CN104105703A - 带电的氟碳化合物组合物在纯化生物分子的方法中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的且改进的纯化生物分子的方法。具体地,本发明涉及采用带电的氟碳化合物组合物修饰的多孔固体支持物来纯化蛋白的方法。
Description
相关申请
本申请要求提交日期为2012年3月26日的美国临时专利申请第61/615,609号和提交日期为2012年6月29日的美国临时专利申请第61/666,506的优先权,上述申请各自整体援引加入本文。
技术领域
本发明涉及新的且改进的纯化生物分子的方法。具体地,本发明涉及蛋白纯化的方法,其采用带电的氟碳化合物组合物,例如磺化氟化组合物。
背景技术
制备生物分子如靶蛋白(例如,重组治疗蛋白和抗体)的一般方法通常包括两个主要步骤:(1)在宿主细胞中表达靶蛋白,以及(2)靶蛋白的纯化。第一步一般包括使期望的宿主细胞在生物反应器中生长以促进靶细胞的表达。一旦以期望的水平表达靶蛋白,则从宿主细胞移出所述蛋白并收获。通常通过过滤或离心从包含靶细胞的液流去除悬浮物质如细胞、细胞片段、脂质和其他不溶性物质,导致在溶液中包含靶蛋白与各种可溶性杂质的澄清液体。可溶性杂质的实例包括宿主细胞蛋白(一般称作HCP,其为期望的或靶蛋白以外的细胞蛋白)、核酸、内毒素、病毒、蛋白变体和蛋白聚集体。
第二步一般包括一般或多个纯化步骤,然后是一个或多个抛光步骤。纯化步骤一般旨在降低澄清溶液中各种可溶性杂质的水平并提供浓缩的靶蛋白。纯化步骤通常包括几个层析步骤,所述层析步骤可以包括一种或多种结合和洗脱层析技术,例如亲和层析、疏水相互作用层析(HIC)、疏水电荷诱导层析(HCIC)、阴离子交换和阳离子交换层析、混合模式层析,并且可以利用树脂如ProSep-vA Ultra、ProSep Ultra Plus、MabSelect Ultra、MabSelect SuRe、SP Sepharose、Q Sepharose、Eshmuno S、Eshmuno Q、CaptoAdhere、Capto MMC、HEA Hypercel、PPA Hypercel等。
使包含靶蛋白的液流进行一个或多个纯化步骤之后,通常使包含靶蛋白的级分(称作流出物)进行一个或多个抛光步骤。抛光步骤一般旨在进一步降低包含靶蛋白的流出物中各种可溶性杂质的水平。已报道各种层析介质结合可溶性杂质,并且通常用于抛光步骤。例如,已报道一种简单的阴离子交换层析介质(AEX)如包含季铵配体的阴离子交换层析介质结合带负电荷的HCP、DNA、内毒素和一些病毒(参见,例如,U.Gottschalk,ed.,ProcessScale Purification of Antibodies,John Wiley and Sons,2009,p.147)。层析树脂或膜可以用于这个步骤,包括Q Sepharose、Eshmuno Q、Fractogel TMAE、Pall Mustang Q、ChromaSorb、Sartobind Q等。此外,已开发某些“混合模式”层析介质,其包含阴离子交换以及阳离子交换基团并可以用于抛光步骤。参见,例如,F.Oehme,J.Peters,Mixed-Mode Chromatography inDownstream Process Development,BioPharm Int.Supplements,March2,2010。
磺化氟聚合物是一类独特的大分子,其设计用于需要极端的化学耐受性和高质子电导率的应用。参见,例如,美国专利第3,718,627号,其描述基于单体CF2=CFCF2CF2SO2F的磺化氟聚合物。磺化氟聚合物以前已用于高分子微孔膜的表面修饰以提高它们的水湿润性,增加对去湿的抗性以及使得它们能够用于强腐蚀性液体的过滤,例如美国专利第6,273,271号所教导的。
发明内容
本发明提供纯化生物分子的改进方法,其中所述方法采用具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物,所述带电的氟碳化合物组合物包括但不限于氟化且带电的聚合物,例如磺化氟聚合物(在本文中称作“SFP”)。
在本文所述的各种实施方案中,具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物用于结合所关注的生物分子。结合至用带电的氟碳化合物组合物修饰的固体支持物的所关注的生物分子可以是可溶性杂质,例如宿主细胞蛋白,意图将其从包含靶蛋白的液流中去除。或者,所关注的生物分子可以是意图回收的分子,例如可以用于疫苗制备的病毒或病毒颗粒,其中所述病毒或病毒颗粒结合具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物。
在各种实施方案中,本发明涉及一种从样品去除生物分子的方法;所述方法包括以下步骤:(i)提供包含所述生物分子的样品;(ii)使所述样品以流过模式(flow through)与包含用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物接触,其中所述固体支持物结合所述生物分子;以及(iii)回收流出物,从而导致去除所述生物分子。
在一些实施方案中,所述生物分子是不期望的实体,例如可溶性杂质。在其他实施方案中,所述生物分子是期望的实体,例如可用于疫苗制备的病毒或病毒颗粒。
在一些实施方案中,本发明涉及一种降低样品中一种或多种可溶性杂质的水平的方法,所述方法包括以下步骤:(i)提供包含靶蛋白以及一种或多种可溶性杂质的样品;(ii)使所述样品以流过方式与包含用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物接触,其中所述固体支持物结合所述一种或多种可溶性杂质;(iii)回收流出物,其中所述流出物包含相对于(i)中的水平,水平降低的杂质。
在一些实施方案中,和与具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物接触之前所述样品中存在的水平相比,一种或多种可溶性杂质的水平降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%或更多。
在其他实施方案中,本发明涉及一种从样品回收生物分子的方法;所述方法包括以下步骤:(i)提供包含所述生物分子的样品;(ii)使所述样品以流过模式与包含用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物接触,其中所述固体支持物结合所述生物分子;以及(iii)从所述固体支持物洗脱结合的分子,从而回收所述生物分子。
在一些实施方案,带电的氟碳化合物组合物为磺化氟聚合物。
在一些实施方案,所述带电的氟碳化合物组合物结合至固体支持物。
在一些实施方案中,所述固体支持物是多孔的。示例性多孔固体支持物形式包括但不限于膜、多孔整体柱(monolith)、纺织或无纺布、常见的层析树脂和材料。
在本发明的各种实施方案中,所述方法可以在高于约100mM的盐浓度下进行。
在一些实施方案中,利用具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物去除一种或多种可溶性杂质之后,使包含所述靶蛋白的流出物进一步进行一个或多个选自以下的层析或连续层析步骤:离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析和混合模式层析。
在一些实施方案中,本文所述的组合物用于从样品(例如细胞培养进料)纯化蛋白的连续方法。在某些实施方案中,本文所述的组合物用作流过纯化方法步骤的一部分。所述流过纯化方法步骤可以是较大的蛋白纯化方法的一部分,所述较大的蛋白纯化方法可以包括几个步骤,包括但不限于例如在生物反应器中培养表达蛋白的细胞;使所述细胞培养物澄清,这可以采用沉淀、离心和/或深层过滤中的一种或多种;将澄清的细胞培养物转移至结合和洗脱层析捕获步骤(例如,A蛋白亲和层析);使所述A蛋白洗脱液进行病毒灭活(例如,利用一个或多个静态混合物和/或缓冲罐);使来自病毒灭活的产物进行流过纯化方法,所述流过纯化方法采用选自活性炭、阴离子交换层析介质、阳离子交换层析介质和病毒过滤介质的两种或更多种基质;以及利用渗滤/浓缩和无菌过滤配制来自所述流过纯化步骤的流过液中的蛋白。这类方法的额外的细节可以例如在同时附上提交的参考号为P12/107的共同待决的申请中找到,并且其整体援引加入本文。在一些实施方案中,在流过纯化期间,于阳离子交换介质之前使用本文所述的CFC组合物。在另一实施方案中,在流过纯化步骤期间,于阳离子交换介质之后使用本文所述的CFC组合物。
在一些实施方案中,如上文所述,流体样品从一个步骤至下一个步骤连续流过整个过程。
示例性靶蛋白包括但不限于重组蛋白、单克隆抗体和功能片段、人源化抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、免疫粘附素分子以及包含CH2/CH3区的蛋白。所述靶蛋白可以在哺乳动物表达系统(例如,CHO细胞)或非哺乳动物表达系统(例如,细菌、酵母或昆虫细胞)中表达。本文所述的方法可以用于利用哺乳动物表达系统以及非哺乳动物表达系统表达的蛋白的上下文。
附图说明
图1为带电的氟碳化合物组合物中存在的基团的一般化学结构的示意图。这里,R1选自包含磺酸、硫酸、膦酸、磷酸和羧酸残基的基团;R2为任选存在的连接单元,其选自包含短的饱和及不饱和烃基的基团,例如其中x范围为1至约10且y范围为0至约20的CxHy、烷氧基、酯、酰胺等;并且R3为F、Cl或C1-C10全氟烷基基团。
图2示出可以聚合或共聚合以获得聚合的带电的氟碳化合物组合物的前体的示例性全氟单体的示意图。
图3示出示例性全氟有机酸。
图4A和4B示出基于示例性实验的结果的图,所述实验测量相对于未修饰的膜,CFC修饰的膜的静态溶菌酶容量(EW830、EW1000和EW1100),在pH5(4A)或pH8(4B)下进行测量。
图5A和5B示出基于示例性实验的结果的图,所述实验测量相对于未修饰的膜,CFC修饰的膜的静态BSA容量(EW830、EW1000和EW1100),在pH5(5A)或pH8(5B)下进行测量。
图6示出基于示例性实验的结果的图,所述实验测量CFC修饰的膜的静态IgG容量,在包含0.5M氯化钠的缓冲溶液中于pH5和8下进行测量。
图7示出基于示例性实验的结果的图,所述实验测量与未修饰的膜相比,CFC修饰的膜的静态宿主细胞蛋白容量。
图8A和8B示出基于示例性实验的结果的图,所述实验测量在低电导率(25mM,在8A中示出)下或在高电导率(25mM缓冲液+250mM NaCl,在8B中示出)下单克隆抗体收率以及宿主细胞蛋白减少的LRV。
