CN104087608A

CN104087608A - 一种重组人cytl1蛋白的表达方法和用途

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Publication number: CN104087608A
Application number: CN201410317157.7A
Authority: CN
Inventors: 杨小红; 李斯明; 崔树良; 梁伟国
Original assignee: GUANGZHOU CITY RED CROSS HOSPITAL
Current assignee: GUANGZHOU CITY RED CROSS HOSPITAL
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2014-10-08

Abstract

本发明公开了一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，所述方法为将SEQ ID:NO.1进行原核表达。本发明首次采用基因重组技术进行规模制备CYTL1蛋白，表达的重组人类源类细胞介素1-CYTL1蛋白为可溶性蛋白，并且证明了该重组蛋白能够促进软骨细胞的增殖。

Description

一种重组人CYTL1蛋白的表达方法和用途

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的表达方法，具体涉及一种重组人CTYL1蛋白的表达方法和用途。

背景技术

关节软骨是一种独特的结缔组织，由软骨细胞和软骨基质组成，软骨损伤的修复依赖软骨细胞分泌来完成。由于软骨组织内无血管，软骨细胞被嵌入由Ⅱ型胶原和蛋白多糖组成的致密的固体基质中，无法移动到缺损部位，因此，即使是很小的缺损也难以自行修复。关节软骨损伤在临床上较常见，目前对其治疗分为预防和对症治疗两种，有症状的病人可用药物和手术治疗进行干预，但这些手段并不能从根本上阻止病情的发展，因此人们一直在积极寻找更有效的治疗与预防措施。

细胞因子是由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生，能调节刺激细胞分化增殖和诱导细胞发挥功能，是高活性多功能的多肽、蛋白质或糖蛋白，对机体抗御疾病、维持生理功能及促进组织器官的修复与再生等方面具有重要意义。自从1957年世界上第一种高效干扰病毒繁殖的细胞因子-干扰素被发现以后，细胞因子以其高度生物学活性、高特异性作用等优点受到医学及生物学领域的高度重视，至今相继发现了几十种生长因子并应用于临床，获得了良好的防治效果。

在软骨修复研究领域中，主要应用的细胞因子包括骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、软骨调节素(ChM)等。目前，该种类细胞因子作用复杂，并具有多重调节作用，在促进软骨组织修复的同时，也容易做成其他组织的增生(如纤维组织)，导致新生软骨组织骨化或纤维化，影响再生组织的生物学功能。此外，商品化的外源性细胞因子多依赖国外进口，价格十分昂贵。

在鼠的动物模型研究中发现了一种新型的生长因子-类细胞介素1(Cytokine-like1,CYTL1)对软骨的生成具有独特的调控作用，主要在软骨细胞和软骨组织中表达，在骨髓间充质干细胞中(Mesenchymal Stem Cells,MSC)表达量很低，能诱导MSC向软骨细胞方向转化，在软骨形成后CYTL1含量明显增加(Kim JS等，J Biol Chem.2007)。CYTL1通过刺激Sox9转录活性来增加软骨生成；并能提高胰岛素样生长因子的表达，进一步促进软骨组织再生。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，还提供了采用该方法表达的重组人CYTL1蛋白以及所述重组人CYTL1蛋白的用途。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，所述方法为将SEQ ID:NO.1进行原核表达。SEQ ID:NO.1为人CYTL1蛋白CDS中去除信号肽序列后剩余的DNA序列，SEQ ID:NO.1如下：

ACTCCCCCGACCTGCTACTCCCGCATGCGGGCCCTGAGCCAGGAGATCACCCGCGACTTCAACCTCCTGCAGGTCTCGGAGCCCTCGGAGCCATGTGTGAGATACCTGCCCAGGCTGTACCTGGACATACACAATTACTGTGTGCTGGACAAGCTGCGGGACTTTGTGGCCTCGCCCCCGTGTTGGAAAGTGGCCCAGGTAGATTCCTTGAAGGACAAAGCACGGAAGCTGTACACCATCATGAACTCGTTCTGCAGGAGAGATTTGGTATTCCTGTTGGATGACTGCAATGCCTTGGAATACCCAATCCCAGTGACTACGGTCCTGCCAGATCGTCAGCGCTAG。

