验中确定的。
根据一个特定的实施方式，抗体形式包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体，所述VL域包含SEQ ID 1的氨基酸序列或由SEQ ID 1的氨基酸序列构成，所述VH域包含SEQID 5的氨基酸序列或由SEQ ID 5的氨基酸序列构成。
特别地，该变体是包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 9的氨基酸序列或由SEQ ID 9的氨基酸序列构成，所述VH域包含SEQ ID 10的氨基酸序列或由SEQ ID 10的氨基酸序列构成。
根据一个特定的实施方式，抗体形式包含一SEQ ID 21的轻链序列和一SEQ ID 22的重链序列，或它们的功能活性变体，或由SEQ ID 21的轻链序列和SEQ ID 22的重链序列或它们的功能活性变体构成。
特别地，该变体是包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 24的氨基酸序列或由SEQ ID 24的氨基酸序列构成，所述VH域包含SEQ ID25的氨基酸序列或由SEQ ID 25的氨基酸序列构成。
本发明双特异性抗体形式特别地包含鼠科、嵌合、人化和/或人序列。
优选地，双特异性抗体形式结合选自CD19、CD20和CD40的抗原，优选CD20，其Kd<10-8M和/或结合Kd<10-8M的CD95。
一个示范性构造是图1B中示意描绘的具有CD20XCD95特异性的重组双特异性Fab-单链(bsFabXsc)。其被命名为NA-C20。
特别地，该形式没有Fc部分，或包含经改造以钝化或减弱其Fc效应功能的Fc部分，优选通过Fc部分中的一个或多个突变改造。减弱的Fc效应功能的示例性突变位于抗体Fc片段的Fcγ受体结合区，优选位于N末端CH2区。利用分子工程和/或化学工程进行突变是可行的。优选的突变是氨基酸序列中的点突变，例如插入和/或删除和/或取代。另一优选突变是氨基酸的化学衍化。
钝化或减弱的Fc效应功能可通过用于确定抗体形式的ADCC和/或CDC活性的合适试验确定。结果与相应的野生型分子的活性进行比较。
特别地，该形式可获自IgG类的抗体，特别是任何IgG1、IgG2或IgG4亚类，特别地包括获自人IgG抗体的序列。
特别地，该形式可获自人IgG抗体。
根据一个特定的实施方式，双特异性抗体形式被提供用于本发明与自身反应性B细胞紊乱的其它治疗的组合疗法中，优选地与细胞因子治疗组合，例如干扰素，特别是β干扰素，或与其它抗体形式或试剂的治疗的组合。
特别地，用于本发明的双特异性抗体形式以治疗有效量给予需要其的主体，优选地以用于肠胃外的制剂提供，例如，静脉内或皮下制剂，特别是以药物制品提供，所述药物制品包含该抗体形式和可选的药学上可接受的载体或赋形剂。
根据一个特定的方面，本发明提供了一种用于治疗或预防自身反应性B细胞紊乱的方法，包括给予需要的主体治疗有效量的双特异性抗体形式，所述双特异性抗体形式无活性Fc部分，包含用于死亡受体的单价结合位点和用于在B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点。
特别地，这种用于治疗或预防自身反应性B细胞紊乱的方法由本文描述的与医学用途相关的实施方式表征。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗自身反应性B细胞的方法，包括使所述细胞与包含本发明双特异性抗体形式的组合物相接触。这种治疗方法可以是体内或离体的。
特别地，双特异性抗体形式靶向死亡受体和由所述细胞表达的细胞表面抗原，从而抑制所述细胞产生IgG，以及可选地使所述细胞凋亡。
附图说明
图1：两种示例性抗体形式的示意性描述：两种不同形式的双特异性CD20×CD95抗体，用于在表达CD20和CD95两者的正常、激活的或恶性B细胞表面上选择性刺激死亡受体CD95。
图1A：化学杂交双特异性(Fab’)2片段(此处也称为bsFab2)。双特异性Fab2片段如Jung等人，Eur.J.Immunol.21:2431,1991中所描述的进行制备。用于化学杂交的亲本抗体是批准用于治疗衍生自B细胞的恶性淋巴瘤的抗CD20抗体利妥昔(Roche)，以及从培养的淋巴瘤细胞的上清液纯化的抗CD95抗体Apo-1。或者，Apo-1抗体可以纯化形式(BMS151)购自eBioscience,San Diego,CA 92121。
图1B：重组双特异性Fab单链(此处也称为bsFab×sc或NA-C20)。NA-C20包含一Fab，其利用单体CH2域作为连接物连接至scFv。
图9E提供了这种单体形式的序列，包括CD20(2H7，鼠科和人化的)和CD95(鼠科和人化的)抗体的那些序列。利用标准技术将编码抗体的遗传构造稳定地转染到Sp2/0细胞内。使用购自GE-Healthcare,Life Sciences,Freiburg,Germany的kappa-select，利用亲和层析从转染细胞的上清液中纯化蛋白质。
图2：用1μg/mL PWM激活的人B细胞上CD95的表达。
将利用密度梯度离心分离的正常健康捐献者外周血单核细胞(PBMC)与美洲商陆有丝分裂原(PWM,1μg/ml,Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germany)培养6天并洗涤。在指定的时间点，将细胞从培养瓶中移除，并通过流式细胞仪进行分析。为此，用耦合到太平洋蓝的CD19抗体或同型对照抗体、耦合到别藻蓝蛋白(APC)和7-氨基-放线菌素D(7-AAD)染料的CD95抗体将细胞染色，以清楚地鉴别活细胞。活的CD19阳性细胞经设门并进行分析。抗体购自Biolegend,San Diego,CA92121。同型对照获得明亮的轮廓-CD95抗体获得深色轮廓。
结论：静息B细胞上检测不到CD95，其表达在PWM刺激1天后升高，在第3天达到其最大值，并维持高值直至第10天，尽管在第6天洗涤细胞。
图3：PWM激活的B细胞引起的IgG产生动力学。
用PWM(1μg/ml)刺激正常的PBMC。多次后，移除等份的培养上清液并通过ELISA分析人IgG含量。用PWM刺激PBMC(实心圆)诱导产生人IgG。在第4天可检测到抗体产生，并持续升高至第10天。未刺激的PBMC的抗体产生的测量(空心圆)用作对照。
结论：PWM刺激5天后可检测到IgG产生，并持续升高到第10天。
图4：来自未刺激的PBMC的CD19+B细胞和CD4/CD8+T-辅助/杀伤细胞的耗竭
未刺激的PBMC用指定的抗体(1μg/ml)培养4天、洗涤并利用耦合到太平洋蓝的CD19抗体、耦合到异硫氰酸荧光素(FITC)的CD4抗体、耦合到APC和活力染料7-AAD(Biolegend,San Diego,CA92121)的CD8抗体通过流式细胞仪分析。NA-C20是描绘于图1B中的重组双特异性抗体。
结论：提到的抗体中没有一个影响未刺激PBMC培养物中的T细胞或B细胞。
图5：来自经刺激的PBMC的CD19+B细胞和CD4/CD8+T-辅助/杀伤细胞的耗竭。
PBMC用美洲商陆有丝分裂原(PWM,Sigma-Aldrich,1μg/ml)刺激6天、洗涤并用指定的抗体(1μg/ml)培养4天。在第10天如图4所描述的通过流式细胞仪分析细胞。NA-C20是描绘于图1B中的bsFab×sc形式的重组双特异性抗体。
结论：两种双特异性CD20×CD95抗体引起PWM刺激的PBMC中B细胞耗竭。T细胞不受影响。具有Myc×CD95特异性的化学杂交对照抗体无效。
图6：体外抗体生产的抑制：
通过密度梯度分离将人外周血单核细胞(PBMC)从肝素化血液中分离出来，以1×106细胞/ml接种于6孔平板中，并用凝集素美洲商陆有丝分裂原(PWM,1μg/ml,Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗涤细胞，并加入指定抗体。在第10天，通过ELISA测量上清液中人IgG的量。NA-C20是图1B描绘的bsFab×sc形式的重组双特异性抗体。
结论：两种双特异性CD20×CD95抗体抑制经刺激的人PBMC产生IgG。具有Myc×CD95特异性的化学杂交对照抗体则不会。
图7：双特异性抗体调节的PMW介导的体外IgG合成抑制。通过密度梯度离心将三个不同的健康捐献者的人外周血单核细胞(PBMC)(7A-7C)从肝素化血中分离出来，以1×106细胞/ml接种于6孔平板中，并用凝集素美洲商陆有丝分裂原(PWM,1μg/ml,SigmaAldrich)刺激。在第6天，洗涤细胞，加入双特异性F(ab’)2抗体(即F(ab’)2抗体形式)。在第10天，通过ELISA测量上清液中人IgG的量。被测试的双特异性抗体特异性地靶向CD20×CD95(实心圆)或CD40×CD95(三角形)。作为比较，平行测试带有指向细胞内myc蛋白(myc×CD95)的不相关靶向特异性的双特异性抗体(空心圆)(即，F(ab’)2抗体形式)。
结论：
具有CD20×CD95或CD40×CD95特异性的双特异性Fab2抗体抑制激活的人B细胞在体外产生IgG，具有Myc×CD95特异性的抗体则不会。
图8：破伤风类毒素特异性IgG生产的抑制
用破伤风类毒素(25ng/ml,Calbiochem,Merck Darmstadt,Germany)刺激经破伤风类毒素新鲜接种的捐献者的PBMC4天，洗涤并用指定抗体(1μg/ml)培养8天。在第12天，通过ELISA确定特异性抗破伤风抗体的量。NA-C20是图1B描绘的bsFab×sc形式的重组双特异性CD20×CD95抗体。