具体实施方式
本发明至少部分基于在蛋白纯化的方法中使用具有用带电的氟碳化合物组合物(CFC)修饰的表面的固体支持物的发现,其中所述方法减少可能使用的抛光步骤的数目。此外,本文所述的方法中的抛光步骤可以在用设计用于抛光步骤的其他可商购的产品导致不期望的结果的条件(例如,高盐浓度)下进行。最后,本文所述的用于蛋白纯化方法的分子可以比目前可用的以相似方式使用的产品更廉价。
本领域已描述了掺入磺酸基团的层析树脂组合物以及物理上明显与全氟基团分离的磺酸基团(参见,例如,美国专利第8,092,683号)。但是,这类树脂看来并不表现出靶蛋白(即,胰岛素)的任何实质结合。
相比之下,如图1所示,本发明的组合物包括接近氟化基团(例如,氟碳化合物基团)的带电的基团(例如,磺酸基团)。换句话说,在本文所述的组合物的情况下,带电的基团和氟化基团不是像本领域所述的化合物的情况下的分开和不同的基团。
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。额外的定义在整个详细说明书中示出。
I.定义
如本文所用,术语“带电的氟碳化合物组合物”指包含碳和氟原子以及一个或多个带电的基团的化合物,所述带电的基团包括但不限于羧酸、磺酸、硫酸、膦酸、磷酸。具体地,这类氟碳化合物组合物包括饱和、不饱和和环化的全氟化碳化合物。
示例性带电的氟碳化合物组合物代表一类以磺酸基团终止的四氟乙烯和全氟乙烯基醚的共聚物。如下图所示,这些共聚物的化学结构包括全氟化聚合物骨架和强阳离子交换侧基。侧基和全氟化骨架之间的接头长度不同,并且取决于共聚物等级和制造商。例如,DuPont共聚单体具有化学结构:全氟-3.6-二氧杂-4-甲基-7-辛烯磺酰基氟化物(MW=446):CF2=CF-O-CF2-CF(CF3)OCF2CF2-SO2F,而Solvay Solexis单体具有化学结构:全氟-3-氧杂-4-戊烯磺酰基氟化物(MW=280):CF2=CF-O-CF2CF2-SO2F。
x、y和z定义当量(克/摩尔-SO3H)
y=1,x=5.5-6.5
z=1(),0(AquivionTM)
已报道这些共聚物用于氯和碱的氯-碱制备的电解膜。还已报道它们用于燃料电池膜、传感器(例如一氧化碳和甲醇)、驱动器(actuator)、Donnan透析、有机化学催化、以及气体&蒸汽扩散(气体的干燥/加湿)。此外,它们已用于高分子微孔膜的表面修饰以提高它们的水湿润性并增加对去湿的抗性。例如,如援引加入本文的美国专利第6,273,271号所述,它们可以用作PTFE膜表面上的包衣用于过滤强腐蚀性液体。
如本文所用,术语“固体支持物”一般指带电的氟碳化合物组合物可以粘附或共价结合的多孔或无孔材料。带电的氟碳化合物组合物结合或附着的固体支持物称作“修饰的固体支持物”。这类修饰的固体支持物可用于结合样品中的生物分子。可以修饰的示例性固体支持物包括但不限于常见的层析树脂材料,例如琼脂糖、多糖、葡聚糖、硅胶、合成聚合物(聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚砜、聚碳酸酯、聚乙烯醚和它们相应的共聚物)、无机和陶瓷材料以及玻璃珠。固体支持物可以为任何合适的形式,包括但不限于纯化柱、离散颗粒的不连续相、填充床柱和膨胀床柱。固体支持物还可以包括多孔膜如微孔和超滤膜。超滤和微孔膜可以是以下几种形式的任一种,包括片、管和中空纤维。此外,固体支持物可以包括纤维材料如纤维或织物,其可以是纺织或无纺的。
在本文中可交换使用的术语“修饰(modify)”、“修饰的”和“修饰(modification)”指改变固体支持物的原有表面特性的方法。例如,在一些实施方案中,可以通过使支持物进行涂底漆、包被或者处理如化学或辐射处理来修饰固体支持物。
如本文所用,术语“原位聚合”指包括聚合反应的过程,其在相同过程运行期间已官能化的材料上进行;即,在官能化和聚合反应之间不从反应器移除所述材料。
如本文所用,术语“单体”指可以与相同种类的其他分子连接以形成聚合物的分子。单体可以与相同种类的其他单体连接以形成“均聚物”。或者,单体可以与不是相同种类的单体连接以形成“共聚物”。如本文所用,术语“单体”还意图使用超过一个单体的起始材料(称作“低聚物”),其能够与其他单体或低聚物连接或聚合以形成聚合物。如本文所用,术语“二聚体”指连接在一起的两个单体。相似地,术语“三聚体”、“四聚体”和“五聚体”分别指三个、四个和五个单体的连接。
如本文所用,术语“接枝”指聚合反应,其中将一个或多个种类的新产生的聚合物嵌段连接至大分子的主链,作为具有与主链不同的构成或构型特征的侧链。
如本文所用,术语“交联”指包括现有大分子上的位点或基团的反应或现有大分子之间的相互作用,其导致在大分子中形成小区域,由其发出至少四条链。这类相互作用可以以许多不同方式发生,包括形成共价键,形成氢键、疏水性、亲水性、离子或静电相互作用。
如本文所用,术语“吸附”指其中分子通过物理相互作用附着指固体支持物的表面的过程。这类相互作用可以以许多不同方式发生,包括形成氢键、疏水性、亲水性、离子或静电相互作用。
在本文中可交换使用的术语“生物分子”或“所关注的生物分子”或“靶生物分子”指结合或能够由具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物结合的任何生物实体。在一些实施方案中,所述生物分子是期望从包含靶蛋白的样品去除的分子,例如宿主细胞蛋白。在其他实施方案中,所述生物分子是期望从样品回收的分子,例如可以用于疫苗制备的病毒或病毒颗粒。
在本文中可交换使用的术语“靶蛋白”、“期望产物”、“所关注的蛋白”或“所关注的产物”一般指所关注的多肽或产物,其期望从一种或多种不期望的实体如一种或多种可溶性杂质纯化或分离,所述一种或多种不期望的实体可以存在于包含所关注的多肽或产物的样品中。在本文中可交换使用的术语“靶蛋白”、“所关注的蛋白”、“期望产物”和“所关注的产物”一般指治疗性蛋白或多肽,包括但不限于利用本文所述的方法纯化的抗体。在一些实施方案中,靶蛋白不结合至具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物,因此,在利用具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物去除一种或多种可溶性杂质之后,其存在于回收的流出物中。
在本文中可交换使用的术语“多肽”或“蛋白”一般指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白。在一些实施方案中,如本文所述的小分子用来从与蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种不期望的实体分离蛋白或多肽。在一些实施方案中,所述一种或多种实体是可以与纯化的蛋白或多肽一起存在于样品中的一种或多种杂质。如上文所讨论的,在本文所述的方法的一些实施方案,附着至固体支持物的带电的氟碳化合物组合物用于结合包含靶蛋白的样品中的一种或多种杂质(例如,可溶性杂质)。
在一些实施方案中,利用本文所述的方法纯化的蛋白或多肽为哺乳动物蛋白,例如治疗性蛋白或可以用于治疗的蛋白。示例性蛋白包括但不限于例如肾素;生长激素,包括人生长激素和牛生长激素;生长激素释放因子;甲状旁腺激素;促甲状腺激素;脂蛋白;α-1-抗胰蛋白酶;胰岛素A-链;胰岛素B-链;胰岛素原;促卵泡激素;降钙素;黄体生成素;胰高血糖素;凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管性血友病因子;抗凝血因子如C蛋白;心钠素;肺表面活性剂;纤溶酶原激活物如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA);铃蟾肽;凝血酶;造血生长因子;肿瘤坏死因子-α和-β;脑啡肽酶;RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌因子);人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白如人血清白蛋白;苗勒氏抑制物质;松弛素A-链;松弛素B-链;松弛素原;小鼠促性腺激素相关肽;微生物蛋白,如β-内酰胺酶;Dnase;IgE;细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA),如CTLA-4;抑制素;激活蛋白;血管内皮生长因子(VEGF);激素或生长因子的受体;A蛋白或D蛋白;类风湿因子;神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF),神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6),或者神经生长因子如NGF-β.;血小板衍生生长因子(PDGF);成纤维细胞生长因子如α-FGF和β-FGF;表皮生长因子(EGF);转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β,包括TGF-.β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ4或TGF-β5;胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I),胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP);CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD40;促红细胞生成素;骨诱导因子;免疫毒素;骨形态发生蛋白(BMP);干扰素如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF),例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(Il),例如IL-1至IL-10;超氧化物歧化酶;T-细胞受体;表面膜蛋白;衰变加速因子;病毒抗原,例如部分AIDS包膜;转运蛋白;归巢受体;地址素;调节蛋白;整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM;肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体;以及任何上文所列的多肽的片段和/或变体。
此外,在一些实施方案中,利用本发明的方法纯化的蛋白或多肽为抗体、其功能片段或变体。在一些实施方案中,所关注的蛋白是包含免疫球蛋白的Fc区的重组蛋白。
