CN104099298A - 一种犬细小病毒乳胶检测试剂及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒乳胶检测试剂及检测方法和应用，将羧化乳胶20μL与200μL稀释度为1:1~8的单克隆抗体室温作用3-8h致敏后，得到一种犬细小病毒乳胶检测试剂，该试剂可与犬细小病毒特异性反应，重复性好，灵敏度高，乳胶诊断试剂的检测限为1.0×10⁴PFU，本发明的检测方法不需要任何特殊的仪器设备，有利于推广和普及，检测成本低的特点，操作简单，不需要由专业人员操作。本发明检测试剂保存期长，稳定性好，特别适于体外犬细小病毒的快速检测及其相关试剂盒的开发。

Description

一种犬细小病毒乳胶检测试剂及检测方法和应用

技术领域

本发明是属于临床宠物免疫学技术领域，涉及免疫学、化学等相关领域。具体涉及一种犬细小病毒乳胶检测试剂，还涉及一种犬细小病毒乳胶凝集检测的方法，还涉及一种犬细小病毒乳胶在体外检测犬细小病毒中的应用。

背景技术

犬细小病毒病是由犬细小病毒引起犬科动物的一种烈性传染病。临床分为出血性肠炎和非化脓性心肌炎两个类型。无论哪种类型的临床表现，都以发病率高、死亡率高和传染性强为特点，是危害养犬业的最为严重的传染病之一，给犬养殖业造成了严重的经济损失。近年来随着养犬数量的不断增多和养犬规模的不断扩大，致使犬细小病毒病日趋流行，加之该病发病急死亡率高，危害日渐严重。

1977年，美国学者Eugster和Nairn最先从患出血性肠炎的犬粪便中分离得到该病毒，其后，加拿大、澳大利亚、法国、日本等国均有报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎；1983年，徐汉坤等正式确认本病的流行。犬细小病毒的发现虽然只有30年的时间，但该病毒对犬的感染危害严重。

目前检测犬细小病原的方法主要有聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针技术、胶体金检测、酶联免疫吸附反应（ELISA）、血凝/血凝抑制试验（HA/HI）等。PCR具有高度的敏感性和特异性，但需要PCR仪和凝胶成像系统等价格昂贵的设备，虽然用煮沸的方法提取病毒DNA大大缩短了繁琐的苯酚—氯仿异戊醇提取DNA所耗费的时间，但反应结果也需要3h左右才能得到。HA/HI的灵敏性较低，试验需要新鲜健康的猪红细胞，需要3h才能读取结果，而且犬细小病毒也出现了没有血凝活性的变异株，造成试验结果的不准确。鉴于HA/HI与PCR和ELISA方法自身所限及目前我国宠物医疗的门诊条件，这几种方法都难以在宠物医疗门诊推广。乳胶凝集检测迅速，不需要特殊的仪器和专门的技能，具有很大的优势。目前临床上使用的主要是胶体金抗原检测试剂盒，但是价格比较昂贵，本发明旨在给宠物医院提供一种快速、简便、便宜的检测方法。

迄今为止，CPV只有一个抗原型，即CPV-2，但不同的毒株间抗原性有所差异，已出现了多个亚型。即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)。通过对各种犬细小病毒的核苷酸对比分析，他们之间的同源性高达98%以上。与流感病毒不同，这种病毒的变异，是通过病毒核苷酸的突变，而不是重组实现的。我国的CPV分离株也存在基因变异的现象，但是我国CPV分离株与参考株的核酸同源性超过98%，没有形成明显的中国CPV分支。本实验室制备的抗是CPV-2b亚型的单克隆抗体。