其对应的氨基酸序列如下：

TPPTCYSRMRALSQEITRDFNLLQVSEPSEPCVRYLPRLYLDIHNYCVLDKLRDFVASPPCWKVAQVDSLKDKARKLYTIMNSFCRRDLVFLLDDCNALEYPIPVTTVLPDRQR

优选地，所述原核表达中PCR扩增引物是：

正向引物：5’-GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3’；

反向引物：5’-TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3’。

优选地，所述原核表达中选用的双酶切位点分别为Xmn I和EcoR I酶切位点。

优选地，所述原核表达中原核表达载体为pFL-B13cl。

优选地，所述原核表达中宿主菌为E.coli BL21(Gold)(DE3)。

优选地，所述原核表达中采用IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0.05～0.1mM，培养温度为37℃。

优选地，所述原核表达中采用镍亲和层析法纯化重组人CYTL1蛋白。

优选地，所述镍亲和层析中洗脱缓冲液含250mM咪唑。

本发明还提供了一种重组人CYTL1蛋白，所述重组人CYTL1蛋白采用上述所述方法表达而得。

本发明还提供了上述所述重组人CYTL1蛋白在制备促进软骨细胞增殖药物中的用途。

本发明的有益效果在于：本发明首次采用基因重组技术进行规模制备CYTL1蛋白，表达的重组人类源类细胞介素1-CYTL1蛋白为可溶性蛋白，并且证明了该重组蛋白能够促进软骨细胞的增殖。

附图说明

图1为本发明所述人软骨细胞CYTL1蛋白cDNA的PCR扩增产物的电泳图；

图2为本发明所述PFL-B13cl载体双酶切后的电泳图，1为酶切前，2为酶切后；

图3为双酶切后的载体与目的片段的连接示意图；

图4为本发明所述转化子菌落PCR的电泳图；

图5为本发明所述阳性转化子PCR鉴定图，1为CYTL1特异性引物扩增，2为B13通用引物扩增；

图6为本发明所述重组pFL-B13cl-CYTL1成熟蛋白原核表达的蛋白电泳图；

图7为本发明所述重组人CYTL1蛋白质纯化后的蛋白电泳图；

图8为本发明所述重组人CYTL1蛋白在不同浓度下促进人软骨细胞增殖的柱状图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，具体步骤如下：

1、人软骨细胞CYTL1蛋白cDNA的制备

1.1RNA抽提：将人软骨细胞系C28112细胞充分震荡混匀至细胞完全裂解，室温放置10分钟左右后，每1ml TRIzol中加入氯仿为200μl，盖上盖子，剧烈振荡约1分钟，室温静置2～5分钟，然后12000g制冷离心15分钟(6℃)，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA样品。

1.2RNA沉淀：小心吸取上清液约450μl(每1ml TRIzol的吸取量)至含有600μl冷冻异丙醇的新RNase Free的离心管中，混匀，-20℃放置约10分钟，12000g冷冻离心10分钟(6℃)。去上清，再加入冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后12000g冷冻离心5分钟(6℃)，弃上清，风干约5～10分钟以后再加入DEPC水制成RNA样品(浓度调整到1μg/ml)，可-80度保存。质量以琼脂糖凝胶电泳观察来确认。

1.3反转录(RT)制备cDNA样品：用下列组份配制RT反应液(所有反应都在冰上进行操作)。

在预冷的RNase Free的PCR反应管内加入以下试剂进行RT反应

混匀反应混合物，短暂离心后37℃孵育30分钟。反应结束后，85℃灭活处理5分钟,对所得到的cDNA用无菌水稀释5倍后得到人软骨细胞CYTL1蛋白cDNA样品，用于分子克隆，并可-20℃保存。制备的cDNA全长共1038个碱基，对应的GenBank登陆号为BC031391.1。

2、构建重组载体pFL-B13cl-CYTL1，转化入2T1感受态细菌(货号U0104A)，挑选单克隆菌落，筛选可靠的阳性克隆菌株予以限制性内切酶切及测序确认，pFL-B13cl和2T1感受态细胞均为美国GeneCopoeia(复能基因)公司产品。

2.1PCR扩增

引物：

正向引物:5’-GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3’