术语“免疫球蛋白”、“Ig”或“IgG”或“抗体”(在本文中可交换使用)指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白,例如通过链间二硫键稳定所述链,其具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(在本文中可交换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2多肽链结构的蛋白,例如通过链间二硫键稳定所述链,其具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含例如通过β-折叠和/或链内二硫键稳定的肽环(例如,包含3-4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。基于在“恒定”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内相对缺少序列变化,或者在“可变”结构域的情况下在各种类别成员的结构域内的显著变化,结构域在本文中进一步称为“恒定”或“可变”的。抗体或多肽“结构域”在本领域中常可交换地称为抗体或多肽“区”。抗体轻链的“恒定”结构域可交换地称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可交换地称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“CH”区或“CH结构域”。抗体轻链的“可变”结构域可交换地称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变”结构域可交换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区或“VH结构域”。
免疫球蛋白或抗体可以是单克隆(称作“MAb”)或多克隆的,并且可以以单体或聚合物形式存在,例如以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。免疫球蛋白或抗体还可以包括多特异性抗体(例如,双特异性抗体),以及抗体片段,只要它们保留,或者修饰以包含配体特异性结合结构域。术语“片段”指包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基的部分(part)或部分(portion)抗体或抗体链。可以通过化学或酶促处理完整或完全抗体或抗体链来获得片段。还可以通过重组方式获得片段。当重组制备时,片段可以单独表达,或者作为称为融合蛋白的较大蛋白的部分来表达。示例性片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc和/或Fv片段。示例性融合蛋白包括Fc融合蛋白。
一般来说,免疫球蛋白或抗体针对所关注的“抗原”。优选地,抗原是生物学上重要的多肽,并且向患有疾病或病症的哺乳动物给药抗体可以在该哺乳动物中导致治疗益处。但是,还考虑针对非多肽抗原(例如肿瘤相关的糖脂抗原;参见U.S.Pat.No.5,091,178)的抗体。当抗原为多肽时,其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。
如本文所用,术语“单克隆抗体”或“MAb”指获得自一群基本上均质的抗体的抗体,即该群体包含的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单个抗原位点。此外,与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体,并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如,根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备,或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如,U.S.Pat.No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以分离自噬菌体抗体文库,使用例如Clackson et al.,Nature352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术。
单克隆抗体还可以包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中部分重链和/或轻链与来源于特定物种的抗体或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源,而链的剩余部分与来源于另一物种的抗体或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源;以及这类抗体的片段,只要它们表现出期望的生物学活性(U.S.Pat.No.4,816,567;和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。
当在本文中使用时,术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3);Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是那些除如本文所定义的高变区残基以外的可变结构域残基。
非人(例如,小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体,其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体),其中受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和性和能力(capacity)的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基代替。在某些情况下,人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基代替。此外,人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步精制抗体的性能。一般来说,人源化抗体包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环,并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常为人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones et al.,Nature321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
在一些实施方案中,利用本文所述的方法分离或纯化的抗体为治疗性抗体。示例性治疗性抗体包括例如曲妥珠单抗(HERCEPTINTM,Genentech,Inc.,Carter et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285-4289;U.S.Pat.No.5,725,856);抗CD20抗体如嵌合抗CD20“C2B8”U.S.Pat.No.5,736,137);利妥昔单抗(RITUXANTM),奥瑞珠单抗,2H7抗体的嵌合或人源化变体(U.S.Pat.No.5,721,108;WO 04/056312)或托西莫单抗(BEXXAR.TM);抗IL-8(StJohn et al(1993)Chest,103:932,和WO 95/23865);抗VEGF抗体,包括人源化和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体如人源化的抗VEGF抗体huA4.6.1贝伐珠单抗(AVASTINTM,Genentech,Inc.,Kim et al(1992)Growth Factors7:53-64,WO 96/30046,WO 98/45331);抗PSCA抗体(WO 01/40309);抗CD40抗体,包括S2C6及其人源化变体(WO 00/75348);抗CD11a(U.S.Pat.No.5,622,700;WO 98/23761;Steppe et al(1991)Transplant Intl.4:3-7;Hourmant et al(1994)Transplantation58:377-380);抗IgE(Presta et al(1993)J.Immunol.151:2623-2632;WO 95/19181);抗CD18(U.S.Pat.No.5,622,700;WO 97/26912);抗IgE,包括E25、E26和E27(U.S.Pat.No.5,714,338;U.S.Pat.No.5,091,313;WO 93/04173;U.S.Pat.No.5,714,338);抗Apo-2受体抗体(WO 98/51793);抗TNF-α抗体,包括cA2(REMICADETM)、CDP571和MAK-195(U.S.Pat.No.5,672,347;Lorenz et al(1996)J.Immunol.156(4):1646-1653;Dhainaut et al(1995)Crit.Care Med.23(9):1461-1469);抗组织因子(TF)(EP 0 420 937 B1);抗人α4β7整联蛋白(WO 98/06248);抗EGFR,嵌合或人源化225抗体(WO 96/40210);抗CD3抗体如OKT3(U.S.Pat.No.4,515,893);抗CD25或抗tac抗体如CHI-621SIMULECTTM和ZENAPAXTM(U.S.Pat.No.5,693,762);抗CD4抗体如cM-7412抗体(Choy etal(1996)Arthritis Rheum 39(1):52-56);抗CD52抗体如CAMPATH-1H(Riechmann et al(1988)Nature332:323-337);抗Fc受体抗体如Graziano et al(1995)J.Immunol.155(10):4996-5002中针对FcγRI的M22抗体;抗癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey et al(1995)Cancer Res.55(23Suppl):5935s-5945s;针对乳腺上皮细胞的抗体,包括huBrE-3、hu-Mc3和CHL6(Ceriani