从上个世纪中叶聚苯乙烯乳胶颗粒开始做凝集试验的材料以来，由于具有独特的优点，如：操作简便，不需要特殊仪器，肉眼可断，也不需要对操作过程进行培训；时间短，一般在2分钟内可以出结果；价格低廉，检测单份血清样品比其他血清学、病原学方法便宜得多；适用于现场检测等，在临床上得到了广泛的应用。传统的乳胶凝集试验是以惰性聚苯乙烯乳胶颗粒作载体，吸附特定的抗原或抗体，当遇到相应的抗体或抗原成分时，会形成肉眼可见的凝集颗粒。在利用乳胶凝集技术建立病原学检测方法时，一般是将特异性抗体致敏到乳胶颗粒表面，普通聚苯乙烯乳胶和抗体的结合是无选择性的物理静电吸附，由于抗体的分子量小，很难结合到乳胶表面，即使致敏上的抗体也容易从乳胶颗粒上脱落或者变性失活，导致致敏好的乳胶试剂保存期短，难以适合产品开发的需要。为此，本申请人以带有羧基基团（-COOH）的羧化聚苯乙烯胶乳为载体，以双功能试剂水溶性碳化二亚胺（EDC）为介质，经化学反应将抗体（IgM）分子偶联到乳胶表面。本发明克服了普通乳胶致敏抗体时，致敏量少，不稳定，抗体容易脱落等缺点，提高了抗体的结合效率，而且致敏上的抗体不容易从乳胶上脱落，进而提高乳胶的敏感性和保质期，适合了产品开发和大规模生产的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种犬细小病毒乳胶检测试剂，由犬细小病毒单克隆抗体和乳胶组成。该试剂具有特异性强，灵敏度高，检测时间短的特点。

本发明还有一个目的在于提供了一种犬细小病毒乳胶凝集检测方法，该方法简单，易于操作，准确率高。

本发明还有一个目的在于提供了一种杂交瘤细胞株，能够分泌抗CPV的特异性的单克隆抗体。该细胞由骨髓瘤细胞SP2/0和犬细小病毒粒子免疫的小鼠脾细胞融合而得，该杂交瘤细胞株27D可以在含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5%CO2的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗犬细小病毒的单克隆抗体。该杂交瘤细胞株已于2013年4月3日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：杂交瘤细胞27D，保藏编号：CCTCC NO：C201344，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的在于提供了一种抗CPV-2b的单克隆抗体，能够特异性的识别CPV-2a、CPV-2b等CPV病毒。

本发明最后一个目的在于提供了一种犬细小病毒乳胶在体外检测犬细小病毒中的应用。为达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种犬细小病毒乳胶检测试剂，由犬细小病毒单克隆抗体和羧化乳胶组成。

所述的单克隆抗体，由杂交瘤细胞27D（CCTCC NO：C201344）分泌，然后通过辛酸一硫酸铵沉淀法获得纯化的单克隆抗体。

一种犬细小病毒乳胶检测试剂，其制备过程是：

取20μL羧化乳胶（购于sigma公司，货号CBL9）放入1.5EP管中；pH9.6,0.1M碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；再用pH4.7,0.01M的磷酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；然后加入100mM的EDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride）100μL重悬，20mM的NHS（N-hydroxysuccinimide）100μL混匀，室温（25℃±2℃））缓慢震摇4h；pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；加入200μL稀释度为1:1～8单克隆抗体室温作用3-8h致敏后，加入终止剂0.5M乙醇胺50μL终止反应，12000rpm，20min；用200μL贮存液（0.01M pH7.4的PBS配置，含0.1%BSA、5%甘油、0.1%NaN₃）重悬，4℃保存。

一种犬细小病毒的乳胶凝集检测方法，其步骤是：

（1）阳性对照：犬细小病毒CPV-2b。

（2）阴性对照：PBS溶液。

（3）与干净的载玻片上滴加10μLPBS，10μL阳性对照，10μL待检样品，各加10μL乳胶抗体复合物，搅拌均匀，摇动30S到2min内观察结果。

（4）结果判定：阳性样品与乳胶诊断试剂出现明显均匀一致的凝集，阴性样品与乳胶诊断试剂不出现凝集。待检样品出现均匀一致的凝集判为阳性，呈现原有的均匀乳状为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