结论：重组双特异性CD20×CD95抗体NA-C20和单特异性抗CD20抗体利妥昔抑制体外特异性抗破伤风类毒素抗体的产生。具有指向EGF受体的不相关靶向特异性的相应抗体(爱必妥)和黑色素瘤相关蛋白多糖(NA-CMel)分别无效。
图9：实施例中提到的示例性抗体形式的序列。
图9A：具有指向CD95、CDR序列的结合位点的抗体形式的小鼠VL和VH序列(分别为SEQ ID 1和5)加下划线(VL的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID 2-4；VH的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID 6-8)。
图9B：具有指向CD95(人化)、CDR序列的结合位点的抗体形式的VL和VH序列(分别为SEQ ID 9和10)加下划线。
图9C：具有指向CD20、CDR序列的结合位点的抗体形式的VL和VH序列(分别为SEQID 11和15)(鼠科，获自抗体2H7，如Liu等人，The Journal of Immunology139,3521-3526(1987),NCBI Accession M17953和M17954描述的)加下划线(VL的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID2-14；VH的CDR1、CDR2、CDR3：SEQ ID 16-18)。
图9D：具有指向CD20(人化、获自抗体2H7)、CDR序列的结合位点的抗体形式的VL和VH序列(分别为SEQ ID 19和20)加下划线。
图9E：示例性双特异性抗体形式CD95×CD20、嵌合和人化版本：SEQ ID 21：嵌合版本，轻链；SEQ ID 22：嵌合版本重链；SEQ ID 23：连接物序列；SEQ ID 24：人化版本轻链；SEQ ID 25：人化版本重链。
具体实施方式
本文使用的术语“抗体形式”应指由抗体域构成或包含抗体域的多肽或蛋白质，所述抗体域被理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定域和/或可变域。该定义特别地指可变区和恒定区的重链和轻链的域(例如dAb、Fd、VL、Vk、VH、VHH)或完整抗体的各域例如CH1、CH2、CH3、CH4、Cl和Ck。Vk或Vl理解为VL，轻链的可变域，Kappa或lambda；类似地，Cl或Ck理解为CL域，Kappa或lambda。清楚理解的是，引用如本文使用的抗体域理解为指这种抗体域的任何类型或变体。因此，如本文使用的VH域的任何引用理解为包括VH域的任何类型，包括VHH。
抗体域可以是天然的结构或通过突变或衍化进行修饰，例如以改善抗原结合性质或任何其它性质，例如稳定性或功能性质，例如与Fc受体FcRn和/或Fcγ受体的结合。多肽序列被认为是抗体域，如果包含β-桶结构，所述β-桶结构由抗体域结构的至少两条β条带通过环序列连接构成。
术语“抗体形式”特别地指多肽或蛋白质，其显示出单或双或多特异性，或单、双或多价结合性质，优选至少两个，更优选至少三个特异性结合位点用于例如抗原的表位、效应分子或病原体起源或人结构的结构，如自身抗原，包括细胞相关蛋白或血清蛋白。如本发明使用的术语抗体形式包括全长抗体或抗体的功能性片段，例如Fab(此处理解为包括Fab、F(ab)或F(ab’))、(Fab’)2、scFv或其它单链二聚体，例如CH1/CL(kappa或lambda)域、Fv的单链二聚体、二聚体如VH/VL、CH1/CL、CH2/CH2、CH3/CH3，或它们的其它衍生物或组合，例如抗体域对的单链或通过连接物或铰链区相互连接的抗体域的链，特别是如图1A或1B描绘的抗体形式。
经木瓜蛋白酶消化的抗体得到三个片段：两个Fab片段和一个Fc片段。术语“Fab”此处理解为包括Fab、F(ab)或F(ab’)，可包含或不包含铰链区。Fab或F(ab’)片段是仍然与抗原结合但为单价且无Fc部分的抗体结构。本发明一个优选的实施方式涉及包含Fab片段的抗体形式，其包含VH/VL域对并进一步包含两个抗体恒定域，例如CL和CH1。
F(ab')2片段抗体通过整个IgG抗体的胃蛋白酶消化产生，以除去大部分Fc区，同时保留完整的某些铰链区。F(AB')2片段具有两个连接在一起的抗原结合F(ab’)部分，因此是二价的。
优选本发明的抗体形式至少包含可变域以提供至少两个特异性结合位点；以及至少一个，优选至少2个，或至少三个恒定域。
术语“抗体形式”特别地包括分离的抗体形式，此处理解为基本无指向不同目标抗原，或包括抗体域的不同结构排布的其它抗体形式。但是，如本发明使用的分离的抗体形式可包含在组合制品中，所述制品包含分离的抗体形式例如与至少一种其它抗体形式(例如单克隆抗体或具有不同特异性的抗体片段)的组合。
本文使用的抗体形式可以是重组双特异性抗体形式，该术语包括通过重组手段制备的、表达的、产生的或分离的所有抗体形式，例如来自动物如哺乳动物包括人的抗体，其包含来自不同来源的基因或序列，例如人化抗体或获自杂交瘤的抗体。进一步的实施例涉及从宿主细胞分离的抗体形式，所述宿主细胞经转化以表达该抗体形式，或从抗体或抗体域的重组的组合文库中分离的抗体形式，或通过任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体形式，所述任何其它方法包含将抗体基因序列拼接到其它DNA序列。
人们理解，术语“抗体形式”包括其衍生物。衍生物是一个或多个本发明抗体域或抗体形式的任何组合和或融合蛋白，在所述融合蛋白中，本发明抗体形式的任何域可融合在一种或多种其它蛋白的任何位置，所述其它蛋白例如其它抗体或抗体形式，例如包含CDR环的结合结构、受体多肽，还有配体、支架蛋白、酶、毒素等等。本发明组合式抗体的衍生物还可通过利用多种化学技术例如共价耦合、静电作用、二硫化结合等与其它物质联合或结合来获得。结合到免疫球蛋白的其它物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机或无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前药或药物)。术语衍生物还包括抗体形式的片段、变体、类似物或同系物，其具有功能性并可作为功能性等同物，例如结合到特定目标并具有功能性质，例如IgG抑制活性或凋亡活性。优选的衍生物仍然是对于抗原结合、凋亡活性和/或抑制自身反应性B细胞产生IgG的活性具有功能性。
本文使用的术语“活性Fc部分”指抗体的Fc片段(所述抗体包含至少两个，优选至少四个恒定抗体域(例如CH2和CH3抗体域))，或修饰物、衍生物、组合物或仍然被Fc效应功能作用的恒定抗体域的部分。Fc效应功能按以下方式理解。包含活性Fc部分的抗体通常具有细胞毒活性。当与抗原结合时，Fc部分通过其对效应物细胞的活性，激活细胞毒性T细胞或调节ADCC或CDC的细胞，调节抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。功能活性Fc部分因此通过Fcγ受体(FCGR)结合位点与效应细胞结合。
本发明的抗体形式没有活性Fc部分，因此，其由不具有FCGR结合位点的抗体域构成，特别地包括没有CH2和CH3域的链的任何抗体形式，或本发明的抗体形式包含缺少Fc效应功能的Fc部分，例如通过修饰以减弱Fc效应功能，特别地去掉或减弱ADCC和/或CDC活性。这种修饰可通过诱变引起，例如FCGR结合位点的突变，或通过衍生物或试剂引起，以干扰抗体形式的ADCC和/或CDC活性，从而达到减弱Fc效应功能或缺失Fc效应功能，这通常理解为指通过ADCC和/或CDC活性测量，Fc效应功能低于未经修饰(野生型)形式的10％，优选低于5％。特定的实施例涉及包含Fc区的抗体形式，其中作出了一种或多种修改以改变抗体的功能性或药代动力学性质，例如通过取代位于Fc区负责调节Fc效应功能的一个或多个氨基酸残基，例如CH2域的N末端区中的突变。
本文使用的术语“自身反应性B细胞”和“自身反应性B细胞紊乱”按照以下方式理解。自身反应性B细胞是初始B细胞库的一部分，并且在自身免疫疾病的发病中是关键的，不仅产生自身抗体，而且还分泌细胞因子并呈现自身抗原。自身反应性B细胞紊乱是指可通过给予包含本发明抗体形式的药物组合物改善的疾病状况。在与自身反应性B细胞紊乱相关的疾病中，如B细胞介导的自身免疫疾病，通常存在异常的消极的选择以及自身反应性B细胞的激活。
自身免疫疾病特别地理解为由指向患者自身组织或器官的反应引起的紊乱，通常是与自身抗原的抗体反应。在多种临床和实验室指示自身免疫疾病的标记中，有高γ球蛋白血症、高水平的自身抗体、贮存于组织中的抗原-抗体复合物、来自糖皮质激素或免疫抑制治疗的临床益处，以及受影响组织中的淋巴样细胞聚集。
本发明的抗体形式能够调节B细胞库以减少B细胞的自身反应性。该调节比单特异性抗体获得的调节更具特异性，因为其仅影响表达CD95的激活的B细胞，而不影响静息B细胞。可以表明，本发明的抗体形式诱导激活的B细胞的凋亡，并进一步遏制活性诱导的IgG产生，以及抑制激活的B细胞的IgG合成。因此，可有效地减少产生指向自身免疫目标例如自身抗原的IgG抗体的自身反应性B细胞。
通过本发明双特异性抗体形式，特别是CD20×CD95双特异性，不仅是恶性B细胞，而且表达CD95死亡受体的激活的正常(良性)B细胞可被靶向并被耗竭。相反，静息B细胞不会被靶向，这些正常B细胞不会受到影响。这表明，激活的B细胞是CD95敏感的，以在与所描述种类的双特异性CD20×CD95抗体培养后，经受凋亡性细胞死亡。
激活的B细胞的耗竭遏制了抗体产生。这是出人意料的，因为末端分化的抗体产生细胞，即浆细胞，并不表达CD20。遏制激活的前体B细胞显然足以遏制抗体产生。
通过本发明双特异性抗体形式遏制抗体产生优于使用已有的单特异性CD20抗体如利妥昔利妥昔使所有表达CD20的B细胞耗竭，而不会区分正常或静息B细胞和自身反应性或激活的B细胞。