et al(1995)Cancer Res.55(23):5852s-5856s;和Richman et al(1995)Cancer Res.55(23Supp):5916s-5920s);结合指结肠癌细胞的抗体如C242(Litton et al(1996)Eur J.Immunol.26(1):1-9);抗CD38抗体,例如,AT13/5(Ellis et al(1995)J.Immunol.155(2):925-937);抗CD33抗体如Hu M195(Jurcic et al(1995)Cancer Res55(23Suppl):5908s-5910s以及CMA-676或CDP771;抗CD22抗体如LL2或LymphoCide(Juweid et al(1995)Cancer Res55(23Suppl):5899s-5907s);抗EpCAM抗体如17-1A(PANOREXTM);抗GpIIb/IIIa抗体如阿昔单抗或c7E3Fab(REOPROTM);抗RSV抗体如MEDI-493(SYNAGISTM);抗CMV抗体如PROTOVIRTM);抗HIV抗体如PRO542;抗肝炎抗体如抗Hep B抗体OSTAVIRTM);抗CA125抗体OvaRex;抗独特型GD3表位抗体BEC2;抗αvβ3抗体VITAXINTM;抗人肾细胞癌抗体ch-G250;ING-1;抗人17-1A抗体(3622W94);抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33);针对GD3神经节苷脂的抗人黑素瘤抗体R24;抗人鳞状细胞癌(SF-25);以及抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
在本文中可交换使用的术语“污染物”、“杂质”和“碎片”一般指任何外源或不利物质,包括生物大分子如DNA、RNA,一种或多种宿主蛋白(HCP或CHOP),全细胞,细胞碎片和细胞片段,内毒素,病毒,脂质以及一种或多种添加剂,其可以存在于包含所关注的蛋白或多肽(例如,抗体)的样品中,利用如本文所述的具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物从一种或多种外源或不利分子分离所关注的蛋白或多肽。
如本文所用,术语“不溶性杂质”指包含靶生物分子的样品中存在的任何不期望的或不利的实体,其中所述实体为悬浮颗粒或固体。示例性不溶性杂质包括全细胞、细胞片段和细胞碎片。
如本文所用,术语“可溶性杂质”指包含靶生物分子(例如,靶蛋白)的样品中存在的任何不期望的或不利的实体,其中所述实体不是不溶性杂质。示例性可溶性杂质包括宿主细胞蛋白、DNA、RNA、病毒、内毒素、细胞培养基组分、脂质等。在一些实施方案中,可溶性杂质为宿主细胞蛋白(HCP)。
在本文所述的各种实施方案中,具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物用于结合可溶性杂质。
不希望受到理论的束缚,在某些情况下考虑结合至具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物的生物分子是期望回收的生物分子(例如,在用于疫苗制备的病毒或病毒颗粒的情况下)。
如本文所用,术语“组合物”、“溶液”或“样品”一般指待纯化的靶蛋白或所关注的产物与一种或多种不期望的实体或杂质(例如,可溶性蛋白)的混合物。在一些实施方案中,样品包含生物物质,其包含液流,例如原料或细胞培养基,靶蛋白或期望的产物分泌至其中。在一些实施方案中,样品包含靶生物分子(例如,治疗性蛋白或抗体)与一种或多种可溶性杂质(例如,宿主细胞蛋白)。在一些实施方案中,样品包含分泌至细胞培养基中的靶生物分子。在其他实施方案中,样品包含为病毒或病毒颗粒的靶生物分子。在一些实施方案中,与本文所述的组合物接触或流过本文所述的组合物的样品是来自纯化过程中上一步骤的产物。例如,在一具体实施方案中,样品构成来自阳离子交换流过层析步骤的产物或来自阴离子交换流过层析步骤的产物。
在本文中可交换使用的术语“加工步骤”或“单元操作”指在纯化过程中使用一种或多种方法或装置以实现某种结果。可以用于纯化过程的加工步骤或单元操作的实例包括但不限于澄清、结合和洗脱层析、病毒灭活、流过纯化以及配制。应当理解每个加工步骤或单元操作可以采用一个以上的步骤或方法或装置以实现该加工步骤或单元操作的预期结果。在一些实施方案中,用来进行加工步骤或单元操作的一种或多种装置是一次性使用的装置,并且可以去除和/或置换而不必置换方法中的任何其他装置或甚至不必终止方法运行。
如本文所用,术语“缓冲罐”指在加工步骤之间或加工步骤内(例如,当单一加工步骤包括一个以上的步骤时)使用的任何容器或器皿或袋;其中来自一个步骤的产物流过缓冲罐至下一步。因此,缓冲罐不同于混合(pool)罐,其并不意图盛放或收集来自步骤的整个体积的产物;而是取而代之使得来自一个步骤的产物能够连续流至下一步。在一些实施方案中,在本文所述的方法或系统的两个加工步骤之间或加工步骤内使用的缓冲罐的体积不超过来自加工步骤的产物的整个体积的25%。在另一实施方案中,缓冲罐的体积不超过来自加工步骤的产物的整个体积的10%。在一些其他实施方案中,缓冲罐的体积少于生物反应器中细胞培养物的整个体积的35%、或者少于30%、或者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%,所述生物反应器中的细胞培养物构成纯化靶分子的起始原料。
如本文所用,术语“连续方法”指纯化靶分子的方法,其包括两个或更多个加工步骤(或单元操作),从而来自一个加工步骤的产物直接流入方法中的下一加工步骤,没有中断,并且其中两个或更多个加工步骤可以在它们的持续时间的至少一部分同时进行。换句话说,在连续方法的情况下,如本文所述,无需在下一加工步骤开始之前完成加工步骤,但是一部分样品通常移动通过加工步骤。术语“连续方法”还用于加工步骤内的步骤,在这种情况下,在包括多个步骤的加工步骤进行期间,样品连续流过进行加工步骤所需的多个步骤。本文所述的这样的加工步骤的一个实例是流过纯化步骤,其包括以连续方式进行的多个步骤,例如流过活性炭,然后流过AEX介质、然后流过CEX介质,然后流过病毒过滤。本文所述的组合物可以用于这样的流过纯化步骤。
术语“静态混合器”指用于混合两种流体物质,通常为液体的装置。该装置一般由圆柱形(管)外壳中所含的混合器元件组成。总系统设计并入将两个液流递送入静态混合器的方法。当流通过混合器时,非移动元件连续混合物质。完全混合取决于许多变量,包括流体的特性、管的内径、混合器元件的数量和它们的设计等。在一些实施方案中,在整个纯化过程中使用一个或多个静态混合器。
在本文中可交换使用的术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”指来源于中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP一般作为可溶性杂质存在于细胞培养基或裂解物中(例如,收获的包含所关注的蛋白或多肽(例如,在CHO细胞中表达的抗体或免疫粘附素)的细胞培养液)。一般来说,包含所关注的蛋白的混合物中存在的CHOP的量提供所关注的蛋白的纯度的量度。通常,蛋白混合物中CHOP的量以相对于混合物中所关注的蛋白的量的百万分比表示。
应当理解当宿主细胞为另一哺乳动物细胞类型、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞时,HCP指在宿主细胞的裂解物中发现的除靶蛋白之外的蛋白。一般来说,本文所述的带电的氟碳化合物组合物可以用于结合具有与所述组合物相反的电荷的任何分子。
在本文中可交换使用的术语“百万分数”或“ppm”指利用本文所述的方法纯化的期望的靶分子(例如,靶蛋白或抗体)的纯度的量度。因此,这个量度可以用来衡量纯化过程后存在的靶分子的量,或者衡量不期望的实体的量。
在本文中可交换使用的术语“对数减少值”或“LRV”指在某个过程中杂质浓度减少的量度。杂质浓度可以表示为重量/体积单位,例如mg/ml、ng/ml、g/L等,以及颗粒数量/体积单位,例如CFU/ml和PFU/ml(分别为“集落形成单位”和“空斑形成单位”)。一般来说,LRV可以定义如下:LRV=Log[(进料中的杂质浓度)/(流出物中的杂质浓度)]。
在利用具有用磺化和带电的分子修饰的表面的多孔固体支持物从包含靶生物分子以及一种或多种杂质(例如,宿主细胞蛋白)的组合物或样品纯化靶生物分子(例如,所关注的蛋白)的上下文中,术语“分离(isolating)”、“纯化”和“分离(separating)”在本文中可交换使用。在一些实施方案中,通过利用如本文所述的具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物从样品去除(完全或部分)一种或多种可溶性杂质(例如,宿主细胞蛋白)来增加样品中靶生物分子的纯度。在另一实施方案中,通过利用如本文所述的具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物结合靶生物分子离开样品中的一种或多种可溶性杂质来增加样品中靶生物分子(例如,可用于疫苗制备的病毒)的纯度。随后可以通过利用本领域已知的合适的条件将其从固体支持物洗脱来回收结合的靶生物分子。
在一些实施方案中,纯化方法额外地采用一个或多个“层析步骤”。通常,如果需要,这些步骤可以在利用如本文所述的具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物从一种或多种不期望的实体分离靶生物分子之后进行。
在一些实施方案中,利用如本文所述的具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物分离(isolate)、分离(separate)或纯化所关注的多肽或蛋白的“纯化步骤”可以是导致“均质”或“纯”组合物或样品的总纯化方法的部分,该术语在本文中用来指在包含所关注的蛋白的组合物中包含少于100ppm HCP的组合物或样品,或者少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于10ppm、少于5ppm或少于3ppm的HCP。
如本文所用,术语“澄清”或“澄清步骤”一般指生物分子的纯化中的一个或多个最初步骤。澄清步骤一般包括利用一个或多个步骤去除全细胞和/或细胞碎片,所述一个或多个步骤包括任何以下单独步骤或它们的各种组合,例如离心和深层过滤、沉淀、絮凝和沉降。澄清步骤一般包括去除一种或多种不期望的实体,并且通常是纯化过程期间进行的一个步骤或第一步骤。澄清的另一关键方面是去除样品中的不溶性组分,所述组分后来可能导致纯化过程中无菌滤器的污染,从而使得总纯化过程更经济。在一些实施方案中,本发明的方法在采用带电的氟碳化合物组合物修饰的固体支持物从样品去除一种或多种生物分子之前采用常用的一种或多种常规澄清步骤,例如深层过滤和离心。