直接检测犬细小病毒，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短的特点；

本发明的检测方法不需要任何特殊的仪器设备，有利于推广和普及，检测成本低的特点，操作简单，不需要由专业人员操作。本发明检测试剂保存期长，稳定性好。

附图说明

图1为一种本发明的总体技术路线示意图。

图2为一种是阴、阳性对照样品检测结果照片示意图。

-表示阴性样品，p表示阳性样品。

具体实施方式

实施例1：

一种抗CPV-2b的单克隆抗体，其制备过程是：

1.抗原制备

CPV（Genbank登录号KC881278）接种F81细胞（购于上海中科院细胞库），待80%细胞出现裂解脱落，-80℃冻融三次，4℃下，10000rpm离心30min，取上清，在低温下用PEG20000透析浓缩，待体积浓缩至原体积的1/3到1/4时为止，然后上下反复颠倒几次透析袋，用注射器收集于500ml的瓶中；根据收集的病毒浓缩液的体积，在浓缩液中加入氯化钠至终浓度为0.3M/L，加入PEG6000至终浓度为8%，4℃磁力搅拌器搅拌2.5h后，置4℃冰箱内沉淀过夜；次日，将浓缩的病毒液18000rpm水平转子离心2h，弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀，然后在蔗糖梯度从上到下依次为20%、30%、45%、65%下进行38000rpm离心18h；分层收集去蔗糖，每层加适量PBS，稀释混匀每层病毒液，18000rpm水平转子离心2h，倒出大部分上清，再加入适量的PBS混匀18000rpm离心2h，弃去上清，每层用适量的PBS重悬沉淀，然后每层分别分装于病毒冻存管中并进行标记，-80℃冰箱冻存。

2.抗原免疫

灭活纯化病毒粒子后，免疫6周龄Babl/c小鼠,首次基础免疫皮下注射抗原100μg/只,使用等量的完全弗氏佐剂混合；每隔2周进行一次免疫，共三次，皮下注射抗原100μg/只/次，使用不完全弗氏佐剂等量混合；融合前3天腹腔注射加强免疫,200μg/只,不加佐剂。

3.杂交瘤细胞的制备

a)饲养细胞的制备

空白小鼠1只，眼眶放血，收集阴性血清，75%酒精浸泡5min，小鼠固定，无菌取脾脏，加3ml基本1640研磨，补加基本1640至10ml，静置2min，吸上层与50ml离心管备用，再加基本1640至10ml，重复两次，1000rpm离心10min去上清，100mlHAT培养基重悬，37℃备用。

b)免疫脾细胞的制备

强化免疫小鼠，眼眶放血收集阳性血清，75%酒精浸泡5min，小鼠固定，无菌取脾脏，加3ml基本1640匀浆器中研磨，补加基本1640至10ml，静置2min，吸上层与50ml离心管中，再补加10ml的1640于匀浆器中，重复洗两次。

c)骨髓瘤细胞的制备

拉颈处死，75%酒精浸泡5min，小鼠固定，无菌取肿瘤，置匀浆器，加5ml基本1640研磨，补加基本1640至10ml，静置2min，吸上层与50ml离心管备用，再加基本1640至10ml，重复两次，1000rpm离心10min去上清，基本1640重悬骨髓瘤细胞，总体积达20ml，另一50ml离心管加20ml淋巴细胞分离液，将骨髓瘤细胞悬液轻轻地沿管壁加在分离液之上，1000rpm离心10min，吸位于界面致密的白色细胞层（可适当吸取上层培养基），补加适量基本1640，1000rpm离心10min，弃上清，加10ml基本1640重悬，计数后4℃备用。

d)细胞融合及HAT选择杂交瘤

骨髓瘤细胞（1-2×10⁷）与免疫细胞（1×10⁸）于50ml离心管混匀，1000rpm离心10min,倒空上清（灭菌滤纸吸干至沉淀处），轻敲管底，使细胞沉淀略加松动,37℃水浴中，1min内慢慢滴入预温至37度的50%PEG0.8ml，边加边用吸管搅拌，继续搅拌30s后静置1min，慢慢加入37℃预温的基础164040ml（提前装入离心管），具体方法如下（37℃水浴中完成）：第1min逐滴滴入1ml，第2min加1ml，第3-4min加3ml，第5min加5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻搅拌，最后缓慢加入基础1640，补足40ml，总时间为10min，1000rpm离心10min去上清，重悬有饲养细胞的HAT培养基重悬，分种于4块96孔板，37℃，5%CO2培养箱培养。