本文关于本发明抗体或抗体形式使用的术语“结合位点”指能够与抗原发生结合相互作用的分子结构。通常，结合位点位于抗体的互补决定区(CDR)内，此处也称为“CDR结合位点”，其为具有不同结构的特异性区域，赋予结合到各种抗原的功能。该不同的结构可获自天然的抗体库，例如鼠科或人库，或可重组或合成产生，例如通过诱变以及特别地通过随机化技术产生。这些包括可变抗体域的诱变CDR区、环区，特别是抗体的CDR环，例如任何VL和/或VH抗体域的CDR1、CDR2和CDR3环。本发明使用的抗体形式通常包含一个或多个CDR结合位点，每个结合位点对一抗原具有特异性。
本文使用的术语“特异性”或“双特异性”指一结合反应，所述结合反应对于异质分子群中的目标同源配体具有决定性。因此，在特定条件下，例如免疫测定条件下，特异性地结合其特定目标的抗体形式并不以显著的量结合到存在于样品中的其它分子上。
特异性结合位点通常并不与其它目标交叉反应。然而，特异性结合位点可特异性地结合到目标的一个或多个表位、亚型或变体，或与其它相关目标抗原例如同系物或类似物交叉反应。
特异性结合是指根据选择的目标识别度，高、中或低结合亲和力或亲合力进行的选择性结合。如果结合常数或结合动力学相差至少10倍，通常可获得选择性结合，优选差异为至少100倍，以及更优选至少1000倍。
本发明双特异性抗体形式特别地包含两个或多个结合位点，可能具有特异性结合性质的3或4个结合位点，其中该抗体形式识别至少两种不同的目标抗原。因此，示例性双特异性抗体形式可包含两个结合位点，其中每个结合位点能够特异性地结合一不同的抗原，例如死亡受体和B细胞的细胞表面抗原。在双特异性抗体形式包含多于两个结合位点的情况下，其可指向多于两种不同的目标抗原和/或包含多于一种效价以特异性地结合单种或相同类型的目标抗原。
本文相对于抗体或抗体形式的结合位点使用的术语“单价”指仅包含一个指向目标抗原的结合位点的分子。术语“价”因此理解为指向相同目标抗原的结合位点的数目，该结合位点特异性地结合抗原的相同表位或结合抗原的不同表位。在本发明使用的抗体或抗体形式包含两个或多个结合位点的情况下，例如相对于相同目标抗原的2、3或4个结合位点，其特异性地指向抗原的相同或不同表位，这被称为双价或多价。
本发明使用的抗体形式理解为包含特异性地结合死亡受体目标的单价结合位点，以及特异性的结合B细胞特别是自身反应性B细胞表达的细胞表面抗原的至少一个另外的结合位点。因此，相对于死亡受体结合为单价，相对于细胞表面抗原结合是单价、双价或多价。
本文与术语“目标”或“目标抗原”互换使用的术语“抗原”指抗体结合位点识别的整个目标分子或这种分子的片段。特别地，抗原的亚结构，例如多肽或糖结构，一般称为“表位”，例如B细胞表位或T细胞表位，其为免疫相关，其可被这种结合位点识别。本文使用的术语“表位”特别指一分子结构，该分子结构可完全构成本发明抗体形式的结合位点的特异性结合伴侣，或作为特异性结合伴侣的一部分。表位可由糖、肽结构、脂肪酸、有机、生化或无机物质或它们的衍生物以及它们的任何组合构成。如果表位包含在肽结构中，例如肽、多肽或蛋白质，其通常包含至少3个氨基酸，优选5-40个氨基酸，以及更优选大约10-20个氨基酸。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或糖链的一级序列的单段构成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由氨基酸或糖构成，所述氨基酸或糖通过折叠多肽联系在一起以形成三级结构，并且在线性序列中，氨基酸不必彼此相邻。
本文相对于B细胞使用的术语“细胞表面抗原”指B细胞表面表达的抗原，优选成熟的、激活的或自身反应性B细胞，其可被与其结合的拮抗物靶向。示例性B细胞表面标记包括CD19、CD20和CD40。
特定目标的B细胞表面抗原优选在自身反应性B细胞表面高度表达，优选大于10000个分子/细胞。
特异性结合选自CD19、CD20和CD40的抗原的结合位点可获自指向抗原的市售单克隆抗体，例如指向CD20的利妥昔或奥瑞珠(ocrelizumab)。特别地，可使用图9作为示例的获自任何抗CD20抗体形式的结合位点。
术语“CD19”包括人CD19的任何变体、亚型和物种同源物，其由细胞自然地表达，或表达在用CD19基因转染的细胞上。
术语“CD20”包括人CD20的任何变体、亚型和物种同源物，其由细胞自然地表达，或表达在用CD20基因转染的细胞上。
术语“CD40”包括人CD40的任何变体、亚型和物种同源物，其由细胞自然地表达，或表达在用CD40基因转染的细胞上。
本文相对于B细胞使用的术语“死亡受体”指获自细胞表面上的受体的抗原，所述细胞通过一种或多种凋亡途径引致程序性细胞死亡。示例性死亡受体表达在激活的B细胞上，并包括例如CD95、TRAIL受体(例如TRAIL-R1或TRAIL-R2)以及TNF受体。与激活的B细胞相反，CD95并不表达在正常静息B细胞上。
CD95也称为Fas或Apo-1，并且是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。特异性地结合CD95的结合位点可获自指向CD95的抗体，例如Acris Antibodies,Herford,Germany提供的克隆APO-1或LT95和DX 2。特别地，可使用图9作为示例的获自任何抗CD95抗体形式的结合位点。
术语“CD95”包括人CD95的任何变体、亚型和物种同源物，其由细胞自然地表达，或表达在用CD95基因转染的细胞上。
术语“变体”指突变体，其例如通过定点突变获得，以特别地删除、交换、将插入物引入特定抗体区或化学衍生氨基酸序列，以在恒定域中改造抗体效应功能或半衰期，或在可变域中改善抗原结合性质，例如通过亲和力成熟技术进行。可采用任何已知的诱变方法，包括在所需位置处的点突变，例如通过随机化技术获得的点突变。在一些情况下，位置是随机挑选的，例如，可选择任意可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。术语“变体”应特别地包括功能活性变体。
术语分子的“功能活性变体”，例如本文使用的抗体，是指通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸，或化学衍生一个或多个氨基酸残基或序列内或位于序列远端的任一端或两端的核苷来修饰这个序列(亲本序列)获得的序列，并且，该修饰不影响(特别是削弱)这个序列的活性。在结合位点对选定的目标抗原具有特异性的情况下，分子的功能活性变体将仍然具有预定的结合特异性，尽管这可被改变，例如以改变对特定表位的良好特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。
功能活性变体可通过改变亲本抗体形式的序列(例如图9中的任何序列，如图9E i)或ii)的NA-C20序列)来获得，并且其特征在于具有类似于各序列表现的生物活性，包括结合CD20和/或CD95的能力，或靶向激活的或自身反应性B细胞的能力。
抗体形式的功能活性变体优选具有基本相同的生物活性(如通过特定结合试验或功能测试确定的)，以靶向激活的或自身反应性B细胞。本文使用的术语“基本相同的生物活性”指由基本相同活性为亲本抗体形式(例如图9B的重组双特异性抗体形式NA-C20)测得活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少100％或至少110％，或至少120％，或至少130％，或至少140％，或至少150％，或至少160％，或至少170％，或至少180％，或至少190％，例如高达200％表示的活性。
在一个优选实施例中，功能活性变体
a)为该分子的生物活性片段，该片段包含分子序列的至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，以及最优选至少97％、98％或99％；
b)是来自至少进行一个氨基酸取代、添加和/或删除的分子，其中所述功能活性变体与所述分子或者其一部分具有序列一致性，例如具有至少50％序列一致性的抗体，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，以及最优选至少97％、98％或者99％的序列一致性；和/或
c)由该分子或其功能活性变体以及额外地与多肽或核苷酸序列异源的至少一个氨基酸或核苷酸构成，优选其中功能活性变体获自任何天然存在或重组的抗CD19、抗CD20、抗CD40和/或抗CD95抗体。
在本发明一个优选实施方式中，本发明抗体的功能活性变体基本与上面描述的变体相同，但其多肽或核苷酸序列分别不同，不同之处在于其获自不同物种的同源序列。这些都被称为天然存在的变体。
本发明特别地提供了嵌合、人化或人序列以及包含这类嵌合、人化或人序列的亲本抗体形式的功能活性变体。
相对于本发明抗体形式使用的术语“嵌合”指那些抗体，其中每条重链和轻链的氨基酸序列的一部分与获自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而该链的其余段与另一物种或类的相应序列同源。通常，轻链和重链两者的可变区模拟获自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与获自另一种的抗体的序列同源。例如，可变区可利用来自非人宿主有机体的容易获得的B细胞或杂交瘤以及获自例如人细胞制品的恒定区从目前已知的来源获得。