如本文所用,术语“层析”指任何种类的技术,其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如,靶生物分子)。通常,作为在移动相的影响下,或者在结合和洗脱过程中,混合物中不同分子迁移通过静止介质的速率的差异的结果,所关注的分析物从其他分子分离。
术语“层析树脂”或“层析介质”在本文中可交换使用,并且指任何种类的相或材料,其从混合物中存在的其他分子分离所关注的分析物(例如,靶生物分子)。通常,作为在移动相的影响下,或者在结合和洗脱过程中,混合物中不同分子迁移通过静止相(其一般为固体状态)的速率差异的结果,所关注的分析物从其他分子分离。各种类型的层析介质的实例包括例如阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整体柱。
如本文所用,术语“捕获步骤”或“捕获”一般指用于结合靶生物分子的方法。在一些实施方案中,捕获步骤包括采用具有用带电的氟碳化合物组合物分子修饰的表面的固体支持物以结合靶生物分子,其中所述靶生物分子是待回收的期望分子。在一些实施方案中,捕获步骤在利用具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物去除一种或多种杂质之后进行,其中在去除杂质之后从流出物捕获靶分子。在其他实施方案中,捕获步骤在利用具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物去除一种或多种杂质之前进行,其中在捕获步骤之后进一步纯化靶分子。
II.示例性带电的氟碳化合物组合物
本发明的方法在蛋白纯化过程中采用带电的氟碳化合物组合物。
在一些实施方案中,本发明涉及一种从样品中的一种或多种可溶性杂质分离靶生物分子的方法,并且采用带电的氟碳化合物组合物修饰的固体支持物。因此,使包含靶生物分子(例如,靶蛋白或抗体)以及一种或多种可溶性杂质的样品与具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物接触,其中所述可溶性杂质结合至所述固体支持物,而在流出物中回收所述靶分子。
在一些其他实施方案中,本发明涉及一种从一种多种不期望的实体分离靶生物分子的方法,其中所述靶生物分子本身结合至在其表面具有带电的氟碳化合物组合物的多孔固体支持物。
带电的氟碳化合物组合物的非限制性实例包括但不限于聚合物组合物如均聚物或共聚物,如由E.I.Dupont de Nemours and Company,Inc.销售的名为的、由Solvay Solexis市场化的名为AquivionTMPFSA的或由Asahi Glass Company,Limited市场化的名为FLEMIONTM的那些,氟碳化合物共聚物,如包含至少两个单体的那些,其中一个单体选自包含氟的单体如乙烯基氟、六氟丙烯、二氟乙烯、三氟乙烯、氯三氟乙烯、全氟(烷基乙烯基醚)、四氟乙烯和它们的混合物,以及第二单体,其可以选自包含氟的单体,所述单体包含官能团,所述官能团为或可以转化为(SO3M),其中M为H、碱金属或碱土金属。这类第二单体的实例一般可以通过式CF2=CFRf-X来表示。通式中的Rf为线性或支化的双官能全氟化基团,其包含任何合适或常规构型的1-8个碳原子,包括包含醚键的那些,并且其通过碳-碳键或优选通过醚键直接连接至乙烯基基团CF2=CF基团。X为官能团,所述官能团为或可以转化为(SO3M),其中M为H、碱金属或碱土金属。所述通式的一个限制是要求在X基团相邻的碳原子上存在至少一个氟原子。
通常第二单体包含磺酰基氟化物基团,其可以转化为基于磺酰基的离子交换基团,其实例可以在援引加入本文的美国专利号3,282,875;3,041,317;3,560,568;和3,718,627中找到。制备全氟化碳聚合物的方法在援引加入本文的美国专利号3,041,317;2,393,967;2,559,752和2,593,583中示出。这些全氟化碳共聚物一般具有基于垂饰SO2F的官能团,其可以转化为(SO3M)基团。在一些实施方案中,本发明的组合物包括基于垂饰羰基的官能团,其可以转化为基于羰基的离子交换基团。
具有基于垂饰羰基的离子交换官能团的氟碳化合物共聚物可以以任何合适的常规方式制备,例如按照援引加入本文的美国专利号4,465,533和4,349,422制备。包含羰基氟化物的单体的代表性实例包括以下单体式。
在一些实施方案中,本文所述的氟碳化合物共聚物包括式--OCF2CF2X'和/或--OCF2CF2C--F2Y--B--YCF2CF2O--所示的基于羰基和/或磺酰基的官能团,其中X'为磺酰基氟化物(SO2F)、羰基氟化物(COF)、磺酸甲酯(SO3CH3)、羧酸甲酯(COOCH3)、离子羧酸盐(COO--Z+)或离子磺酸盐(SO3—Z+),Y为磺酰基(SO2)或羰基(CO),B为键如--O--、--O--O--、--S--S--,并且Z为氢,碱金属如锂、铯、铷、钾和钠或者碱土金属如钡、铍、镁、钙、锶和镭或者季铵离子。
氟碳化合物共聚物的磺酰基形式通常是具有氟化烃主链的聚合物,所述氟化烃主链连接官能团或垂饰侧链,所述垂饰侧链转而携带官能团。垂饰侧链可以包括以下结构:
其中R'f为F、Cl或C1-C10全氟烷基基团,并且W为F或Cl,优选F。通常,聚合物侧链中的官能团存在于可以通过醚键连接至侧链的基团中。这种全氟化碳聚合物的实例在援引加入本文的美国专利号3,282,875;3,560,568和3,718,627中公开。
聚合物的额外实例可以由通式CF2=CF--Tk--CF2SO2F表示,其中T为包含1-8个碳原子的双官能氟化基团,并且k为0或1。T中的取代基原子包括氟、氯或氢。在一些实施方案中,全氟化碳共聚物不含连接至碳的氢和氯,即它们是全氟化的,这使得能够在恶劣环境中具有最大稳定性。上式的T基团可以是支化或未支化的,即直链,并且具有一个或多个醚键。在一些实施方案中,包含共聚单体的磺酰基氟化物的这个基团中的乙烯基基团通过醚键连接至T基团,即所述共聚单体包含式:CF2=CF--O--T--CF2--SO2F。包含共聚单体的示例性磺酰基氟化物可以由以下结构表示。
CF2=CFOCF2CF2SO2F
CF2=CFCF2CF2SO2F,和
在一些实施方案中,包含共聚单体的磺酰基氟化物为具有以下结构的全氟(3,6-二氧杂-4-甲基-7-辛烯磺酰基氟化物)。
包含磺酰基的单体在这类参考中公开,如美国专利号3,282,875、3,041,317和美国专利号3,560,568,这些参考援引加入本文。
在一些实施方案中,本发明中利用的一类全氟化碳共聚物由具有如下所示的重复单元的聚合物表示,
其中,h为3-15,j为1-10,p为0、1或2,X”代表4个氟或者3个氟和1个氯,Y为F或CF3,并且R'f为F、Cl或C1-C10全氟烷基基团。
包含基于磺酰基或羰基的官能团的任何氟碳化合物聚合物和共聚物均可以用于本文所述的方法,包括包含两种类型的官能团的共聚物以及具有不同官能团的共聚物的混合物。一个这样的实例是四氟乙烯和全氟(3,6-二氧杂-4-甲基-7-辛烯磺酰基氟化物)的共聚物,由其可以获得磺酸形式或盐形式。另一实例是四氟乙烯和甲基全氟(4,7-二氧杂-5-甲基-8-壬烯酸酯)的共聚物,由其可以获得羧酸形式或盐形式。
一般来说,全氟化碳共聚物的磺酰基、羰基、磺酸酯和羧酸酯;以及基于磺酰基和羰基的酰胺形式通过水解反应容易地转化为离子交换形式。例如,盐形式可以通过用强碱如NaOH处理来获得,而酸形式则可以通过用酸如HCl处理来产生。这个转化步骤可以在用全氟化碳共聚物的磺酰基、羰基、磺酸酯和羧酸酯以及基于磺酰基和羰基的酰胺形式修饰固体支持物之前或之后进行。
在另一实施方案中,氟碳化合物组合物包含上述氟碳化合物单体,其原位聚合或共聚合以包被固体支持物表面。
用来形成反应物氟碳化合物溶液的溶剂包括援引加入本文的美国专利第4,386,987号中公开的溶剂,多孔固体支持物表面修饰源自所述反应物氟碳化合物溶液。这些溶剂包括卤碳油、全氟辛酸油、N-烷基乙酰胺和十氟联苯。或者,可以利用援引加入本文的美国专利第4,348,310号中公开的卤化饱和烃。在一些实施方案中,溶剂为援引加入本文的美国专利第4,433,082号和第4,453,991号中公开的醇溶剂。醇溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙基醚、二乙二醇二乙基醚、二乙二醇二乙基醚、二噁烷和乙腈以及它们的含水或无水的混合物。在一具体实施方案中,溶剂为水和低级醇如异丙醇的混合物。全氟化碳共聚物的溶液在升高的温度下,通常为180°C.-300℃.,低于溶剂的临界温度,并且在升高的压力下与密闭容器中形成。这些溶液与全氟化碳共聚物的溶剂或稀释剂混溶,如异丙醇、乙醇、水等,不会沉淀全氟化碳共聚物。一般要求溶液完全进入基底孔。
III.示例性固体支持物
合适的介质材料包括通常用于层析珠的那些介质材料,包括玻璃,例如硼硅酸盐玻璃、耐碱玻璃和可控多孔玻璃,天然和合成聚合物如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯和聚丙烯的混合物、多层聚乙烯/聚丙烯珠、丙烯酸、聚砜、聚醚砜、PVDF或PTFE、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、琼脂糖、琼脂糖衍生物、琼脂、藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、葡聚糖、淀粉、角叉菜聚糖、瓜尔胶、阿拉伯树胶、印度胶、黄蓍树胶、刺梧桐树胶、刺槐豆胶、黄原胶、果胶、粘蛋白、肝素和明胶,金属如不锈钢、镍、钛、钯和钴或者各种铁、包含铁或其他磁化金属的合金和混合物;以及陶瓷,如硅酸盐材料、氧化锆和各种陶瓷混合物。在固体支持物为珠的形式的情况下,所述珠可以整个由相同材料形成,或者可以为两种或更多种材料的复合材料,优选多孔材料。例如,珠可以在内部包含玻璃或合成聚合物核心,并且在外部包含天然或合成聚合物层。
在一具体实施方案中,本发明的组合物和方法中采用的固体支持物为多孔膜。一般来说,所述多孔膜可以包含任何合适的材料,包括一种或多种聚合物。用于形成多孔膜的代表性合适的聚合物包括聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯等;聚苯乙烯或取代的聚苯乙烯;氟化聚合物,包括聚(四氟乙烯)、聚偏二氟乙烯等;聚砜类如聚砜、聚醚砜等;聚酯,包括聚对苯二甲酸乙二酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等;聚丙烯酸酯和聚碳酸酯;乙烯基聚合物如聚氯乙烯和聚丙烯腈;纤维素类如纤维素、硝化纤维素和醋酸纤维素;聚酰胺。共聚物还可以用来形成多孔材料的块状基质,包括丁二烯和苯乙烯的共聚物、氟化乙烯-丙烯共聚物、乙烯-氯三氟乙烯共聚物等。
