CN104099401B - 磷脂酶a2水解反应试剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于心血管疾病的临床诊断技术领域，具体来说，涉及一种磷脂酶A₂水解反应促进剂、底物稳定剂以及用于体外检测磷脂酶A₂水解反应的试剂。磷脂酶A₂水解反应促进剂是除L‑丝氨酸之外的、含有2‑氨基‑3‑羟基丙酸结构的化合物或其盐；磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂是含有羟基的二糖类化合物，用于体外检测磷脂酶A₂的试剂至少含有1号试剂或3号试剂，1号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应促进剂，3号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂。体外检测磷脂酶A₂的方法是用磷脂酶A₂水解其特异性底物，水解时，添加磷脂酶A₂水解反应促进剂和/或磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂或者添加上述用于体外检测磷脂酶A₂的试剂。

Description

磷脂酶A2水解反应试剂

技术领域

本发明属于心血管疾病的临床诊断试剂技术邻域，具体来说，涉及一种磷脂酶A₂水解反应促进剂、底物稳定剂以及用于体外检测磷脂酶A₂水解反应的试剂，以及利用该试剂检测磷脂酶A₂的检测方法。

背景技术

心血管疾病是人类最常见的疾病，严重危害着人类的生命和健康。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是心血管疾病的病理生理基础。流行病学调查显示，在西方发达国家，AS是发病率和死亡率最高的疾病，在我国其发病率及死亡率也呈逐年上升趋势。AS是一种慢性炎症性疾病，是血管内皮功能失常和炎症反应相互作用引起的一个动态性病变过程，该进程的急剧变化可导致血管内皮损伤、斑块破裂、血栓形成，越来越多的证据表明局部和全身炎症在AS的发生、发展中起着重要作用。AS可引发许多严重后果，如冠状AS可导致冠状动脉狭窄，引起心肌缺血，发生急性心肌梗死，甚至猝死；脑AS则引起脑缺血、眩晕、头痛和昏厥等症状，亦可促进脑动脉血栓形成或破裂出血，诱发中风等。因此，早期发现和防治AS是目前医学领域急需解决的一个重要研究课题。

AS是多种危险因子共同作用的结果。Meta分析数据表明，炎症标志物可用于预测心血管疾病事件。过去几年中，人们已提出了一系列经典或新型仍在研究中的炎症标志物，以评价炎症对AS形成的作用。迄今发现了许多与心血管病有关的炎症标志物，如白细胞介素-6和C反应蛋白等。而Lp-PLA₂作为一种新兴的炎症标志物，在血管炎症中有关键作用且对AS发展有重要影响，目前愈加受到关注(The Lp-PLA₂Studies Collaboration,Lipoprotein-associated phospholipase A₂and risk of coronary disease,stroke,and mortality:collaborative analysis of32prospective studies,Lancet,2010,375:1536-1544)。

Lp-PLA₂(PAF-AH)是磷脂酶A₂超家族中的一员，Lp-PLA₂是丝氨酸依赖的磷脂酶A，其催化活性不依赖钙离子，属于PLA2G7，含有441个氨基酸残基，相对分子质量约为45,400。人血清Lp-PLA₂由巨噬细胞、淋巴细胞以及肥 大细胞合成与分泌，在AS部位大量存在，并可被炎症介质调节。Lp-PLA₂可水解血管内膜的氧化卵磷脂，生成溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸，后二者是促炎介质，能刺激产生粘附分子和细胞因子，促进单核细胞向血管内膜聚集。单核细胞在内膜聚集衍生为巨噬细胞，吞噬氧化型低密度脂蛋白变成泡沫细胞，最终聚集成AS斑块，释放细胞因子和蛋白酶，降解纤维帽的平滑肌细胞和胶原基质，使斑块变得脆弱、破裂，导致血栓形成和心血管事件的发生。因此，Lp-PLA₂具有促AS形成的作用，且Lp-PLA₂活性与其浓度呈正相关；此外，Lp-PLA₂不依赖于其他风险预测因子，可作为冠心病新的危险因子，能独立预测心血管事件，对传统危险因素不能鉴别出的风险人群更具有预测价值。