反向引物:5'-TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3'

配制以下反应体系：(同时做5个重复)

PCR运行程序：98℃3min、(98℃30sec、52℃30sec、72℃20sec)*25cycles、72℃5min、16℃保温。结果：取5μl，2％琼脂糖凝胶电泳，扩增片段位于300～400bp之间，与目标片段分子量相符，如图1。

2.2PCR产物纯化

PCR产物共100μl，加入1/10NaAC及2倍体积预冷无水乙醇，-20℃放置30min，12000rpm离心10min，去上清。加入500μl75％乙醇清洗沉淀，12000rpm离心5min，去上清。重复清洗步骤1次，彻底去除上清，沉淀室温风干后加入20μl ddH₂O溶解。

2.3PCR产物酶切及酶切后胶回收纯化

配置以下酶切体系：

37℃酶切4h，65℃处理20min灭活。酶切后产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带，用OMIGA PCR产物胶回收试剂盒回收酶切后片段，最后加入30μl ddH₂O溶解。

2.4PFL-B13cl载体酶切及酶切后胶回收纯化

配制以下酶切体系：

37℃酶切4h，65℃处理20min灭活。酶切后取2μl用1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2。

2.5载体与片段连接并转化感受态细菌

配制以下连接反应体系：

室温连接4h，取5μl转化2T1感受态细菌，涂布Amp+抗性平板，37℃培养过夜，连接示意图如图3所示。

3、原核表达载体pFL-B13cl-CYTL1转化、筛选阳性克隆进行重组子真实性鉴定，并进行测序确认其编码蛋白质为成熟蛋白。

3.1转化子菌落PCR筛选

PCR引物：选用B13载体引物进行菌落PCR反应，以空载体为模板PCR产物片段长度约为200bp。

配制以下反应体系：

用枪头挑取少量菌体，在反应体系中混匀，按以下程序进行PCR反应95℃5min、(95℃30sec、52℃30sec、72℃20sec)*30cycles、72℃5min、16℃保温。反应产物取8μl电泳。结果：共挑取7个单菌落进行检测，其中1～5^#、7^#菌落PCR扩增出200bp长片段，为自连的空载体，6^#PCR产物约500～600bp，为阳性克隆，如图4。

3.2阳性转化子提取质粒、PCR检测：

挑取6#阳性转化子接种5ml LB(Amp+)，37℃培养过夜。次日收集菌体，用OMEGA质粒小提试剂盒提取质粒。以提取后质粒为模板，用B13载体特异引物和CYTL1(67～411)特异引物进行PCR扩增。

配制以下反应体系：

95℃5min、(95℃30sec、52℃30sec、72℃20sec)*30cycles、72℃5min、16℃保温。

结果：如图5，特异引物扩增产物位于300～400bp之间，B13载体引物扩增产物位于500～600bp之间，符合预期。将此质粒送测序，测序结果正确。所述重组蛋白含载体序列编码His-Sumo标签，表达后蛋白序列为His-SUMO-CYTL1(67～411)，分子量约为30kDa，重组蛋白氨基酸序列如下:

MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGTPPTCYSRMRALSQEITRDFNLLQVSEPSEPCVRYLPRLYLDIHNYCVLDKLRDFVASPPCWKVAQVDSLKDKARKLYTIMNSFCRRDLVFLLDDCNALEYPIPVTTVLPDRQR。

4、重组pFL-B13cl-CYTL1成熟蛋白原核表达中可溶性条件的确定：

分别含pFL-B13cl-CYTL1重组质粒和pFL-B13空载体对照质粒的细菌培养液在利用不同诱导剂浓度做表达，细胞破碎处理后高速离心，分别将上清和沉淀物进行电泳分析，确定CYTL1可溶性表达的诱导条件如下：

4.1转化BL21(Gold)(DE3)表达菌株，涂布于Amp+LB平板中，37℃培养过夜，BL21(Gold)(DE3)(Cat#230246)为美国Agilent Technologies公司产品。