一般来说,本文所述的方法和组合物中采用的多孔膜具有0.001-50微米、0.1-5微米或0.01-1微米的平均孔径大小。在一些实施方案中,平均孔径大小为0.2微米。在一具体实施方案中,膜的平均孔径大小为0.45微米。在其他实施方案中,平均孔径大小为0.65微米。膜深度,即两个外表面或者膜的上和下表面之间的距离可以为1-1000微米、50-500微米、75-200微米或90-150微米。
IV.用带电的氟碳化合物组合物修饰固体支持物的示例性方法
在各种实施方案中,用带电的氟碳化合物组合物修饰固体支持物。可以利用本领域技术人员已知的各种表面修饰技术修饰固体支持物。
在一些实施方案中,采用常用的表面修饰方法吸附。使如本文所述的氟碳化合物聚合物组合物的溶液与多孔固体支持物接触,例如通过将固体支持物浸入所述溶液或者使所述溶液通过固体支持物或在压力下侵入固体支持物的孔。在本文中,溶液表示液体组合物,其包含完全溶解和/或部分溶解于溶剂、稀释剂或分散介质的氟碳化合物组合物。这些溶液包括未溶解的氟碳化合物聚合物组合物在分散介质中的悬浮液。溶液包括液体组合物,其为氟碳化合物聚合物组合物的溶剂、稀释剂或分散介质,其完全湿润固体支持物,或者当其不湿润固体支持物时,将膜预湿润,从而溶液可以进入孔或者使溶液侵入孔。一般要求溶液完全进入固体支持物的孔。使固体支持物与溶液接触要求的时间,其可以为1秒-24小时,或者1分钟-60分钟。在各种实施方案中,固体支持物与溶液接触的时间为1秒或5秒或10秒或20秒或30秒或40秒或50秒或1分钟或5分钟或10分钟或15分钟或20分钟或25分钟或30分钟或35分钟或40分钟或45分钟或50分钟或55分钟或1小时或5小时或10小时或15小时或20小时或24小时或更长。随后通过机械方式如夹、刮刀或开槽模具来去除溶液。
在一可选实施方案中,不通过机械方式去除过量的溶液,取而代之将其留在孔中干燥,随后进行萃取。一般使用稀释剂或分散剂,其例如通过溶解或稀释选择性地去除未结合的氟碳化合物聚合物,同时避免去除结合至固体支持物的氟碳化合物。
随后将所得的表面修饰的固体支持物干燥并加热处理以提高膜基底与结合的带电的氟碳化合物组合物之间的结合强度。
如果所用的氟碳化合物聚合物为磺酰基或羰基氟化物类型,则可能需要额外的水解步骤以将表面转化为离子交换形式。
加热处理的表面修饰的固体支持物具有用包含吸附的氟碳化合物聚合物组合物的组合物修饰的表面,令人惊讶地发现其基本上不溶于溶解和/或稀释未结合的溶解的带电的全氟化碳聚合物组合物的那些溶剂或稀释剂。
此外,表面修饰组合物以固体支持物基本上不被阻断或堵塞的量和浓度使用。当固体支持物为膜时,可以通过净化水过滤期间跨膜压增加来测量阻断。
以下方法描述用氟碳化合物组合物包被固体支持物的一般方法。
将合适的固体支持物基底用甲醇预湿润,在水中漂洗,并且在包含氟碳化合物组合物的反应物溶液中浸泡几分钟以确保完全交换。如果反应物溶液能够直接湿润基底,则无需预湿润交换步骤。然后将表面修饰的固体支持物去除过量的任何未结合的氟碳化合物组合物,例如通过机械压缩、气刀或本领域已知的任何其他合适的方式。
在一些实施方案中,通过利用机械力和/或用溶剂、稀释剂或分散剂处理中的一种或这两者去除过量的未结合的氟碳化合物组合物,所述溶剂、稀释剂或分散剂例如通过溶解或稀释选择性地去除未结合的氟碳化合物组合物,同时避免去除结合至多孔支持物的氟碳化合物组合物。随后将所得的表面修饰的多孔支持物干燥并加热处理以提高基底与结合的氟碳化合物组合物之间的结合强度。
如果所用的氟碳化合物组合物本身不带电,例如包含磺酰基卤化物基团,则需要额外的水解步骤以将表面转化为离子交换形式。
利用亲氟(fluorophilic)相互作用是产生用带电的氟碳化合物组合物修饰的固体支持物的另一吸附技术。例如,已报道固定相上全氟(PF)化合物的特异性相互作用。参见,例如,De Miguel et al.,Chromatographia,Vol24,849-853,1987。用支化的含氟化合物观察到强协同效应。当氟碳化合物组合物是缺少可聚合官能度的配体时,这特别有用。合适的支持物材料包括各种氟碳化合物聚合物如聚四氟乙烯(PTFE)(例如,E.I.du Pont deNemours and Company的注册商标)、聚氟乙烯和聚偏二氟乙烯和全氟萘烷。合适的配体氟碳化合物组合物包括但不限于图3所示的化合物,其由WeissJ.M.et al.TOXICOLOGICAL SCIENCES109(2),206-216,2009)公开,该文献援引加入本文。
以下方法描述利用亲氟相互作用用带电的氟碳化合物组合物包被固体支持物的一般方法。
将固体支持物基底在甲醇中湿润,在水中漂洗,并且在包含配体氟碳化合物组合物的反应物溶液中浸泡几分钟以确保完全交换。如果反应物溶液能够直接湿润基底,则无需预湿润交换步骤。然后将表面修饰的固体支持物机械去除过量的未结合的氟碳化合物组合物。
在一些实施方案中,通过利用机械力和/或用溶剂、稀释剂或分散剂处理中的一种或这两者去除过量的未结合的氟碳化合物组合物,所述溶剂、稀释剂或分散剂例如通过溶解或稀释选择性地去除未结合的氟碳化合物组合物,同时避免去除结合至多孔支持物的氟碳化合物组合物。随后将所得的表面修饰的多孔支持物干燥并加热处理以提高基底与结合的氟碳化合物组合物之间的结合强度。
如果所用的小分子氟碳化合物聚合物为磺酰基或羰基氟化物类型,则需要额外的水解步骤以将表面转化为离子交换形式。
在另一实施方案中,通过在内孔表面以及外部几何表面上交联氟碳化合物组合物来进行多孔固体支持物的表面修饰。
可以用反应物溶液修饰多孔固体支持物,所述反应物溶液优选包含可聚合的氟碳化合物和合适的交联剂,例如N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAm)。一般来说,带电的氟碳化合物组合物以约1wt%-约20wt%或者约3wt%-约6wt%的浓度(基于反应物溶液的重量)存在于反应物溶液中。交联剂优选以约5wt%-约100wt%的浓度(基于氟碳化合物组合物的重量)存在于反应物溶液中。
当暴露于电子束辐射时,在任何化学聚合自由基引发剂均不存在的情况下,在多孔基底的表面以及内孔壁上将反应物溶液原位聚合。优选地,聚合的交联氟碳化合物组合物覆盖多孔基底的整个外表面和内表面。聚合依赖于将饱和基底的内表面和外表面的反应物溶液暴露于剂量为至少约0.1M拉德-约6M拉德的电子束辐射,以便进行氟碳化合物组合物的聚合。
以下方法描述利用电子束辐射用氟碳化合物组合物包被多孔基底的一般方法。将基底在甲醇中湿润,在水中漂洗,并且在包含可聚合的氟碳化合物组合物和MBAm交联剂的反应物溶液中浸泡几分钟以确保完全交换。如果反应物溶液能够直接湿润基底,则无需预湿润交换步骤。
用于引发基底表面上反应物溶液的聚合的电子束技术包括例如Steuck的美国专利第4,944,879号中描述的方法,其公开援引加入本文。前述专利讨论例如膜的连续卷(称作网络)或单独样品通过电子束加工机产生的电子帘。加工机递送约100kV-约200kV的期望剂量。以适合给出期望的在帘下暴露的时间的速度转运移动网络或样品。暴露时间与剂量组合确定剂量率。典型的暴露时间为约0.5秒-约10秒。剂量率一般为0.01kGy(千戈瑞)-约6kGy(即,0.1-约6M拉德)。通过电子束递送期望剂量的辐射之后,将处理的多孔基底在水和/或甲醇中漂洗以去除未反应和低聚物质。然后将基底干燥并测试再湿润、流动和其他特征。
在另一可选实施方案中,可以通过采用自由基化学引发剂代替电离辐射引发聚合。当使用自由基引发剂时,可以在湿润多孔基底之前将其添加至反应物溶液中,通常量为0.01-1%。根据自由基引发剂的化学性质,可以通过加热或通过UV照射来引发聚合反应。UV激活的引发剂(即光引发剂)的实例为1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮(可获得自Ciba Specialty Chemicals,Basel,Switzerland,商品名Irgacure(R)2959)。
或者,可以进行热引发聚合。可以使用合适的热引发剂,即在加热时产生自由基的化合物。示例性热引发剂为过硫酸盐、偶氮引发剂如偶氮二异丁腈(AIBN)、过氧化物如过氧化苯甲酰等。
以下方法描述利用光引发剂用氟碳化合物组合物包被多孔固体支持物的一般方法。将基底在甲醇中湿润,在水中漂洗,并且在包含可聚合的氟碳化合物组合物、MBAm交联剂和自由基光引发剂的反应物溶液中浸泡几分钟以确保完全交换。如果反应物溶液能够直接湿润基底,则无需预湿润-交换步骤。用来引发基底表面上反应物溶液的聚合的光引发剂包括例如J.-P.Fouassier,Photoinitiation,Photopolymerization,and Photocuring:CarlHanser Verlag,Munich,Germany,1995,pp.20-93和Table3-1,p.21所述的那些光引发剂。
通过将用可聚合的氟碳化合物组合物/交联剂/光引发剂溶液饱和的多孔基底暴露于紫外线、可见或红外辐射至足以引起光引发剂的分解并产生自由基的剂量来进行反应物溶液的聚合。合适的紫外线辐射的来源可以包括具有两个UV光源(一个在顶部,一个在底部)的UV传送带,由Fusion UVSystems,Inc.(Gaithersburg,MD)制造。通过光源递送期望剂量的辐射之后,将处理的微孔基底在水和/或甲醇中漂洗以去除未反应和低聚物质。然后将基底干燥并测试再湿润、流动和其他特征。
如果所用的氟碳化合物聚合物为磺酰基或羰基氟化物类型,则需要额外的水解步骤以将表面转化为离子交换形式。
在另一实施方案中,通过在内孔表面以及外部几何表面上接枝氟碳化合物组合物来进行多孔固体支持物的表面修饰。
在一实例中,反应物溶液优选包含可聚合的氟碳化合物组合物,没有交联剂。在这种情况下,电离辐射源如电子束辐射源用来递送适当剂量,导致在基底表面上产生自由基,在所述基底表面上可以接枝氟碳化合物单体。本领域技术人员能够选择合适的辐射剂量,其中利用本领域的知识与常规实验,在多孔基底上产生自由基,并且氟碳化合物单体聚合并接枝至表面上而不分解。