作为目前唯一的与血管内壁炎症密切相关的生物标志物，Lp-PLA₂的水平反映了患者血管内壁炎症的状态，为临床判断AS斑块的稳定性提供了直接的实验室指标，成为心脑血管事件中高危患者早期识别和筛查的特异性指标。因此，自2010年后，Lp-PLA₂被写入国外4个国家或/和地区级的临床指南，成为临床的常规检测指标。针对Lp-PLA₂的测定方法，目前国内外主要采用高效液相色谱法或酶联免疫吸附法检测Lp-PLA₂的蛋白量(WO2005/074604、EP2280282、US2007/0281323、CN103619831、CN103033629)，对其活性无能为力。

目前已知Lp-PLA₂的活性才是其发挥病理、生理作用的基础(The Lp-PL A₂Studies Collaboration,Lipoprotein-associated phospholipase A₂and risk of c oronary disease,stroke,and mortality:collaborative analysis of 32 prospective studies,Lancet,2010,375:1536-1544)，而仅检测酶蛋白的含量无法准确地反应Lp-PLA₂在体内的活性水平。因此，对该酶的活性检测对于心血管事件的早期识别和筛查十分重要。并且相比其他方法学，酶法检测更适用于对大量试样进行大规模的检测，更具临床实用性，但迄今仅有文献Kosaka,T et al.,Clini ca Chimica Acta,2000,296:151-161.和Aaksman,AJ et al.,European Journal of Biochemistry,1991,200:187-193.，专利WO2005/113797中公开了酶法检测Lp-PLA₂活性的方法。该方法是利用试样中的磷脂酶A₂分解试剂中的特异性底物而对产生的色素进行检测的方法。通常，酶促反应是一个缓慢持续的 反应进程，需要一定时间使反应完全。磷脂酶水解反应也不例外，磷脂酶A₂在试样中的含量较低，故需要较长孵育时间使磷脂酶A₂水解反应完全(Aksma n,AJ et al.,European Journal of Biochemistry,1991,200:187-193.)，现有公开的检测方法中，需要于37℃条件下孵育15～180分钟，才能使磷脂酶A₂的水解反应达到饱和(Aksman,AJ et al.,European Journal of Biochemistry,1991,200:187-193.；Washburn,WN et al.,Journal of the American Chemical So ciety,1990,112:2040-2041.)。而适用于以酶法检测Lp-PLA₂时的体系中的磷脂酶A₂水解反应加速剂迄今尚未见公开。有已知的方法是使用聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50)作为乳胶增强免疫比浊法检测Lp-PLA₂时促进磷脂酶A₂水解反应的加速剂(CN103033629)，但由于方法学不同，当这二类加速剂用于酶法体系时会使底物难以与酶充分接触，导致难以发生酶促反应，致使检测结果准确度下降。此外，作为使用酶法检测Lp-PLA₂的实例，已知有添加1-myristoyl-2-(p-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine(以下简称MNP)和1-O-hexa decyl-2-deoxy-2-thio-S-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholine(以下简称为2-thio-PAF)(Aaksman,AJ et al.,European Journal of Biochemistry,1991,200:187-193.)作为底物来检测Lp-PLA₂活性的文献(Kosaka,T et al.,Clinica Chimi ca Acta,2000,296:151-161.，Aaksman,AJ et al.,European Journal of Bioch emistry,1991,200:187-193.)，但该文献中没有关于试剂的稳定性和保存方面的描述。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种磷脂酶A₂水解反应促进剂，以促进磷脂酶A₂的水解反应，且不抑制磷脂酶A₂的活性和酶促反应。

本发明为实现上述发明目的，采用的技术方案为：所述磷脂酶A₂水解反应促进剂为除L-丝氨酸之外的、含有2-氨基-3-羟基丙酸结构的化合物及其盐。优选N-烷基-L-丝氨酸及其盐或N-酰基-L-丝氨酸及其盐。

所述N-烷基-L-丝氨酸及其盐或N-酰基-L-丝氨酸及其盐，优选具有如下通式(1)的化合物或其盐，

通式(1)中，M为氢离子或与羧酸形成盐的金属离子，金属离子优选Na⁺，K⁺或Ca²⁺，最优选Na⁺。X表示次甲基，亚甲基或羰基，优选羰基，与通式中的2位氨基形成肽键；与X相连的Y表示-R₁CH₃，-R₁NH₂，-R₁NHR₂或-R₁NR₂R₃中的任意一种，优选-R₁CH₃和-R₁NR₂R₃，最优选-R₁CH₃。其中，R₁优选直链或支链状且碳原子数为0～14的烷基，特别优选直链状且碳原子数为0～3的烷基，最优选直链状且碳原子数为1～3的烷基。R₂和R₃优选直链或支链状且碳原子数为1～3的烷基，更优选直链状的碳原子数1～3的烷基，最优选甲基。