相对于本发明抗体形式使用的术语“人化”指具有抗原结合位点的分子，其基本上从来自非人物种的免疫球蛋白获得，其中该分子剩余的免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包含融合到恒定域上的完整的可变域，或仅包含嫁接到可变域中合适的框架区的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或经过修饰，例如通过一个或多个氨基酸取代进行的修饰，优选经修饰以与人免疫球蛋白更加类似。一些人化抗体形式保持所有CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六种CDR的人化小鼠抗体)。其它形式具有相对于原抗体被改变的一个或多个CDR。
相对于本发明抗体形式使用的术语“人”，理解为包括具有获自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明人抗体形式可包括不被人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变引入的突变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。本发明的人抗体形式包括从人免疫球蛋白文库或从转基因用于一种或多种人免疫球蛋白的动物中分离的抗体。
术语“功能活性变体”还包括天然存在的等位基因变体，以及突变体或任何其它非天然存在的变体。在现有技术中众所周知的是，等位基因变体是一种(多)肽的替代形式，其特征是具有一个或多个氨基酸的替换、删除或添加，其本质上不会改变多肽的生物功能。
功能活性变体可通过多肽或核苷酸序列中的序列改变获得，例如通过一个或多个点突变，其中当与本发明组合使用时，所述序列改变保留未改变多肽或核苷酸序列的功能。这样的序列改变可包括但不限于(保守)取代、添加、删除、突变和插入。
CDR变体包括被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是化学修饰或氨基酸序列的部分改变，该修饰能使变体保留未修饰序列的生物学特征。例如，该变体为与CD19、CD20、CD40或CD95结合的功能变体。CDR氨基酸序列的部分改变可以是删除或取代一至数个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或者是添加或插入一至数个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或者是化学衍化一至数个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的取代可以是保守性取代，例如，将一个疏水性氨基酸取代为另一疏水性氨基酸。
保守取代是发生在与它们的侧链和化学性质相关的氨基酸家族内的那些。这些家族的实例有具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香烃侧链的氨基酸、具有不带电极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸及具有大侧链的氨基酸等。
点突变特别地理解为多核苷酸的改造，其导致不同于未经改造的氨基酸序列的氨基酸序列的表达，不同之处在于一个或多个单(非连续)或双重氨基酸取代或交换、删除或插入不同的氨基酸。
优选的点突变是相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸指由64个三联体密码子编码的20个天然存在的氨基酸。这20个氨基酸可分为：具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
“中性”氨基酸在下面连同它们各自的三个字母和单个字母代码和极性一起显示：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys,C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gln,Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly,G)非极性，中性；
异亮氨酸：(Ile,I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu,L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met,M)非极性，中性；
苯丙氨酸：(Phe,F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro,P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser,S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr,T)极性，中性；
色氨酸：(Trp,W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr,Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val,V)非极性，中性；以及
组氨酸：(His,H)极性，正电荷(10％)中性(90％)
“正”电荷的氨基酸是：
精氨酸：(Arg,R)极性，正电荷；以及
赖氨酸：(Lys,K)极性，正电荷。
“负”电荷的氨基酸是：
天冬氨酸：(Asp,D)极性，负电荷；以及
谷氨酸：(Glu,E)极性，负电荷。
本文相对于多肽序列确定的“百分比(％)氨基酸序列一致性”定义为：在比对序列和引入缺口(如果需要)以获得最大百分比序列一致性后，以及不考虑将任何保守取代作为序列一致性的一部分的情况下，候选序列中氨基酸残基与特定多肽序列中氨基酸残基相同的百分比。本领域技术人员可确定测量比对的合适参数，包括在待比较的全长序列上获得最大比对所需的任何算法。
本文使用的术语“主体”指温血哺乳动物，特别是人类。需要预防或治疗自身反应性B细胞紊乱的主体特别地可以是患有早期或晚期疾病的患者，或者倾向患这类疾病(例如，遗传倾向性)的主体。
因此，本发明的主题基于意想不到的发现，即，典型的双特异性抗体构造，特异性地结合激活的B细胞表面上的CD95和CD19、CD20或CD40，特异性地遏制IgG产生并抑制IgG合成，从而降低主体中IgG的产生水平并降低主体中的自身免疫反应。对于本发明描述以及图1B描绘的重组双特异性抗体NA-C20，证明了其不仅遏制多克隆激活的B细胞产生抗体，而且遏制更特异性激活的B细胞产生抗体，所述更特异性激活的B细胞产生抗破伤风类毒素特异性抗体。
之前描述过，对CD20和死亡受体CD95具有特异性的双特异性抗体能够诱导CD20阳性淋巴瘤细胞中CD95介导的凋亡。意想不到地，结果是本发明的CD20×CD95杂交抗体诱导表达CD95的美洲商陆有丝分裂原(PWM)激活的B细胞的调亡，而不会诱导缺乏其的静息细胞凋亡。PWM体外诱导的抗体产生被极度抑制。这些结果表明，本发明双特异性CD20×CD95抗体可用于治疗抗体介导的自身免疫疾病。与单特异性CD20抗体相比，这些试剂为激活的而非静息的B细胞提供了新的效应原理和特异性。
另外，确定了本发明双特异性CD20×CD95抗体和特定抗体形式体外杀死激活的人B细胞的能力并与抗CD20抗体利妥昔进行比较。
本发明典型的双特异性抗体形式能够靶向具有CD20和CD95的细胞，触发CD95死亡受体。CD20/CD95阳性激活的B细胞的存在的升高通常与红斑狼疮和类风湿关节炎中的耀斑相关。多发性硬化症(MS)中包含激活的B细胞，这也越来越被接受，因为它们包含在例如T细胞补充和激活、细胞因子释放和抗体产生中。
体外研究显示，本发明典型的双特异性抗体形式可下调激活的人B细胞产生免疫球蛋白。我们发现其具有高度选择性，从而通过减少非特异性反应避免了副作用。
本发明抗体形式对激活的B细胞产生IgG的遏制以及对IgG合成的抑制被理解为“IgG抑制活性”。这种IgG抑制活性涉及激活的B细胞，特别是自身反应性B细胞，并意图包括与相同细胞但不接触本发明抗体形式的IgG产生相比，IgG水平的任何可测量下降，特别是自身免疫抗体产生的减少，例如，在采用激活的B细胞的测试系统中，IgG降低至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
根据一个特定的实施方式，本发明的抗体形式具有凋亡活性，即独立于免疫效应细胞例如NK细胞，对抗目标B细胞的直接细胞毒活性。特别地，本发明的抗体形式具有凋亡活性，如在标准凋亡试验中测量的，例如如在标准DNA片段化试验中测量的。
凋亡活性优选使用确定濒死和/或死亡的细胞的标准方法测定。为了测量凋亡，可采用细胞毒性试验。这些试验可以是测量质膜通透性提高的放射性和非放射性试验，因为濒死细胞变得泄漏，或可以是测量线粒体代谢活性的比色试验。死亡细胞中的线粒体不能代谢染料，而活细胞中的线粒体可以。
还可测量凋亡的早期指标，例如导致细胞表面外侧出现磷酯酰丝氨酸的膜不对称性的改变(基于膜联蛋白V的试验)。或者，可在细胞群或独立的细胞中测量凋亡后期例如胱天蛋白酶的激活。此外，可确定细胞色素C和AIF通过线粒体或染色体DNA片段释放到细胞质中的测量。
末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)是检测由凋亡信号通路导致的DNA片段的常见方法。该试验依赖于可被末端脱氧核苷酸转移酶识别的DNA中缺口的存在，所述末端脱氧核苷酸转移酶催化溴化dUTP的添加，其可用特定标记的抗体二次检测。
优选的本发明抗体形式的凋亡活性达细胞溶解的至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％，如在各离体细胞杀死试验中所测量的；例如，在培养后用双特异性抗体通过流式细胞仪测量B细胞的存活。