杂交瘤细胞融合两周后,用ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株已于2013年4月3日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：杂交瘤细胞27D，保藏编号：CCTCC NO：C201344地址：中国武汉武汉大学。

5.杂交瘤细胞的克隆与冻存

a)杂交瘤细胞的克隆

克隆化方案为有限稀释法，按照常规杂交瘤细胞克隆方法进行三轮克隆。

b)杂交瘤细胞的冻存

细胞冻存液：胎牛血清与二甲基亚砜体积比9:1。

将24孔板中扩大培养的细胞株，在细胞对数生长期时，收集细胞悬液，1000rpm离心10min，弃去细胞上清，用适量细胞冻存液重悬，混匀后分装于细胞冻存管中，1ml/管，依次4℃30min、-20℃2h、-80℃过夜，次日移入液氮罐中进行冻存。

6.单克隆抗体制备

本发明中,大量生产单克隆抗体的方案为小鼠腹水法。

具体方法为：将小鼠提前五天腹腔注射弗氏不完全佐剂500μl/只，然后将阳性细胞的上清收集于离心管中，细胞用1640基础培养基从孔壁上吹打下来，吸入15ml离心管中，1000rpm离心10min，然后再用1640基础液重悬，洗两次，最后用适量的1640基础液重悬，小鼠腹腔注射500μl/只。9至10天后，小鼠腹部明显变大，酒精棉在小鼠腹部消毒，用10ml注射器针头插入小鼠腹部，同时用15ml离心管收集从针头中自动流出的腹水。1500rpm离心10min，去除细胞，将上清收集于另一个15ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中。

7.单克隆抗体的纯化及鉴定

抗体的生物学特性的鉴定：

1）腹水效价和细胞培养上清效价的测定

用ELISA方法对腹水及细胞培养上清进行检测，杂交瘤细胞27D腹水效价均可达到2¹⁰×100，细胞上清均可达到2¹⁰。

2）亚类鉴定

用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚类鉴定试剂盒（Mouse Mab Isolating Test Kit）对本发明所得的单克隆抗体进行鉴定，所得的单克隆抗体经鉴定为IgM亚类。

3）染色体计数实验

在杂交瘤细胞传代培养48h后加入秋水仙素，使其最终浓度达到0.1μg/mL，继续培养2.5h～3h。终止培养后，将贴壁的杂交瘤细胞全部用吸管吹下，移入10mL的离心管，以1000rpm离心10min，弃去上清液。加入37℃预温的0.075mol/L的KCl低渗溶液5mL，用吸管吹打均匀，置37℃培养箱低渗处理20min。每管加入新鲜配制的固定液（甲醇:冰乙酸=3:1）2mL混匀，以1000rpm离心10min，去上清。再每管加固定液5mL，轻轻混匀，静置30min后，以1000rpm离心10min，弃上清。加0.5mL固定液混匀使细胞悬浮，用滴管吸取细胞悬液2滴，滴在洁净的载玻片上，立即吹散，自然干燥。用10%Giemsa染色液染色10min，用单蒸水洗去染液后自然干燥。最后于显微镜下观察。观察发现融合细胞的比融合前骨髓瘤细胞染色体数目发生增加。

4）.Western blot实验

用提取的CPV（Genbank登录号KC881278）犬细小病毒的病毒粒子上样对获得的单克隆抗体进行Western blot鉴定。结果显示本发明制备的腹水能够与病毒粒子发生反应。