选择通式(1)所示的化合物时，优选其游离酸或其盐，更优选游离酸，进一步优选N-甲基-L-丝氨酸，N-乙基-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-丝氨酸，N-正丁基-L-丝氨酸，N-正丁基-L-丝氨酸钠，N-正丁酰基-L-丝氨酸，N-正丁酰基-L-丝氨酸钠，N-正丁酰基-L-丝氨酸钾，N-(N’,N’-二甲基)甲基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二甲基)乙基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二乙基)乙基-L-丝氨酸，或(N’,N’-二乙基)乙基-L-丝氨酸钠，其中更优选N-正丁酰基-L-丝氨酸，N-正丁酰基-L-丝氨酸钠，N-正丁酰基-L-丝氨酸钾，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸钠，最优选N-正丁酰基-L-丝氨酸。

该磷脂酶A₂水解反应促进剂在磷脂酶A₂水解反应中与磷脂酶A₂共存。

本发明的第二个目的是提供一种磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂，以提高磷脂酶A₂的检测准确度。

本发明为实现上述发明目的，采用的技术方案为：选用二糖类化合物作为所述磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂。

所述二糖类化合物为由1个葡萄糖单体通过糖苷键与1个葡萄糖单或1个果糖单体或1个半乳糖单体连接形成。

优选由2个葡萄糖单体形成的二糖。

所述二糖类化合物为海藻糖，黑曲霉糖，纤维二糖，龙胆二糖，昆布二糖，麦芽酮糖，异麦芽酮糖，松二糖或蜜二糖中的任意一种，优选海藻糖。

本发明的第三个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒可以快速、准确地体外检测磷脂酶A₂。

本发明为实现上述发明目的，采用的技术方案为：所述试剂盒至少含有1号试剂或3号试剂,该1号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应促进剂，该3号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂。该试剂还可以含有2号试剂，该2号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应底物稀释液。

1号试剂中的磷脂酶A₂水解反应促进剂优选N-烷基-L-丝氨酸或其盐或N-酰基-L-丝氨酸或其盐。

3号试剂中的磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂优选由2个葡萄糖单体形成的二糖类化合物，特别优选海藻糖。

本发明的第四个目的是提供一种检测磷脂酶A₂的方法，以快速、准确地检测磷脂酶A₂。

本发明为实现上述发明目的，采用的技术方案为：该检测磷脂酶A₂的方法是用磷脂酶A₂水解其特异性底物，水解时，添加磷脂酶A₂水解反应促进剂和/或磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂；或者上述至少包括1号试剂和/或3号试剂的试剂。

本发明的优点：通过添加本发明的磷脂酶A₂水解反应促进剂至用于测定Lp-PLA₂的试剂中，可加速磷脂酶A₂的水解反应速率，使孵育时间从30分钟降至3分钟以内，在短时间内促使磷脂酶A₂完全分解其特异性底物，释放出色素，信号值达饱和，由此可达到简便、准确、快速检测磷脂酶A₂的效果。此外，通过使用本发明的稳定剂和稳定化方法，可使磷脂酶A₂的特异性底物稳定化，在冷藏条件下可以液体形态稳定至少12个月，使含有该类底物的试剂流通时的保 存稳定性更佳。本发明的试剂由1号试剂、2号试剂和3号试剂组成，含有磷脂酶A₂水解反应促进剂以及针对磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂，该试剂利用酶法，可以简便、准确、快速地对临床检验中的脂蛋白相关磷脂酶A₂(Lp-PLA₂)进行活性检测。Lp-PLA₂作为冠心病新的危险因子，能独立预测心血管事件，在临床上可用于心脑血管事件中高危患者早期识别和筛查。