在另一实例中,可以通过将带电的分子直接偶联至引入化学惰性氟碳化合物固体支持物上的反应基团来获得带电的氟碳化合物组合物。参见,例如,美国专利第4,642,285号,其公开了一种将蛋白如抗体共价连接至不溶性材料的方法。上述专利中公开的不溶性材料是来自Imperial ChemicalIndustries of Australia and New Zealand(ICIANZ)的已知为PROTAPOL DI/1的可商购的材料。该材料可以圆片形式获得,并且包含聚四氟乙烯(PTFE)骨架,具有均匀接枝在其表面上的异硫氰基聚苯乙烯基团。亲核终止的带电的分子(如胺、硫醇等)与异硫氰基反应,导致共价缀合。参见,例如,Hermanson,Mallia and Smith,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press,1992。
在一可选实施方案中,通过利用逐层方法进行使用氟碳化合物组合物的多孔固体支持物的表面修饰。最近,已描述利用可选地沉积在基底上的聚电解质制备聚电解质复合物的薄膜。参见Decher and Schlenoff,Eds.,Multilayer Thin Films--Sequential Assembly of Nanocomposite Materials,Wiley-VCH,Weinheim(2003);Decher,Science,277,1232(1997)。此外,美国专利第5,208,111号描述了一种通过交替浸泡建立多层的方法,即在包含相反电荷的聚电解质水溶液的两个储液器之间循环基底,每次浸没之后有任选存在的在不含聚合物的溶液中的漂洗步骤。每个循环通过离子配对力将一层聚合物添加至带相反电荷的表面并逆转表面电荷,从而使膜准备好添加下一层。以这种方式制备的膜趋于一致,并且覆盖多孔固体支持物的内孔表面以及外部几何表面。按照这种方法,通过将带正电荷的氟碳化合物聚合物吸附至表面可以将带负电荷的表面转化为带电的氟碳化合物组合物。
可选地,通过将带负电荷的氟碳化合物聚合物吸附至表面可以将带正电荷的表面转化为带电的氟碳化合物组合物。参见,例如,美国专利公开第20100173224 A1号,其提供可以用于本文所述的方法和组合物的带正电荷和带负电荷的氟化聚合物和共聚物的实例。
V.使用具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物的方法
本文还描述使用本发明的氟碳化合物组合物的方法。在一些实施方案中,具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物可以用于从包含所关注的分子以及一种或多种可溶性杂质的水溶液选择去除可溶性杂质。
在一些实施方案中,将具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物并入合适的装置,所述装置可以用于纯化过程。
在一实施方案中,具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物是包裹在具有入口和出口的多层装置中的微孔膜。在另一实施方案中,具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物是包装入柱中的多孔层析树脂。在另一实施方案中,具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物是包裹在合适的提供流入口和出口的装置中的多孔整体柱。
以下方法描述使用包含如本文所述的具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的固体支持物的装置的一般方法。
将固体支持物用水或合适的缓冲水溶液完全湿润。随后使一定体积的合适的水溶液流过(或冲过)固体支持物以降低可萃取的化合物的水平。冲洗体积通常为包装的固体支持物的1-1,000体积,或者包装的固体支持物的5-100体积。然后将固体支持物用缓冲水溶液平衡,所述缓冲水溶液基本上与包含所关注的分子和待去除的杂质的缓冲溶液基本上相似。随后,使包含所关注的分子和杂质的溶液以确保溶液组分与固体支持物之间的接触的方式流过包含固体支持物的装置,收集流出物并分析所关注的分子和杂质的浓度。适当地选择装载量,即相对于溶液流过的固体支持物的体积,起始溶液中所关注的分子的量,以便实现高效杂质去除(如上文定义的最高LRV)和所关注的分子的最高收率。在一组专用实验中制备分离之前确定可接受的装载量的范围,通常表示为所关注的分子的重量/固体支持物体积。可接受的装载量的范围可以为0.01-10kg/L或0.5-5kg/L。较大的装载量通常是更期望的,这是由于更经济地使用固体支持物,降低由于非特异性结合至表面以及装置和管道的死体积中剩余量的所关注的分子的损失,并且降低流出物中潜在的可从固体支持物萃取物的浓度。
包含具有用本文所述的带电的氟碳化合物组合物CFC修饰的表面的固体支持物的装置(CFC装置)可以置于蛋白纯化方法如抗体纯化方法中的任何地方。表1示出并入CFC装置作为一个或多个中间步骤的蛋白纯化方法的实例,所述中间步骤通过下划线示出。应当理解可以使用这些方法的许多变化。表I中出现的各种步骤描述如下。
如本文所述,“蛋白捕获”或“抗体捕获”步骤指蛋白纯化方法中的步骤,其包括通过进行至少以下两个步骤来从澄清或未澄清的细胞培养液样品分离所关注的蛋白:i)使细胞培养液进行选自以下一个或多个的步骤:所关注的蛋白吸附在层析树脂、膜、整体柱、纺织或无纺介质;沉淀、絮凝、结晶、结合至可溶性小分子或聚合配体,从而获得包含所关注的蛋白如抗体的蛋白相;以及(ii)通过将蛋白洗脱或溶解入合适的缓冲溶液来重建所关注的蛋白。
结合/洗脱纯化是任选存在的方法步骤,其由所关注的蛋白结合至合适的层析介质、任选地洗涤结合的蛋白和用适当的缓冲溶液将其洗脱组成。
流过AEX抛光是任选存在的方法步骤,其由使过关注的蛋白的溶液流过合适的AEX层析介质而所关注的蛋白不显著结合至所述介质组成。
活性炭流过是设计为去除各种方法相关杂质的任选存在的纯化步骤,如共同待决的临时专利申请第61/575,349号所述,该临时专利申请援引加入本文。
流过聚集体去除是设计为去除各种聚集的靶蛋白种类的任选存在的纯化步骤,如共同待决的临时申请第61/609,533号所述,该临时申请援引加入本文。
病毒过滤由使蛋白溶液流过多孔膜组成,所述多孔膜可以为平板或中空纤维模式,其保留病毒颗粒至高度LRV,同时基本上通过所有所关注的蛋白。
表1
应当理解在上文表1中,抗体捕获以及结合/洗脱纯化步骤可以以三种模式中的任一种操作:(1)批处理模式,其中用靶蛋白装载捕获介质,停止装载,将介质洗涤并洗脱,并且收集混合物(pool);(2)半连续模式,其中通常样品的装载连续进行,即不停止流体流,而洗脱间歇进行;(3)完全连续模式,其中装载和洗脱均连续进行。
通过以下实施例进一步说明本发明,所述实施例不应当理解为限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图均援引加入本文。
实施例
实施例1 具有用氟碳化合物组合物修饰的表面的微孔膜的制备
在一代表性实验中,通过稀释或用水交换醇制备来自表2的带电的氟碳化合物组合物(CFC)的5%水性分散液。利用pH计和2M氢氧化锂水溶液将5%分散液中和至pH7。在本文所述的整个实验中使用由超高分子量聚乙烯(UHMWPE或UPE)制成的具有0.65微米的孔径等级的亲水性微孔膜作为多孔基底,并且在本文中称作“未修饰的膜”。将未修饰的膜切为5.25x5.25英寸正方形并放入6x8英寸聚乙烯袋中。将3mL等份的分散液移液至袋中膜的中心上。手推墨辊用来小心地涂布分散液并排出孔中的空气。然后该辊用来紧紧地退出过量液体。将袋切开,将膜在室温下吹干,然后在90℃下干燥15分钟。将膜冷却至室温,小心地用Milli-Q水湿润并用新鲜的Milli-Q水漂洗3次。然后将CFC包被的膜在室温下干燥。在本文所述的静态蛋白结合实验之前,将膜用Milli-Q水湿润,然后放入1mL相应的缓冲溶液中。
用来自水性分散液的CFC修饰的膜保持可用水湿润,并且具有>72达因/cm的临界湿润表面张力(CWST)。修饰的膜的典型纯水通量从未修饰的膜的2,000LMH/psi减少至约500-800LMH/psi。表2示出每当量的典型CFC添加百分比。
利用预成型的聚丙烯部分制备“微”装置。将包被的膜冲压为25mm盘。将4层125微米CFC修饰的膜放入每个装置并成型。活性过滤直径为约20mm,4层对应于0.157mL的体积每装置。通过使带正电荷的染料亚甲基蓝的稀溶液通过,随后打开装置肉眼观察来证实这个装置配置内的高效流量分布。
表2 可商购的带电的氟碳化合物组合物
表3 带电的氟碳化合物组合物的典型重量添加
实施例2 CFC修饰的膜在低盐浓度以及高盐浓度下均结合溶菌酶
这个实施例说明CFC修饰的膜可以在低盐浓度(25mM缓冲液,未添加盐)以及高盐浓度(25mM缓冲液,具有0.5M氯化钠)下结合靶分子,例如,在这种情况下为溶菌酶。
利用实施例1中制备的膜的25mm盘进行静态容量测量。首先将盘浸泡在相应的缓冲溶液中,然后浸没在1g/L溶菌酶中16小时。利用在280nm处的UV吸收测量残余的蛋白浓度。如图4所示,据证实在高盐浓度下结合容量仅略微减少,尤其在pH5下,这表明CFC修饰的膜具有非常强的盐耐受性。
实施例3 CFC修饰的膜可以在低盐浓度以及高盐浓度下结合BSA
在另一实验中,证实CFC修饰的膜可以在低盐浓度(25mM缓冲液,未添加盐)以及高盐浓度(25mM缓冲液,具有0.5M氯化钠)下结合另一靶分子,例如,牛血清白蛋白(BSA)。
利用实施例1中制备的膜的25mm盘进行静态容量测量。首先将盘浸泡在相应的缓冲溶液中,然后浸没在1g/L的BSA中16小时。利用在280nm处的UV吸收测量残余的蛋白浓度。如图5中证实的,在pH5下,虽然在添加盐时观察到容量的一些下降,但是仍保留显著容量。相反,在pH8下,随着盐的添加,结合容量增加。
这个令人惊讶的现象证实本文所述的带电的氟碳化合物组合物的独特和意想不到的特性,即在低和高盐浓度下,在生物分子的实际操作pH范围的两个极限下,并且对低等电点(BSA)和高等电点(溶菌酶)蛋白均保持高结合容量。
实施例4 CFC修饰的膜表现出对人多克隆IgG的静态结合容量
这个代表性实验说明CFC修饰的膜表现出对人多克隆IgG的静态结合容量
按照实施例3的方法,使用来自SeraCare Life Sciences,Inc.,Milford,MA的多克隆人IgG的1g/L溶液。图6中的数据表明与pH8相比,在pH5下盐对IgG结合容量影响很小,两者均在0.5MNaCl下进行。
实施例5 CFC修饰的膜表现出对宿主细胞蛋白的静态结合容量
这个代表性实验说明CFC修饰的膜表现出对宿主细胞蛋白的静态结合容量。宿主细胞蛋白(pI3-10)或HCP是宿主细胞(例如,CHO细胞)产生的超过100种不同蛋白的混合物,并且通常是与所关注的蛋白(例如,治疗性抗体)一起出现的主要污染物。