由于缺少Fc效应功能，本发明抗体形式特别地在免疫效应细胞存在时不具有明显的细胞毒活性，如在标准ADCC或CDC试验中所测量的，例如采用在细胞表面表达受体目标的细胞。
如果相对于对照，细胞溶解百分比没有显著升高，本发明任何抗体形式可显示低细胞毒活性，如ADCC或CDC试验所确定的。如果通过ADCC和/或CDC活性的绝对百分比提高测量的细胞毒活性优选低于10％，优选低于5％，更优选低于3％，通常可确定Fc效应功能的缺失。
优选地，使用结合一种或两种目标抗原的抗体形式，所述目标抗原具有高亲和力，特别是具有高的结合率和/或低脱除率，或高的结合亲合力。抗体的结合亲合力的特征常在于抗体浓度方面，在该浓度下，半数抗原结合位点被占据，被称为解离常数(Kd或KD)。通常，Kd<10-8M，优选Kd<10-9M，甚至更优选Kd<10-10M的结合物被认为是高亲和力结合物。
但是，在另一优选实施方式中，单独的抗原结合亲合力是中等亲合力，例如Kd小于10-6M以及高达10-8M，例如当结合至少两种抗原时。
本发明双特异性单克隆抗体形式可通过多种技术产生，包括两种Fab片段的化学杂交(导致产生双特异性Fab2片段((Fab’)2，bsFab2))，以及重组抗体技术，可选地采用杂交瘤或人抗体序列文库。实施例中提供的数据用bsFab2片段((Fab’)2)或图1B中描绘的重组bsFab×sc形式获得。优选重组抗体技术，因为其可以通过转染细胞和简化的纯化重复生产。
本发明抗体形式优选用在药物组合物中。其中配制有本发明抗体形式和一种或多种治疗活性剂的药物组合物被考虑。将具有所需纯度的抗体形式可选地与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制备本发明抗体形式的稳定配方用于储存，其形式为冻干制剂、水溶液或水包油乳液。
通常，这样的组合物包含药学上可接受的已知的载体，所述载体为可接受的药物实践所要求，见，例如Remingtons Pharmaceutical Sciences(《雷氏药物科学》),16th edition(1980)MackPublishing Co。这样的载体的实施例包括经灭菌的载体，例如盐水，林格氏液或葡萄糖溶液，可选地用合适的缓冲液缓冲至pH在5-8范围内。
待用于体内服用的配方需无菌。这通过无菌过滤膜或其它合适的方法容易地达到。
包含本发明抗体形式的药物组合物可通过多种方法进行给药，包括全身性或肠胃外给药，优选无菌水溶液的形式，例如静脉内、肌内或皮下途径，还可以经口、鼻内、耳内(intraotically)、透皮、黏膜、局部(例如凝胶、药膏、洗液、乳膏等)、腹膜内、肌内、肺内、经阴道、肠胃外、经直肠或眼内给药。因此，本发明提供了适用于这些用途的相应配方的抗体形式。
本发明包括用药物制剂进行治疗，所述药物制剂包含治疗有效量的作为活性物质的本发明抗体形式。特别是，抗体形式的药学上可接受制品与需要其的主体的治疗兼容。
此处使用的术语“治疗有效量”可与本发明抗体形式的“有效量”或“足量”任一术语互换，其为一量或活性，足以在对主体给药时引起有益或所需效果，包括临床效果，并因此，有效量或其代名词取决于其施用的背景。例如，在IgG产生或合成抑制的情况下，其为足以抑制自身抗体升高的化合物的量，如通过将各IgG水平与没有给予该化合物获得的反应相比较确定的。在疾病的情况下，抗体形式的治疗有效量用以治疗、调节、减轻、逆转或影响得益于自身免疫反应的疾病或状况，例如，与自身反应性B细胞紊乱相关的急性或慢性炎症性疾病。有效量意指足以治疗、预防或抑制这些疾病或紊乱的化合物的量。相当于这一量的抗体形式的量根据不同因素而不同，例如给定的药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或紊乱的类型、主体或被治疗宿主的特性，等等，但可由本领域技术人员常规地确定。
提供给需要的人患者的抗体形式的治疗有效量可特别地在0.5-500mg，优选1-400mg，甚至更优选高达300mg，高达200mg，高达100mg，或高达10mg的范围内，尽管可使用较高的剂量例如用于治疗急性疾病状况。
此外，用本发明治疗有效量的抗体形式对主体进行的治疗或预防方法可由单次给药构成，或包含一系列的施用。例如，抗体形式可至少每年一次、至少每半年一次或至少一个月一次给药。但是，在另一实施方式中，抗体形式可对给定治疗进行约每周一次至约每天给药。治疗周期的长度依赖于多种因素，例如急性或慢性疾病的严重程度、患者年龄、抗体形式的浓度和活性。也将理解，用于治疗或预防的有效剂量可在特定治疗或预防方法的过程中提高或降低。通过本领域已知的标准诊断试验，剂量的改变可导致或变得明显。在一些情况下，可能需要慢性给药。
用于肠胃外给药的示例性制剂包括适用于皮下、肌内或静脉注射的那些制剂，例如，无菌溶液或悬液。
本发明抗体形式通常用以减轻自身免疫反应的症状，例如减少复发-缓解型MS(RRMS)的每年复发率，例如减少至低于50％，优选低于40％或低于30％。其它实施例是特发性血小板减少性紫癜(ITP)情况下因子大于2的血小板计数升高，或自身免疫性溶血性贫血情况下大于2mg/dl的血红蛋白浓度升高。
在一个实施方式中，本发明抗体形式是给予患者的唯一治疗活性剂，例如作为疾病改善单药疗法。
或者，本发明抗体形式与一种或多种其它治疗剂联合给药，包括但不限于标准治疗，例如MS情况中的β干扰素或类固醇，或ITP情况中的高剂量免疫球蛋白。
联合疗法特别地采用标准方法，例如用于治疗RRMS的标准方法。这可包括β干扰素或类固醇。
在联合疗法中，抗体形式可作为混合物给药，或伴随一种或多种其它治疗方法例如前面的任一方法同时或在伴随的疗法后给药。
本发明抗体形式的生物学性质可在离体细胞、组织或整个生物体实验中表征。如本领域所知，常在动物体内测试药物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子，以测量药物治疗疾病或疾病模型的功效，或测量药物的药代动力学、药效学性质、毒性和其它性质。动物可被称为疾病模型。疗法常在小鼠中测试，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这样的实验可提供有意义的数据用于确定抗体形式用作具有合适半衰期、效应功能、凋亡活性和IgG抑制活性的治疗的潜力。任何生物体优选哺乳动物可用于测试。例如，由于与人具有遗传相似性，灵长类动物、猴子是合适的治疗模型，因此可用以测试本发明抗体形式的功效、毒性、药代动力学、药效学性质、半衰期或其它性质。最终需要物质在人中的测试用于批准作为药物，而本文考虑了这些实验。因此，本发明抗体形式可在动物模型或人中测试以确定其治疗功效、毒性、免疫原性、药代动力学性质和/或临床性质。
通过参考下述实例能够更充分地理解上述说明。但是，这些实施例仅仅是代表实施本发明一个或多个实施方式的方法，不应解读为对本发明范围的限制。
实施例
实施例1A：
通过化学杂交Fab片段产生示例性抗体形式：
制备图1A中如上描述的双特异性(Fab’)2抗体，且如Jung等人.Eur.J.Immunol.(《欧洲免疫学杂志》).中描述。简要地说，CD20抗体利妥昔购自Roche Pharma AG(Germany)，CD95抗体(Apo-1抗体)纯化自杂交瘤培养物上清液。Apo-1抗体以纯化形式(BMS151)购自eBioscience,San Diego,CA 92121。抗体使用蛋白A亲和层析纯化，myc抗体获自杂交瘤克隆克隆9E10(CRL-1729,ATCC Manassas,VA,USA)的上清液。两种抗体都用胃蛋白酶消化，经修饰和杂交以获得前面提到的文章中描述的双特异性Fab2片段(bsFab2)。相应地产生具有CD40×CD95和myc×CD95特异性的双特异性抗体。指向CD40和myc蛋白的亲本抗体纯化自杂交瘤细胞(ATCC Manassas,VA,USA)的培养上清液。
以通用的方式，通过氧化单价(F(ab’))片段获得(Fab’)2片段来制备双特异性(Fab’)2抗体。
或者，双特异性(Fab’)2抗体可通过融合两种杂交瘤细胞系以给出四源杂交瘤(quadroma)细胞来产生，或通过重组抗体技术产生。
实施例1B：通过重组工程产生示例性抗体形式，重组双特异性Fab单链(此处也称为 bsFab×sc或NA-C20)：
制备图1B中如上描述的双特异性NA-C20抗体并采用图9种描述的序列。利用标准技术将编码抗体的遗传构造稳定地转染到Sp2/0细胞内。使用带有κ选择的亲和层析(购自GE-Healthcare,Life Sciences,Freiburg,Germany)从转染的细胞中纯化蛋白质。
实施例2：CD95在用1μg/mL PWM激活的人B细胞上的表达：
将利用密度梯度离心分离的正常健康捐献者外周血单核细胞(PBMC)与美洲商陆有丝分裂原(PWM,1μg/ml,Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germany)培养6天并洗涤。在指定的时间点，将细胞从培养瓶中移除，并通过流式细胞仪进行分析。为此，用耦合到太平洋蓝的CD19抗体或同型对照抗体、耦合到别藻蓝蛋白(APC)和7-氨基-放线菌素D(7-AAD)染料的CD95抗体将细胞染色，以清楚地鉴别活细胞。活的CD19阳性细胞经设门并进行分析。抗体购自Biolegend,San Diego,CA92121。结果在图2中提供。同型对照获得明亮的轮廓-CD95抗体获得深色轮廓。
结论：静息B细胞上检测不到CD95，而其表达在PWM刺激1天后升高，在第3天达到其最大值，并维持高值直至第10天，尽管在第6天洗涤细胞。
实施例3：通过PWM激活的B细胞产生IgG的动力学：