附图说明

图1为实施例2的Lp-PLA₂标准品的测定结果。

图2为实施例6的Lp-PLA₂标准品的测定结果。

图3为实施例7对36例试样的检测结果与酶联免疫吸附法(Elisa)方法检测结果的相关性。

具体实施方式

以下结合附图通过实施例对本发明的特征及优选方式作进一步详细说明。

1.磷脂酶A₂水解反应促进剂

作为能够在本发明中使用的磷脂酶A₂水解反应促进剂，必须能够促进磷脂酶A₂水解反应，同时不影响酶活性的检出，且不会导致试剂空白值升高，满足上述三条要求的促进剂均可使用。目前已有公开的磷脂酶A₂促进剂有：佛波酯(Wu,Y et al.,Biochemical Journal,2009,419:669-679)、心磷脂(Ghomashchi,F et al.,Journal of Biological Chemistry,2010,285:36100-36111)、胆汁酸(De Luca,D et al.,Intensive Care Medicine,2009,35:321-326)和脱氧胆酸盐(Sahu,S et al.,Biochimica et Biophysica Acta,1977,489:307-317)等。但是，上述化合物均在体外细胞实验中使用，尚未有公开可用于体外诊断试剂中的磷脂酶A₂促进剂。专利文献5公开了使用聚乙二醇或硫酸葡聚糖(DS-50)作为乳胶增强免疫比浊法检测Lp-PLA₂时促进磷脂酶A₂水解反应的加速剂的方法，但在使用酶法的试剂中，这二类加速剂会使底物难以与酶充分接触，导致难以发生酶促反应，致使检测结果准确度下降。本发明人经过研究，发现具有除L-丝氨酸之外的含有2-氨基-3-羟基丙酸结构的化合物或其盐可作为体外诊断试剂中的磷脂酶A₂促进剂，优选N-烷基-L-丝氨酸或其盐或N-酰基-L-丝氨酸或其盐。

所述N-烷基-L-丝氨酸或其盐或N-酰基-L-丝氨酸或其盐，优选具有如下通式的化合物及其盐，

通式中，M为氢离子或与羧酸形成盐的金属离子，金属离子优选Na⁺，K⁺或Ca²⁺，最优选Na⁺。X表示次甲基，亚甲基或羰基，优选羰基，与通式中的2位氨基形成肽键。与X相连的Y表示-R₁CH₃，-R₁NH₂，-R₁NHR₂或-R₁NR₂R₃中的任意一种，优选-R₁CH₃和-R₁NR₂R₃，最优选-R₁CH₃。R₁优选直链或支链状且碳原子数为0～14的烷基，特别优选直链状且碳原子数为0～3的烷基，最优选直链状且碳原子数为1～3的烷基。R₂和R₃优选直链或支链状且碳原子数为1～3的烷基，更优选直链状的碳原子数1～3的烷基，最优选甲基。

选择通式所示的化合物时，优选其游离酸或其盐，更优选游离酸。

选择通式所示的化合物时，优先选择N-甲基-L-丝氨酸，N-乙基-L-丝氨酸，N-乙酰基-L-丝氨酸，N-正丁基-L-丝氨酸，N-正丁基-L-丝氨酸钠，N-正丁酰基-L-丝氨酸，N-正丁酰基-L-丝氨酸钠，N-正丁酰基-L-丝氨酸钾，N-(N’,N’-二甲基)甲基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二甲基)乙基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二乙基)乙基-L-丝氨酸，或(N’,N’-二乙基)乙基-L-丝氨酸钠等，其中更优选N-正丁酰基-L-丝氨酸，N-正丁酰基-L-丝氨酸钠，N-正丁酰基-L-丝氨酸钾，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)乙酰基-L-丝氨酸钠，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸，N-(N’,N’-二甲基)丙酰基-L-丝氨酸钠等，最优选的化合物为N-正丁酰基-L-丝氨酸。

上述通式所示的化合物均可通过已公开的方法制备或直接购买商品化的产品。如N-烷基取代的化合物可由商品化的烷基醇与商品化的羟基和羧基均被保护基取代的L-丝氨酸，如O-叔丁基二甲基氯硅醚-L-丝氨酸甲酯，通过光延反应 合成；而N-羰基取代的化合物则可由商品化的烷基羧酸和商品化的羟基和羧基均被保护基取代的L-丝氨酸利用常规液相多肽合成方法，使用耦合剂制备，耦合剂有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)等。直接购买的商品化产品也可根据需要，与金属成盐后使用。