上述获得的腹水单抗的纯化方案为辛酸一硫酸铵沉淀法。

具体步骤为：将收集的腹水12000rpm离心5分钟，取上清10ml；加入40ml的醋酸缓冲液；每10ml上述腹水加辛酸33ul，边加边搅拌（慢）；加完后继续搅拌30min，然后在4℃下12000rpm离心30min；上清用滤纸进行过滤，收集的上清调PH7.4；≤45%SAS沉淀一次，搅拌30min后4℃沉淀过夜；4℃下12000rpm离心30min，去上清，用10mM Tris（pH9.0）重悬沉淀，再用10mM Tris（pH9.0）透析3天，每天换一次透析液；吸出分装，1ml每管，-20℃保存，纯化后该抗体的浓度是6.70mg/mL。

实施例2：一种犬细小病毒乳胶检测试剂，其制备方法是：

取20μL羧化乳胶（购于sigma公司，货号CBL9）放入1.5EP管中；pH9.6,0.1M碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；再用pH4.7,0.01M的磷酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；然后加入100mM的EDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride）100μL重悬，20mM的NHS（N-hydroxysuccinimide）100μL混匀，室温（25℃±2℃）缓慢震摇4h；pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；加入200μL稀释度为1:1或1:2或1:4或1:8单克隆抗体室温作用3-8h致敏后，加入终止剂0.5M乙醇胺50μL终止反应，12000rpm，20min；用200μL贮存液（0.01M pH7.4的PBS配置，含0.1%BSA、5%甘油、0.1%NaN₃）重悬，4℃保存。

实施例3：

一种犬细小病毒的乳胶凝集检测方法，其步骤是：

（1）阳性对照：犬细小病毒CPV-2b（Genbank登录号KC881278）

（2）阴性对照：PBS溶液。

（3）与干净的载玻片上滴加10μLPBS，10μL阳性对照，10μL待检样品，各加10μL乳胶抗体复合物，搅拌均匀，摇动30S到2min内观察结果。

（4）结果判定：阳性样品与乳胶诊断试剂出现明显均匀一致的凝集，阴性样品与乳胶诊断试剂不出现凝集。待检样品出现均匀一致的凝集判为阳性，呈现原有的均匀乳状为阴性。

以下实施例均以本检测方法为基础。

实施例4：最佳偶联抗体量的确定

在乳胶溶液（20μL）中加入200μL不同稀释度的实施例1中所制得的抗体（倍比稀释1:1,1:2，1:4,1:8,1:16,1:32,1:64）室温作用4h。用致敏好的乳胶抗体复合物检测犬细小病毒（毒价为1.025×10⁵PFU/mL）。经试验验证，稀释度为1:16,1:32,1:64的抗体致敏的乳胶发生自凝，稀释度为1:1,1:2，1:4，1:8的抗体致敏乳胶，检测灵敏度都较高，考虑到节约成本，选择了抗体稀释度为1：8作为最佳偶联抗体量(最佳偶联抗体浓度为0.84mg/mL)，以下实施例均以此偶联量为基础。具体结果见表1。

表1最佳偶联抗体量的确定

注：“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚集于液滴边缘，液体完全透明；

“+++”约75%乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；

“++”约50%乳胶凝集，液体较混浊；

“+”有少许凝集，液体呈浑浊；

“-”液滴呈原有的均匀乳状，并没有凝集。

实施例5：最佳偶联时间的确定

在乳胶溶液中加入200μL稀释好的单克隆抗体（稀释度是1:8），在室温下作用不同的时间（3h,4h,5h,6h,7h,8h），作用完后检测犬细小病毒。经试验证明发现乳胶不同致敏时间都不发生自凝现象，最佳致敏时间为3-4h。具体结果见表2。

表2最佳致敏时间

实施例6：犬细小病毒乳胶凝集检测试剂的敏感性和特异性

1）敏感性试验

将犬细小病毒液作倍比稀释，分别用致敏好的乳胶诊断试剂检测，结果表明发现可检测到1:8稀释度的病毒液，达到较好的敏感性。表明该乳胶诊断试剂的检测限为1.0×10⁴PFU，检测结果见表3。