用PWM(1μg/ml)刺激正常的PBMC。多次后，移除等份的培养上清液并通过ELISA分析人IgG含量。结果在图3中提供。用PWM刺激PBMC(实心圆)诱导产生人IgG。在第4天可检测到抗体产生，并持续升高至第10天。未刺激的PBMC的抗体产生的测量(空心圆)用作对照。
结论：PWM刺激5天后可检测到IgG产生，并持续升高到第10天。
实施例4：来自未刺激的PBMC的CD19+B细胞和CD4/CD8+T辅助/杀伤细胞的耗竭：
未刺激的PBMC用指定的抗体(1μg/ml)培养4天、洗涤并利用耦合到太平洋蓝的CD19抗体、耦合到异硫氰酸荧光素(FITC)的CD4抗体、耦合到APC和活力染料7-AAD(Biolegend,San Diego,CA92121)的CD8抗体通过流式细胞仪分析。NA-C20是描绘于图1B中的重组双特异性抗体。结果在图4中提供。
结论：提到的抗体中没有一个影响未刺激PBMC培养物中的T细胞或B细胞。
实施例5：来自经刺激的PBMC的CD19+B细胞和CD4/CD8+T辅助/杀伤细胞的耗竭：
PBMC用美洲商陆有丝分裂原(PWM,Sigma-Aldrich,1μg/ml)刺激6天、洗涤并用指定的抗体(1μg/ml)培养4天。在第10天如图4所描述的通过流式细胞仪分析细胞。结果在图5中提供。NA-C20是描绘于图1B中的bsFab×sc形式的重组双特异性抗体。
结论：两种双特异性CD20×CD95抗体引起PWM刺激的PBMC中的B细胞耗竭。T细胞不受影响。具有Myc×CD95特异性的化学杂交对照抗体无效。
实施例6：体外抗体生产的抑制：
通过密度梯度离心将人外周血单核细胞(PBMC)从肝素化血液中分离出来，以1x106细胞/ml接种于6孔平板中，并用凝集素商陆有丝分裂原(PWM,1μg/ml,Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗涤细胞，并加入指定抗体。在第10天，通过ELISA测量上清液中人IgG的量。NA-C20是描绘于图1B中的bsFabXsc形式的重组双特异性抗体。结果在图6中提供。
结论：两种双特异性CD20×CD95抗体抑制经刺激的人PBMC产生IgG。具有Myc×CD95特异性的化学杂交对照抗体则不会。
实施例7：双特异性抗体介导的体外PMW诱导的IgG合成抑制：
通过密度梯度离心从肝素化血液中分离三个不同的健康捐献者(图7A-7C)人外周血单核细胞(PBMC)，以1x106细胞/ml接种于6孔平板中，并用凝集素美洲商陆有丝分裂原(PWM,1μg/ml,Sigma Aldrich)刺激。在第6天，洗涤细胞，加入双特异性F(ab’)2抗体(即F(ab’)2抗体形式)。在第10天，通过ELISA测量上清液中人IgG的量。被测试的双特异性抗体特异性地靶向CD20×CD95(实心圆)或CD40×CD95(三角形)。作为比较，平行测试带有指向细胞内myc蛋白(myc×CD95)的不相关靶向特异性的双特异性抗体(空心圆)(即，F(ab’)2抗体形式)。
结论：
具有CD20×CD95或CD40×CD95特异性的双特异性Fab2抗体抑制激活的人B细胞在体外产生IgG，具有Myc×CD95特异性的抗体则不会。
实施例8：破伤风类毒素特异性IgG生产的抑制
用破伤风类毒素(25ng/ml,Calbiochem,Merck Darmstadt,Germany)刺激经破伤风类毒素新鲜接种的捐献者的PBMC 4天，洗涤并用指定抗体(1μg/ml)培养8天。在第12天，通过ELISA确定特异性抗破伤风抗体的量。NA-C20是图1B中描绘的bsFab×sc形式的重组双特异性CD20×CD95抗体。结果在图8中提供。
结论：重组双特异性CD20×CD95抗体NA-C20和单特异性抗CD20抗体利妥昔抑制体外特异性抗破伤风类毒素抗体的产生。指向EGF受体(爱必妥)或CD95和黑色素瘤相关的蛋白多糖(NA-CMel)的具有不相关目标特异性的相应单和双特异性抗体各自无效。NA-CMel是与NA-C20相同形式的重组双特异性抗体。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.缺乏活性Fc部分的双特异性抗体形式，包含用于死亡受体的单价结合位点和用于B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点，用于治疗或预防B细胞介导的自身免疫疾病。
2.根据权利要求1使用的双特异性抗体形式，其中所述死亡受体选自：CD95、TRAIL受体和TNF受体，优选CD95。
3.根据权利要求1或2使用的双特异性抗体形式，其中所述细胞表面抗原选自：CD19、CD20和CD40，优选CD20。
4.根据权利要求1-3任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式包含特异性结合CD95的单价结合位点和特异性结合CD19、CD20或CD40的至少一个结合位点。
5.根据权利要求1-4任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述B细胞介导的自身免疫疾病由异常、过度或不希望出现的免疫反应导致。
6.根据权利要求1-5任一项使用的双特异性抗体形式，其中B细胞介导的自身免疫疾病是自身免疫紊乱，优选选自：系统性红斑狼疮、硬皮病、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、移植体对抗宿主疾病、皮肌炎、I型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、阿迪森氏病、脂泄病、克罗恩病、恶性贫血、寻常型天疱疮、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞性动脉炎、重症肌无力、多发性硬化症（MS），优选复发缓解型MS（RRMS）、血管球性肾炎、古德帕斯丘综合症、大疱性类天疱疮、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗磷脂综合症、发作性睡病、结节病以及韦格纳氏肉芽肿。
7.根据权利要求1-6任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式是包含至少2个抗体域，优选至少3、4、5、6、7或8个抗体域以及可选铰链区的重组分子。
8.根据权利要求1-7任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述抗体域是人源的或非人哺乳动物的人化抗体域，优选人化、鼠科或骆驼来源。
9.根据权利要求1-8任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式包含由获自抗体域的互补决定区（CDR）形成的至少两个结合位点，所述抗体域优选选自VH和VH/VL域对，优选至少一个或两个VH和/或至少一个或两个VH/VL域对。
10.根据权利要求1-9任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式包含VH/VL结合位点和/或scFv结合位点的至少之一，以及可选地CH1、CL、 CH2或CH3域至少之一。
11.根据权利要求1-10任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式缺少Fc部分或包含经改造以灭活或减少其Fc效应功能的Fc部分，所述改造优选通过Fc部分中的一个或多个突变实现。
12.根据权利要求1-11任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式选自：scFv、Fab与一个或多个抗体可变域的组合、F(ab’)2和它们的组合，优选采用至少一个抗体恒定域作为连接物。
13.根据权利要求1-12任一项使用的双特异性抗体形式，其包含
-包含用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段；
-包含用于第二抗原的第二结合位点的scFv片段；
-CH2域，其中Fab片段和scFv片段通过CH2域连接，其中
a）第一抗原是CD95，第二抗原选自CD19、CD20和CD40，优选CD20；或
b）第一抗原选自CD19、CD20和CD40，优选CD20，第二抗原是CD95。
14.根据权利要求1-13任一项使用的双特异性抗体形式，其中结合CD20的结合位点包含抗体可变域的六个互补决定区（CDR1至CDR6），其中
A）
i）CDR1包含氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)；
ii）CDR2包含氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)；
iii）CDR3包含氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)；
iv）CDR4包含氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)；
v）CDR5包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)；以及
vi）CDR6包含氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV（SEQ ID 18）；
或者
B）其功能活性变体，其中至少一个
i）CDR1包含与氨基酸序列RASSSVSYM (SEQ ID 12)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