上述磷脂酶A₂水解反应促进剂的使用浓度没有具体限制，仅需使磷脂酶A₂水解速率加快即可。使用浓度的下限一般为1mmol/L，优选2mmol/L以上，最优选5mmol/L以上；使用浓度上限为20mmol/L，优选15mmol/L以下，最优选10mmol/L以下。

上述磷脂酶A₂水解反应促进剂，优选能加速磷脂酶A₂水解反应1.5倍以上的化合物。为了使反应更迅速，缩短检测所需时间，更优选可加速2倍以上的化合物。对于磷脂酶A₂水解反应的加速程度可以通过使用实施例1的方法来判断：测定含有磷脂酶A₂的试样在加入磷脂酶A₂特异性底物——MNP和磷脂酶A₂水解反应促进剂之后的吸光度之差，并持续检测至达最大吸光度A_max，记录所需时间，计算所述吸光度变化率(ΔA/T)，并与未添加促进剂时(对照)作比较。

2.磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂

对于本发明的磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂的筛选，可以选用任意化合物，只要该化合物对磷脂酶A₂特异性底物有稳定化作用即可，但优选二糖类化合物。对于二糖类化合物，优选由1个葡萄糖单体通过糖苷键与1个葡萄糖单体或1个果糖单体或1个半乳糖单体连接形成的二糖，如海藻糖、黑曲霉糖、纤维二糖、龙胆二糖、昆布二糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖、松二糖或蜜二糖等，优选海藻糖、黑曲霉糖、纤维二糖、龙胆二糖、昆布二糖等由2个葡萄糖单体形成的二糖，特别优选海藻糖。

以上化合物均有市售品，如可以从国药集团化学试剂有限公司购买。

上述磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂的使用浓度可以为任意浓度，只要能在试剂保存过程中抑制用于酶检出反应的磷脂酶A₂特异性底物的自然水解即可，优选能够在以液体状态冷藏保存试剂时抑制底物自然水解的浓度，以底物MNP为例，在添加海藻糖作为稳定剂的情况下，下限浓度为1mmol/L，优选2mmol/L 以上；上限浓度为10mmol/L，优选5mmol/L以下。

对于稳定剂的筛选将使用实施例5的方法来判断。

3.试剂

本发明所述的使用含有上述磷脂酶A₂水解反应促进剂和磷脂酶A₂特异性底物稳定剂的试剂，包括1号试剂和3号试剂。1号试剂含有上述磷脂酶A₂水解反应促进剂；3号试剂中含有磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂，该磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂可以使磷脂酶A₂特异性底物以液态形式冷藏保存至少12个月还能显示出稳定的试剂性能。

1号试剂中的磷脂酶A₂水解反应促进剂优选含有以N-烷基-L-丝氨酸或其盐或N-酰基-L-丝氨酸或其盐，特别优选以N-酰基-L-丝氨酸或其盐作为磷脂酶A₂水解反应促进剂，如N-正丁酰基-L-丝氨酸。该1号试剂中的磷脂酶A₂水解反应促进剂可为任意浓度，一般为1mmol/L以上，优选2mmol/L以上，最优选5mmol/L以上；使用浓度为20mmol/L以下，优选15mmol/L以下，最优选10mmol/L以下。

所述1号试剂可见实施例2和实施例3中所示的配方。利用1号试剂测定试样中Lp-PLA₂的活性，可通过实施例4中的方法实现。

3号试剂中的磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂优选由2个葡萄糖单体形成的二糖，特别优选海藻糖。该3号试剂中的磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂的使用浓度为1mmol/L以上、10mmol/L以下，优选2mmol/L以上、5mmol/L以下。

上述试剂盒还包括2号试剂，该2号试剂为底物稀释液。

除上述磷脂酶A₂特异性底物稳定剂外，还可以使用缓冲液稳定磷脂酶A₂特异性底物。缓冲液用于缓冲2号试剂中的底物稀释液和3号试剂中的磷脂酶A₂特异性底物的稳定剂，优选中性pH的Good’s缓冲液，如4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，3-(羟乙基哌嗪)-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)，甘氨酸(Glycine)，磷酸盐等，更优选磷酸盐缓冲液，特别优选磷酸氢二钠-磷酸氢二钠缓冲液。