在一实验中,HCP混合物制备自空哺乳动物细胞培养物CHO-S。利用离心然后无菌过滤将其澄清,并且利用阳离子-交换结合/洗脱层析步骤将其进一步纯化。图7证实与未修饰的膜相比,CFC修饰的膜结合大量HCP。
实施例6 CFC修饰的膜表现出从澄清的细胞培养液选择性去除HCP
这个代表性实验证实CFC修饰的膜可以用于从澄清的细胞培养液选择性去除宿主细胞蛋白。
在一实验中,起始细胞培养物是产生称作Mab04的单克隆抗体的CHO-S细胞系。装载之前利用离心然后无菌过滤将培养物澄清。将总计约20mL(125的膜柱体积,或CV)的澄清细胞培养物装在CFC修饰的膜介质上,收集流出物并分析mAb、HCP和DNA浓度。结果如表4所示。
如这个实验所证实的,CFC修饰的膜表现出对宿主细胞蛋白和DNA的选择性。
表4
*这个范围中IgG浓度测量的固有误差导致收率看来高于理论上可行的100%。
实施例7 CFC修饰的膜可以用于从A蛋白洗脱混合物去除HCP
在一代表性实验中,证实CFC修饰的膜可以用于从A蛋白洗脱混合物去除宿主细胞蛋白。
利用A蛋白层析洗脱混合物作为进料进行与实施例6相似的实验。这个进料为pH5,在乙酸钠缓冲液中,具有约7g/L的MAb04浓度。预期这个进料的杂质水平(HCP和DNA)显著低于实施例6的澄清进料。用32mL(200CV)的A蛋白洗脱液装载介质。结果如表5所示,其利用A洗脱混合物证实CFC修饰的膜表现出对HCP和DNA的选择性。
表5
实施例8 CFC修饰的膜可以用于从已利用AEX-流过步骤进一步纯化的A蛋白洗脱混合物去除宿主细胞蛋白
在一代表性实验中,证实CFC修饰的膜可以用于从已利用AEX流过步骤进一步纯化的A蛋白洗脱混合物去除宿主细胞蛋白。
首先利用阴离子交换膜吸附器,可获得自EMD Millipore Corp的ChromaSorbTM纯化与实施例7相同的A蛋白洗脱液。根据制造商的说明书,将ChromaSorb装置装载至2.5 kg/L(375 CV),pH8。ChromaSorb步骤之后,处理流过混合物用于装载至CFC修饰的膜上。利用冰醋酸将混合物的pH降低至pH5。将另一15mL的50mM乙酸钠pH5添加至约30mL的ChromaSorbTM流过溶液以降低电导率。最终pH为5.07,电导率为3.7mS/cm。以1.6mL/min将约40mL的这种材料装载至CFC修饰的膜上。这个实验的结果如表6所示,其证实CFC修饰的膜具有对HCP的选择性。
表6
实施例9 CFC修饰的膜在低以及高盐浓度下从抗体进料去除HCP
在这个代表性实验中,证实CFC修饰的膜可以在低以及高盐浓度下从抗体进料去除HCP。
首先利用阴离子交换膜吸附器,可获得自EMD Millipore Corp的ChromaSorbTM纯化与实施例7相似的A蛋白洗脱液。根据制造商的说明书,将ChromaSorbTM装置装载至2kg/L(320CV),pH7。收集流出物混合物并发现其包含175.4ppm的HCP。ChromaSorbTM步骤之后,利用冰醋酸将混合物的pH降低至pH5,并且将流过混合物装载至CFC修饰的膜以及可商购的基准:PallS(可获得自Thermo Scientific,Waltham,MA)和CaptoTMMMC(GE Healtcare)HiTrapTM柱。将CFC修饰的膜和S装载至200CV,并且将CaptoTMMMC装载至150CV。收集流出物并测定MAb04收率和HCP浓度。结果如图8A所示。
在另一实验中,首先利用阴离子交换膜吸附器,可获得自EMDMillipore Corp的ChromaSorbTM纯化与实施例7相似的A蛋白洗脱液。根据制造商的说明书,将ChromaSorbTM装置装载至3.1kg/L(320CV),pH7。收集流出物混合物并发现其包含347ppm的HCP。ChromaSorbTM步骤之后,利用冰醋酸将混合物的pH降低至pH5,并且通过添加氯化钠至250mM的终浓度来增加电导率。将流过混合物装载至CFC修饰的膜以及可商购的基准:PallS(可获得自Thermo Scientific,Waltham,MA)和CaptoTMMMC(GE Healtcare)HiTrapTM柱。将CFC修饰的膜和S装载至200CV,并且将CaptoTMMMC装载至150CV。收集流出物并测定MAb04收率和HCP浓度。结果如图8B所示。
观察到CFC修饰的膜成功地去除大部分的HCP。还观察到在低盐浓度下的表现与可商购的阳离子-交换膜PallS可比,同时其在高盐浓度下不变坏(事实上,HCP LRV略高),从而证实CFC修饰的膜显著优于本文中用作基准的阳离子-交换可商购的膜
实施例10 CFC修饰的膜可以用于从纯化的抗体进料去除宿主细胞蛋白
在一代表性实验中,根据公开的美国专利公开第20090232737号中公开的方法将收获的来自表达单克隆抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞培养液澄清并纯化。将溶液缓冲液交换为25mM Tris-HCl,pH8.0,并且通过添加纯抗体将抗体浓度调整至2.0g/L。首先通过EMD MilliporeChromaSorbTM膜吸附器装置总计40g/L的装载来纯化溶液,将pH降低至5.0,并且通过包含CFC修饰的膜的微装置来进一步纯化流出物。
如表7所示,CFC修饰的膜表现出对HCP的选择性。
表7
实施例12 CFC修饰的膜可以用于耐盐性病毒去除
在一代表性实验中,证实CFC修饰的膜可以用于耐盐性病毒去除。
将来自实施例1的CFC修饰的膜包裹入上文所述的0.16mL“微”装置。将所述装置用水湿润。向10g/L的Mab04的A蛋白洗脱液掺入XMuLV病毒,并且利用1M Tris碱和5.5M NaCl储备溶液调整至所需的pH和电导率。在pH7.0和100mM NaCl的情况下,观察到抗体沉淀,因此未进行该条件的病毒定量。将所述装置装载至1kg/L的抗体,并且测定混合物的残余XMuLV。令人惊讶的是,在低盐浓度和在100mM NaCl下均观察到强保持能力。
表8 XMuLV的LRV.
pH/[NaCl] | 0 | 20 | 50 | 100 |
5 | n/m | >4.02 | n/m | 3.39 |
7 | >3.77 | >4.02 | >4.15 | n/m |
n/m–未测量
根据本说明书内引用的参考文献的教导最全面地理解本说明书,所述参考文献援引加入本文。本说明书内的实施方案提供本发明中的实施方案的说明,并且不应当理解为限制其范围。技术人员容易地认识到本发明涵盖许多其他实施方案。所有出版物和发明均整体援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致,则本说明书会取代任何这样的材料。本文中任何参考文献的引用不是承认这类参考文献是本发明的现有技术。
除非另有说明,本说明书(包括权利要求书)中使用的所有表示成分、细胞培养、处理条件等的量的数字应当理解为在所有条件下受到术语“约”修饰。因此,除非另有相反的说明,数值参数为近似值,并且可以根据通过本发明试图获得的期望特性而变化。除非另有说明,一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员会认识到或者能够利用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。以下权利要求书意图涵盖这类等同物。
本领域技术人员会清楚,可以进行本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅通过实例的方式提供,并不意味着以任何方式限制。本发明的真正范围和精神通过以下权利要求书示出,说明书和实施例仅认为是示例性的。
Claims (16)
1.一种从样品去除靶生物分子的方法,所述方法包括:
(i)提供包含所述靶生物分子的样品;以及
(ii)使所述样品与具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物接触,其中所述靶生物分子结合至该经修饰的固体支持物,
从而从所述样品中去除所述靶生物分子。
2.权利要求1的方法,其中所述靶生物分子为可溶性杂质。
3.权利要求2的方法,其中所述可溶性杂质为宿主细胞蛋白。
4.权利要求1的方法,其中所述靶生物分子为病毒或病毒颗粒。
5.权利要求4的方法,其还包括回收结合的靶生物分子的步骤。
6.一种降低包含靶蛋白以及一种或多种杂质的样品中所述一种或多种杂质的水平的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)提供包含靶蛋白以及一种或多种杂质的样品;
(ii)使所述样品与具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物接触;以及
(iii)获得流出物,
其中相对于(i)中所述样品中一种或多种杂质的水平,所述流出物包含较低水平的所述一种或多种杂质。
7.权利要求6的方法,其中所述样品包括细胞培养进料。
8.权利要求1的方法,其中所述样品包含至少100mM的盐浓度。
9.权利要求6的方法,其中所述样品包含至少100mM的盐浓度。
10.权利要求1的方法,其中所述带电的氟碳化合物组合物包含以下结构:
其中R1选自磺酸、硫酸、膦酸、磷酸和羧酸残基;R2为任选存在的连接单元,其选自短的饱和及不饱和烃基;R3为F、Cl或C1-C10全氟烷基基团,并且F为氟基团。
11.权利要求6的方法,其中所述带电的氟碳化合物组合物包含以下结构:
其中R1选自磺酸、硫酸、膦酸、磷酸和羧酸残基;R2为任选存在的连接单元,其选自短的饱和及不饱和烃基;R3为F、Cl或C1-C10全氟烷基基团,并且F为氟基团。
12.权利要求10的方法,其中R2为x的范围为1-约10且y的范围为0-约20的CxHy基团或烷氧基、酯、酰胺等。
13.权利要求11的方法,其中R2为x的范围为1-约10且y的范围为0-约20的CxHy基团或烷氧基、酯、酰胺等。
14.一种从样品纯化靶分子的流过方法,所述方法包括以下步骤:
(a)使包含所述靶分子以及一种或多种杂质的样品进行A蛋白亲和层析方法;
(b)使来自步骤(a)的A蛋白洗脱液流过活性炭介质;
(c)使来自(b)的产物流过阴离子交换层析介质;
(d)使来自(c)的产物流过阳离子交换层析介质;
(e)使来自(d)的产物流过具有用带电的氟碳化合物组合物修饰的表面的多孔固体支持物;
(f)使来自(e)的产物流过病毒过滤介质;以及
(g)回收来自(f)的产物,从而纯化所述靶分子。
15.权利要求14的方法,其中所述靶分子为抗体。
16.权利要求15的方法,其中所述抗体为单克隆抗体。
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