ii）CDR2包含与氨基酸序列APSNLAS (SEQ ID 13)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
iii）CDR3包含与氨基酸序列QQWSFNPPT (SEQ ID 14)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
iv）CDR4包含与氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
v）CDR5包含与氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
和/或
vi）CDR6包含与氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)至少70%的序列一致性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14任一项使用的双特异性抗体形式，其包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体，所述VL域包含SEQ ID 11的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 15的氨基酸序列。
16.根据权利要求15使用的双特异性抗体形式，其中所述变体为包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 19的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 20的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16任一项使用的双特异性抗体形式，其中结合CD95的结合位点包含六个可变抗体域的互补决定区（CDR1至CDR6），其中
A）
i）CDR1包含氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ（SEQ ID 2）；
ii）CDR2包含氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)；
iii）CDR3包含氨基酸序列QQSTKVPWT (SEQ ID 4)；
iv）CDR4包含氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)；
v）CDR5包含氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)；以及
vi）CDR6包含氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)；
或者
B）其功能活性变体，其中至少一个
i）CDR1包含与氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
ii）CDR2包含与氨基酸序列VASNVES (SEQ ID 3)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
iii）CDR3包含与氨基酸序列QQSTKVPWT (SEQ ID 4)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
iv）CDR4包含与氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
v）CDR5包含与氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)至少70%的序列一致性的氨基酸序列；
和/或
Vi）CDR6包含与氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)至少70%的序列一致性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17任一项使用的双特异性抗体形式，其包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体，所述VL域包含SEQ ID 1的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 5的氨基酸序列。
19.根据权利要求18使用的双特异性抗体形式，其中所述变体为包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 9的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 10的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19任一项使用的双特异性抗体形式，其包含SEQ ID 21的轻链序列和SEQ ID 22的重链序列，或它们的功能活性变体。
21.根据权利要求20使用的双特异性抗体形式，其中所述变体为包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 24的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 25的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21任一项使用的双特异性抗体形式，其包含鼠科、嵌合和/或人化序列。
23.根据权利要求1-22任一项使用的双特异性抗体形式，其与CD20的Kd<10-8M和/或与CD95结合的Kd<10-8M。
24.根据权利要求1-23任一项使用的双特异性抗体形式，其用在与B细胞介导的自身免疫疾病的其它治疗的组合疗法中，优选与细胞因子治疗或其它抗体形式或试剂的治疗的组合。
25.根据权利要求1-24任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述抗体形式以治疗有效量对需要其的主体给药。
26.一种治疗或防止B细胞介导的自身免疫疾病的方法，包括对需要的主体给予治疗有效量的双特异性抗体形式，该抗体形式缺少活性Fc部分，包含用于死亡受体的单价结合位点以及用于在B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点。
27.一种用于治疗自身反应性B细胞的方法，包括将所述细胞与包含权利要求1-23任一项中限定的双特异性抗体形式的组合物相接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中死亡受体和所述细胞表达的细胞表面抗原被双特异性抗体形式靶向，从而抑制所述细胞产生IgG。
 
 

Claims (28)

1.缺乏一活性Fc部分的双特异性抗体形式，包含用于死亡受体的单价结合位点和用于B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点，用于治疗或预防自身反应性B细胞紊乱。
2.根据权利要求1使用的双特异性抗体形式，其中所述死亡受体选自：CD95、TRAIL受体和TNF受体，优选CD95。
3.根据权利要求1或2使用的双特异性抗体形式，其中所述细胞表面抗原选自：CD19、CD20和CD40，优选CD20。
4.根据权利要求1-3任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式包含特异性结合CD95的单价结合位点和特异性结合CD19、CD20或CD40的至少一个结合位点。
5.根据权利要求1-4任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述自身反应性B细胞紊乱由异常、过度或不希望出现的免疫反应，优选非癌症导致。
6.根据权利要求1-5任一项使用的双特异性抗体形式，其中自身反应性B细胞紊乱是自身免疫紊乱，优选选自：系统性红斑狼疮、Sjogren综合症、硬皮病、类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、移植体对抗宿主疾病、皮肌炎、I型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、阿迪森氏病、脂泄病、克罗恩病、恶性贫血、寻常型天疱疮、白癜风、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、巨细胞性动脉炎、重症肌无力、多发性硬化症(MS)，优选复发缓解型MS(RRMS)、血管球性肾炎、古德帕斯丘综合症、大疱性类天疱疮、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、抗磷脂综合症、发作性睡病、结节病以及韦格纳氏肉芽肿。
7.根据权利要求1-6任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式是包含至少2个抗体域，优选至少3、4、5、6、7或8个抗体域以及可选铰链区的重组分子。
8.根据权利要求1-7任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述抗体域是人源的或非人哺乳动物的人化抗体域，优选人化、鼠科或骆驼来源。
9.根据权利要求1-8任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式包含由互补决定区(CDR)形成的至少两个结合位点，优选的，CDR获自抗体域，所述抗体域优选选自VH和VH/VL域对，优选至少一个或两个VH和/或至少一个或两个VH/VL域对。