4.测定方法

使用上述试剂检测试样中脂蛋白相关磷脂酶A₂的活性，可以按如下方式操作：

1)1号试剂中加入最小1～500μL的被测试样，于37℃条件下孵育一定时间；

2)检测波长为400～410nm时的吸光度；

3)将含有磷脂酶A₂特异性底物，本发明中以MNP为例，但不局限于该底物及其稳定剂的3号试剂加入至2号试剂中稀释，混合液加入含有被测试样的1号试剂中，于37℃条件下孵育3分钟；

4)检测波长为400～410nm时的吸光度。此时，利用公式(1)可计算出被测试样中脂蛋白相关磷脂酶A₂的活性。

$\mathrm{Lp}-\mathrm{PL}{A}_2(U/L)=\frac{\mathrm{\ΔA}}{\min }\×\frac{v\×{10}^6}{v\×\mathrm{\ϵ}\×L}$ 公式(1)

其中，V＝反应体系体积(试剂和试样的总体积，mL)

T＝反应时间(min)

v＝试样的体积(mL)

ε＝摩尔消光系数(cm·mol)

L＝比色杯光径(cm)

ΔA/min＝吸光度变化值

实施例6对本发明中所述的使用1号试剂和2号试剂的试剂，以及使用该试剂检测试样中脂蛋白相关磷脂酶A₂的活性的方法进行说明，但本发明并不局限于该实施例。实施例7中，将使用实施例6中的试剂与Lp-PLA₂检测试剂盒(酶联免疫吸附法，厂家：天津康尔克生物技术有限公司，注册号：津食药监械(准)字2011第2400027号，产品标准：YZB/津1525-2011)对试样进行检测，验证试剂性能及相关性。

实施例1：磷脂酶A₂水解反应促进剂的筛选

试剂：

1)1号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

10mmol/L氯化钠

800U/L脂蛋白相关磷脂酶A₂(Lp-PLA₂)标准品

试验样品见表1。

2)2号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

200mmol/L磷脂酶A₂特异性底物MNP

作为试验样品，分别独立使用受试物质，表1中[C]所示浓度为该物质在1号试剂中的最终浓度。

操作方法：

将1号试剂2000μL于37℃条件下孵育5分钟，准确地于5分钟后向1号试剂中添加2号试剂500μL。在405nm波长下检测添加2号试剂的吸光度A₁和添加2号试剂后3分钟的吸光度A₂，并持续检测吸光度直至该值达最大值A_max并保持恒定，检测时间为添加2号试剂后第3，5，10，15，20，30分钟。将上述试验样品的磷脂酶A₂水解反应促进效果的评价结果列于表1。表1中所示的ΔA是A₂-A₁的差值，Δt是达到最大值A_max所需的时间，(ΔA/T，T＝3)是磷脂酶A₂在3分钟内的反应速率，即表示酶的反应活性，该值越大，说明磷脂酶A₂的水解反应速率越快，亦说明试验样品对磷脂酶A₂水解反应的具有促进效果。从结果中可观察到本实施例中使用的N-取代-L-丝氨酸或其盐对该水解反应有1.5倍以上的反应促进效果。本发明中，化合物对磷脂酶A₂水解反应的促进作用能够达到1.5倍以上即可。同时，A_max与不添加促进剂时相比，不应有大幅减小，若有减小，说明该化合物对磷脂酶A₂的检出有干扰。

表1

由表1可知，对具有通式(2)所示结构的化合物进行筛选，

作为N-取代-L-丝氨酸或其盐，如下通式(1)所示的化合物或其盐具有磷脂酶A₂水解反应促进作用。

通式(1)中，M为氢离子或与羧酸形成盐的金属离子；X为CH，CH₂或CO中的任意一种；Y为H或-R₁CH₃，-R₁NH₂，-R₁NHR₂或-R₁NR₂R₃中的任意一种，其中R₁，R₂和R₃为烷基；最优选满足如下条件的化合物：X为羰基，Y为-R₁CH₃，其中R₁为直链状的碳原子数为1～3的烷基。化合物N-正丁酰基-L-丝氨酸具有最佳的磷脂酶A₂水解反应促进作用，可加速约2.1倍反应速率，在3分钟内即可使酶促反应完成，且不影响检测。此外，使用其他磷脂酶A₂特异性底物，如1-palmitoyl-2-(p-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine也可得到类似的结果。