4.2挑取单个菌落，接种3ml Amp+LB试管，37℃培养过夜。

4.3第二天，取100μl过夜菌，加入5毫升Amp+LB试管，37℃培养3-4小时。

4.4分别加入终浓度为0(对照组)、0.05、0.1和0.2mM的IPTG诱导剂。

4.537℃培养5小时，每管取100μl，离心12000rpm，1min，弃上清。

4.6沉淀物中加个15μl上样液缓冲液，100℃加热5分钟溶解。

4.7样品与上样液缓冲液以1:1混匀，取10μl点样12％SDS-PAGE胶，用蛋白质分子量标准品作对照(Marker,Bio-rad Dual Color Standards)电泳160V约50分钟，当溴酚蓝达到底部为止。

4.8结果显示0.05mM的IPTG诱导剂量最合适，如图6。

5、重组蛋白的大量表达亲和层析纯化。

采用优化的可溶性表达条件，对pFL-B13cl-CYTL1重组质粒进行大量培养表达。离心收集菌体进行破碎处理后再高速离心，并收集上清液，利用重组人CYTL1蛋白质及携带的His标签，以镍柱亲和层析对重组人CYTL1蛋白进行纯化，取得95％以上纯度的成熟CYTL1融合蛋白：

5.1Buffer A(STE buffer,5mM咪唑)，3CV(3倍柱体积)平衡柱子。

5.2蛋白过柱(穿透蛋白1)。

5.3Buffer B(STE buffer,10mM咪唑)，3CV洗涤柱子(洗涤蛋白2)。

5.4Buffer C(STE buffer,30mM咪唑)，3CV洗涤柱子(洗涤蛋白3)。

5.5Buffer D(STE buffer,250mM咪唑)，3CV洗涤柱子(保留蛋白4)。

5.6保留蛋白4中取得95％以上纯度的成熟CYTL1融合蛋白。

表达纯化的成熟CYTL1融合蛋白用于促进软骨细胞生长，以利受损伤的软骨组织的修复。

6、重组人CYTL1蛋白质纯度的鉴定

6.1取5.5的保留蛋白4，与上样缓冲液以1:1混匀后95℃加热5min，用10μl点样12％SDS-PAGE胶，同时用蛋白质分子量标准品作对照(Marker,Bio-rad Dual Color Standards)。

6.2160V约50分钟，当溴酚蓝达到底部为止.

6.3电泳凝胶用考马斯亮蓝染色，脱色后，拍照保存，在30kDa附近显示得到重组人CYTL1纯化蛋白质条带，如图7。

实施例2

MTS法测定重组人CYTL1促进人软骨细胞增殖的活性

(1)用人软骨细胞系C28112接种于96孔板中，细胞数量5×10³个/mL，每孔200μl。

(2)实验组中分别加入重组人CYTL1蛋白，加入量分别为4000、2000、1000、500、250及125(ng/ml)；并加入等量的重组人CYTL1蛋白层析用的PBS溶液替代重组人CYTL1蛋白作对照。

(3)加入含有2％胎牛血清的DMEM-F12培养液，于37℃、5％的CO²培养箱中培养一天。

用MTS法(操作按说明书进行)，在多模式检测系统490nm处读取吸光度值(OD值)，以OD值代表细胞的生长活性，如图8，浓度为1000ng/ml的重组人CYTL1蛋白活性最强。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述方法为将SEQID:NO.1进行原核表达。

2.根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中PCR扩增引物是：

正向引物：5’-GAAAAGCTTCACACTCCCCCGACCTGCTACT-3’；

反向引物：5’-TATAGAATTCCTAGCGCTGACGATC-3’。

3.根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中选用的双酶切位点分别为Xmn I和EcoR I酶切位点。

4.根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中原核表达载体为pFL-B13cl。

5.根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中宿主菌为E.coli BL21(Gold)(DE3)。

6.根据权利要求1所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中采用IPTG诱导表达，IPTG终浓度为0.05～0.1mM，培养温度为37℃。

7.根据权利要求4所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述原核表达中采用镍亲和层析法纯化重组人CYTL1蛋白。

8.根据权利要求7所述的重组人CYTL1蛋白的表达方法，其特征在于，所述镍亲和层析中洗脱缓冲液含250mM咪唑。

9.一种采用如权利要求1-8任一方法表达的重组人CYTL1蛋白。

10.一种如权利要求9所述的重组人CYTL1蛋白在制备促进软骨细胞增殖药物中的用途。