表3敏感性试验

2）特异性试验

致敏好的乳胶抗体诊断试剂与犬细小病毒CPV-2b反应呈阳性，与其他病毒如：猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病毒（PRV）、犬传染性肝炎病毒（ICHV）、犬瘟热病毒（CDV）、狂犬病毒（RV）、PBS阴性对照都不反应，达到了较好的特异性。同时能与犬细小病毒2a亚型（CPV-2a）发生反应，因为CPV-2a与CPV-2b抗原同源性很高。结果见表4。

表4特异性试验

实施例7：

犬细小病毒凝集检测试剂的重复性试验。

1）.批内重复性试验

制备3批犬细小病毒乳胶凝集检测乳胶，每批8个，在每批样品中随机抽取3个进行阳性对照、阴性对照、ICHV、CDV进行检测，观察其敏感性、特异性、稳定性。结果表明其特异性、敏感性、稳定性没有变化，说明LAT方法的批内重复性良好。结果见表5、6、7。

表5批内重复试验（试剂批号0228）

表6批内重复试验（试剂批号0307）

表7批内重复试验（试剂批号0312）

2.批间重复性试验

在不同时间制备的3批乳胶凝集检测试剂对同一份阴性样品、阳性样品、CDV、ICHV进行检测，观察其敏感性、特异性、稳定性。结果表明，其敏感性、特异性和稳定性没有变化，说明本LAT方法的批间重复性良好。检测结果见表8。

表8批间重复性试验

实施例8：犬细小病毒乳胶凝集检测试剂的保存期试验

将3个不同批次的犬细小病毒乳胶检测试剂于37℃下作用3天，与保存在4℃的同批试剂同时进行标准阴性、阳性检测。结果表明高温（37℃下作用3天）对试剂的破坏作用不足于破坏其稳定性，见表9。

表9高温（37℃下作用3天）对试剂的破坏作用

实施例9：犬细小病毒乳胶凝集检测与犬细小胶体金快速诊断试纸条和PCR检测方法的比较

对临床采集的样品F0代（没有接种细胞）进行检测，检测了57份F0代样品，临床上用胶体金检测的病料拿回来后直接做的检测，结果见表10，两种检测方法检测都是阳性的有48份，两种方法都检测为阴性的为4份。乳胶试剂和胶体金试剂比较，总符合率为91.23%。；采集的临床病料样品，经接种细胞扩大收毒后提取病毒DNA模板，进行PCR扩增，经测序鉴定的病料进行乳胶凝集检测、胶体金检测，共检测F1代样品91份，F1代表示临床上用胶体金检测阳性的病料获得后进行处理接种F81细胞后获得的培养物，结果见表11。

说明书

表11乳胶凝集检测方法与胶体金、PCR对样品F1代检测结果得比较

Claims (7)

1.一种杂交瘤细胞，其特征在于：杂交瘤细胞27D， CCTCC NO：C201344。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞分泌的抗体。

3.一种犬细小病毒乳胶检测试剂，其制备过程是：

取20μL羧化乳胶放入1.5EP管中；pH9.6, 0.1M碳酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；再用pH4.7,0.01M的磷酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；然后加入100mM的EDC100μL重悬，20mM的NHS100μL混匀， 23~27℃缓慢震摇4h；pH8.0，0.01M硼酸盐缓冲液洗3遍，12000rpm，20min；加入200μL稀释度为1:1~8的单克隆抗体室温作用3-8h致敏后，加入终止剂0.5M乙醇胺50μL终止反应，12000rpm，20min；用200μL贮存液重悬，4℃保存；

所述的抗体为杂交瘤细胞27D分泌获得，CCTCC NO：C201344；

所述贮存液由0.01M pH 7.4的PBS配置，含0.1%BSA、5%甘油、0.1%NaN₃。

4.根据权利要求3所述的检测试剂，其在制备过程中致敏时间为3-4小时。

5.根据权利要求3所述的检测试剂，其在制备过程中单克隆抗体的稀释度为1:8。

6.权利要求3所述的犬细小病毒乳胶检测试剂在体外检测犬细小病毒中的应用。

7.权利要求3所述的犬细小病毒乳胶检测试剂在制备犬细小病毒检测试剂盒中的应用。