实施例2：1号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

10mmol/L氯化钠

5mmol/L N-正丁酰基-L-丝氨酸

2mmol/L乙二胺四乙酸

0.02％ProClin300

实施例3：试剂

1号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

10mmol/L氯化钠

5mmol/L N-正丁酰基-L-丝氨酸

2mmol/L乙二胺四乙酸

0.02％ProClin300

2号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

200mmol/L磷脂酶A₂特异性底物

实施例4：Lp-PLA₂标准品活性的检测

使用实施例3的试剂对试样进行测定。

试样

1)Lp-PLA₂标准品(800U/L)

2)按1:2，1:4，1:8，1:16，1:32的比例将800U/L Lp-PLA₂标准品稀释

操作方法

使用全自动生化仪进行测定。将20μL试样加至180μL1号试剂中，于37℃下保温，检测主波长405nm，和副波长505nm下的吸光度变化。5分钟后添加50μL2号试剂，于37℃下保温3分钟，检测主波长405nm，和副波长505nm下的吸光度变化。通过利用800U/L Lp-PLA₂标准品作为校正物质，将测得的吸光度变化换算为测定值，结果列于表2。Lp-PLA₂活性的校正曲线如图1所示。由图1可知，使用本发明的含有磷脂酶A₂反应促进剂的试剂可以对Lp-PLA₂的活性进行定量检测。并且，将实施例2和实施例3中的1号试剂以液体状态于37℃下保存7天，对其空白本底和试剂性能进行检测，均无异常变化。因此推测本实施例中的R₁试剂可以液体状态在冷藏条件下稳定12个月以上。

表2

稀释比例	1	2	平均值	理论值	相对偏差	绝对偏差
							1	789.4	792.9	791.15	785.94	0.66％	5.21
0.5	393.7	391.1	392.4	389.81	0.67％	2.59
							0.25	186.4	184.3	185.35	191.74	-3.33％	-6.39
0.125	95.3	94	94.65	92.71	2.09％	1.94
							0.0625	45	43.7	44.35	43.19	2.68％	1.16
0.03125	22.1	21.5	21.8	18.44	18.25％	3.36

实施例5：磷脂酶A₂特异性底物(以MNP为例)稳定剂的筛选

试剂

1号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

10mmol/L氯化钠

5mmol/L N-正丁酰基-L-丝氨酸

2mmol/L乙二胺四乙酸

0.02％ProClin300

2号试剂

50mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH＝7.0

200mmol/L磷脂酶A₂特异性底物

试验样品

作为试验样品，分别独立使用受试物质，其中()内为2号试剂中的最终浓度：酒石酸(1mmol/L)，β-环糊精(1mmol/L)，山梨糖醇(1mmol/L)，海藻糖(1，2，5mmol/L)，昆布二糖(1，2，5mmol/L)，蜜二糖(1，2，5mmol/L)。

试样:

800U/L Lp-PLA₂标准品

操作方法:

a)空白本底的检测：在410nm条件下检测在37℃下保温的2号试剂(500μL)的空白吸光度A₁。在制备试剂后立即将其保存于37℃条件下，分别于 保存2天，7天，9天后按上述操作方法对试剂性能进行检测。结果列于表3。

表3

表3说明，酒石酸，山梨糖醇，海藻糖，昆布二糖，蜜二糖对底物的自然水解有抑制作用，可较好的抑制试剂本底的升高。其中，酒石酸和山梨糖醇对底物轻微的稳定化作用，而二糖类的稳定化效果要明显优于其他化合物。

b)试剂性能的检测：使用全自动生化仪对含有海藻糖(1mmol/L，2mmol/L，5mmol/L)，昆布二糖(1mmol/L，2mmol/L，5mmol/L)，蜜二糖(1mmol/L，2mmol/L，5mmol/L)的试剂进行试剂性能测定。将20μL试样加至1号试剂(180μL)中，于37℃下保温，检测主波长405nm，和副波长505nm下的吸光度变化。5分钟后添加2号试剂(50μL)，于37℃下保温3分钟，检测主波长405nm，和副波长505nm下的吸光度变化，将测得的吸光度变化换算为测定值，结果列于表4。