10.根据权利要求1-9任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式包含VH/VL结合位点和/或scFv结合位点的至少之一，以及可选地CH1、CL、CH2或CH3域至少之一。
11.根据权利要求1-10任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式缺少Fc部分或包含经改造以灭活或减少其Fc效应功能的Fc部分，所述改造优选通过Fc部分中的一个或多个突变实现。
12.根据权利要求1-11任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述形式选自：scFv、Fab与一个或多个抗体可变域的组合、F(ab’)2和它们的组合，优选采用至少一个抗体恒定域作为连接物。
13.根据权利要求1-12任一项使用的双特异性抗体形式，其包含
-包含用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段；
-包含用于第二抗原的第二结合位点的scFv片段；
-CH2域，其中Fab片段和scFv片段通过CH2域连接，其中
a)第一抗原是CD95，第二抗原选自CD19、CD20和CD40，优选CD20；或
b)第一抗原选自CD19、CD20和CD40，优选CD20，第二抗原是CD95。
14.根据权利要求1-13任一项使用的双特异性抗体形式，其中结合CD20的结合位点包含抗体可变域的六个互补决定区(CDR1至CDR6)，其中
A)
i)CDR1包含氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)；
ii)CDR2包含氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)；
iii)CDR3包含氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)；
iv)CDR4包含氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)；
v)CDR5包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)；以及
vi)CDR6包含氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)；
或者
B)其功能活性变体，其中至少一个
i)CDR1包含与氨基酸序列RASSSVSYM(SEQ ID 12)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
ii)CDR2包含与氨基酸序列APSNLAS(SEQ ID 13)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
iii)CDR3包含与氨基酸序列QQWSFNPPT(SEQ ID 14)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
iv)CDR4包含与氨基酸序列SYNMH(SEQ ID 16)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
v)CDR5包含与氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID 17)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
和/或
vi)CDR6包含与氨基酸序列VVYYSNSYWYFDV(SEQ ID 18)至少70％的序列一致性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1-14任一项使用的双特异性抗体形式，其包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体，所述VL域包含SEQ ID 11的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 15的氨基酸序列。
16.根据权利要求15使用的双特异性抗体形式，其中所述变体为包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 19的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 20的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-16任一项使用的双特异性抗体形式，其中结合CD95的结合位点包含可变抗体域的六个互补决定区(CDR1至CDR6)，其中
A)
i)CDR1包含氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)；
ii)CDR2包含氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)；
iii)CDR3包含氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)；
iv)CDR4包含氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)；
v)CDR5包含氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)；以及
vi)CDR6包含氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)；
或者
B)其功能活性变体，其中至少一个
i)CDR1包含与氨基酸序列RASESVEYYGTSLMQ(SEQ ID 2)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
ii)CDR2包含与氨基酸序列VASNVES(SEQ ID 3)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
iii)CDR3包含与氨基酸序列QQSTKVPWT(SEQ ID 4)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
iv)CDR4包含与氨基酸序列TNAMN(SEQ ID 6)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
v)CDR5包含与氨基酸序列RIRSKSNNYATYYAESVKD(SEQ ID 7)至少70％的序列一致性的氨基酸序列；
和/或
Vi)CDR6包含与氨基酸序列DGYY(SEQ ID 8)至少70％的序列一致性的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-17任一项使用的双特异性抗体形式，其包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体，所述VL域包含SEQ ID 1的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 5的氨基酸序列。
19.根据权利要求18使用的双特异性抗体形式，其中所述变体为包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 9的氨基酸序列，所述VH域包含SEQID 10的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-19任一项使用的双特异性抗体形式，其包含SEQ ID 21的轻链序列和SEQID 22的重链序列，或它们的功能活性变体。
21.根据权利要求20使用的双特异性抗体形式，其中所述变体为包含VL域和/或VH域或它们的功能活性变体的人化变体，所述VL域包含SEQ ID 24的氨基酸序列，所述VH域包含SEQ ID 25的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21任一项使用的双特异性抗体形式，其包含鼠科、嵌合和/或人化序列。
23.根据权利要求1-22任一项使用的双特异性抗体形式，其与CD20的Kd<10-8M和/或与CD95结合的Kd<10-8M。
24.根据权利要求1-23任一项使用的双特异性抗体形式，其用在与自身反应性B细胞紊乱的其它治疗的组合疗法中，优选与细胞因子治疗或其它抗体形式或试剂的治疗的组合。
25.根据权利要求1-24任一项使用的双特异性抗体形式，其中所述抗体形式以治疗有效量对需要其的主体给药。
26.一种治疗或防止自身反应性B细胞紊乱的方法，包括对需要的主体给予治疗有效量的双特异性抗体形式，该抗体形式缺少活性Fc部分，包含用于死亡受体的单价结合位点以及用于在B细胞上表达的细胞表面抗原的至少一个结合位点。
27.一种用于治疗自身反应性B细胞的方法，包括将所述细胞与包含权利要求1-23任一项中限定的双特异性抗体形式的组合物相接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中死亡受体和所述细胞表达的细胞表面抗原被双特异性抗体形式靶向，从而抑制所述细胞产生IgG。
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