表4

表4中可知，若不添加稳定剂，该试剂在37℃下保存2天后在检测试样时会出现较大的偏差，造成检测结果不准确。而在添加二糖类稳定剂，如海藻糖等后，该试剂的空白本底在37℃下保存9天时间几乎不发生变化，说明底物的自然水解被抑制，同时，对于试样中Lp-PLA₂活性的检出，添加该类稳定剂后使试剂性能保持稳定，在9天内对同一试样的检测结果偏差很小。因此，浓度为1mmol/L以上的二糖类化合物对磷脂酶A₂的特异性底物(如MNP)有稳定化作用，其中，海藻糖的稳定化作用最佳。由这些结果可以推测，该试剂在冷藏条件下可以保持12个月以上的稳定状态。

实施例6：用于检测Lp-PLA₂活性的含有磷脂酶A₂水解反应促进剂和海藻糖的试剂及检测方法

<试剂>

1号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

10mmol/L氯化钠

5mmol/L N-正丁酰基-L-丝氨酸

2mmol/L乙二胺四乙酸

0.02％ProClin300

2号试剂

50mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH＝9.4

10mmol/L氯化钠

0.02％ProClin300

3号试剂

50mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH＝7.0

200mmol/L磷脂酶A₂特异性底物

2mmol/L海藻糖

0.02％ProClin300

试样:

1)Lp-PLA₂标准品(800U/L)

2)按1:2，1:4，1:8，1:16，1:32的比例将Lp-PLA₂标准品(800U/L)稀释

操作方法:

使用全自动生化仪(日立7170型全自动分析仪)进行测定。在进行检测前将2号试剂(47.5μL)和3号试剂(2.5μL)混合。将20μL试样加至1号试剂(180μL)中，于37℃下保温，检测主波长405nm，和副波长505nm下的吸光度变化。5分钟后添加2号试剂和3号试剂的混合液(50μL)，于37℃下保温3分钟，检测主波长405nm，和副波长505nm下的吸光度变化，通过利用Lp-PLA₂标准品(800U/L)作为校正物质，将测得的吸光度变化换算为测定值，结果列于表5。Lp-PLA₂活性的校正曲线如图2所示。由图2可知，使用本实施例中的含有磷脂酶A₂反应促进剂和海藻糖的试剂可以对Lp-PLA₂的活性进行定量检测。并且，将1号试剂和3号试剂以液体状态分别于37℃下保存7天，对其空白本底和试剂性能进行检测，均无异常变化。因此推测本实施例中的试剂可以液体状态在冷藏条件下稳定12个月以上。

表5

稀释比例	1	2	平均值	理论值	相对偏差	绝对偏差
							1	790.4	792.7	791.55	789.27	0.29％	2.28
0.5	390.1	389.2	389.65	391.97	-0.59％	-2.32
							0.25	191.4	187.5	189.45	193.32	-2.00％	-3.87
0.125	89.8	90.4	90.1	94.00	-4.14％	-3.90
							0.0625	48.7	46.1	47.4	44.33	6.92％	3.07
0.03125	25.6	22.9	24.25	19.50	24.35％	4.75

实施例7：检测试样中Lp-PLA₂的活性

选取36名受试者，使用实施例6的试剂和检测方法对试样进行测定，并与酶联免疫吸附法进行比较，结果列于表6，并根据该表数据制图3。从结果可知，该方法操作简便，所需检测时间不足10分钟，适合对大量试样进行大规模检测，与酶联免疫吸附法显示出良好的相关性，相关性达R²＝0.947。

[表6]

以上所述仅是本发明的优选实施方案，对于本技术邻域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出改进和调整，这些改进和调整也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种用于体外检测磷脂酶A₂的试剂盒，其特征是：至少含有1号试剂或3号试剂,所述1号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应促进剂，所述3号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应底物稳定剂；1号试剂中的磷脂酶A₂水解反应促进剂为N-烷基-L-丝氨酸或其盐或N-酰基-L-丝氨酸或其盐；3号试剂中的磷脂酶A₂水解反应底物的稳定剂为由2个葡萄糖单体形成的二糖类化合物。

2.如权利要求1所述的用于体外检测磷脂酶A₂的试剂盒，其特征是：还含有2号试剂，所述2号试剂中含有磷脂酶A₂水解反应底物的稀释液。