CN104072524A - 水溶性双核铜配合物与制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水溶性双核铜配合物与制备方法及其应用。化学式为[CuL(NO₃)₂]₂·CH₃CH₂OH。其中L为二(2-喹啉甲基)苄胺。X单晶衍射数据显示配合物(1)属于三斜晶系，空间点群为P-1，晶胞参数为 α＝77.437(10)°，β＝78.198(10)°，γ＝85.112(9)°。将等摩尔的配体二(2-喹啉甲基)苄胺和等摩尔的硝酸铜搅拌反应3-5小时后，过滤，滤液放置得到蓝绿色晶体产物。本发明配合物与CT-DNA(小牛胸腺DNA)存在较强的键合作用，而且作用方式为部分插入作用。并且能够在不加氧化还原剂的条件下，通过自氧化切割模式断裂pBR322质粒DNA。此外，配合物能够通过静态淬灭的方式引起BSA的内源性荧光淬灭。本发明制备方法简单，可靠。

Description

水溶性双核铜配合物与制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种双核水溶性铜配合物的合成、表征及其应用，具体为水溶性双核铜配合物与制备方法及其应用。

研究背景

DNA的有效断裂在疾病治疗、新药研发及诊断方式的发展等方面起关键作用，因此研究者对于设计合成生理条件下催化断裂DNA的小分子化合物产生了的极大兴趣。金属离子是天然核酸酶的活性中心，此外过渡金属化合物被广泛用作研究一些生物大分子的探针，因此化学工作者致力于设计合成具有生物活性的过渡金属配合物。其中，顺铂，卡铂等铂类抗肿瘤药物已经被广泛用于临床医学，近年来一些钌的化合物也陆续进入临床实验。但是，由于铂类药物毒副作用高，而且容易产生抗药性和对其他周围正常组织损伤等限制了其应用。所以开发低毒，水溶性好的新型药物显得尤为迫切。

以人体本身存在的微量元素作为金属中心的配合物，可能对身体正常细胞具有较低的毒性，而且其水溶性也较好。铜是人体必须的微量元素，作为生物体内一些结构和催化中心的辅助因子参与体内多个生物反应过程。近年来，许多铜的化合物被设计合成，而且表现出了较好的DNA切割能力和抗肿瘤活性。最近，Carlo Santini等详细介绍了铜化合物作为抗癌药物的新进展。

铜配合物切割DNA的主要方式可分为氧化性断裂和水解性断裂，水解性断裂是生物体内降解核酸所采取的模式，而氧化性断裂常需要在体系中加入额外的辅助试剂或用一定频率的光照射，生成羟基自由基或单线态氧等活性物种，以氧化还原反应机理断裂核酸。无论机理如何，这些化学合成的选择性切割DNA的化学核酸酶可以通过改变配体或金属的种类、结构、大小等来调节它们对DNA的相互识别，因而可能具有高度的底物专一性。因此，探讨化学结构与化学核酸酶活性的关系，寻求和合成高效的、具有专一性的小分子化学核酸酶仍是生物无机化学研究中十分活跃的研究领域。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶性双核铜配合物与制备方法及其应用。本发明采用常规的溶液合成法即可得到目标产物，目标产物表现出较好的DNA键合能力。本发明表现出了自氧化切割DNA的能力，从而避免了外加氧化还原剂对身体的伤害；目标产物还表现出了较好的BSA键合能力，从而为产物作为药物较好的在体内运输提供了一定依据。本发明制备方法简单，可靠。

本发明提供的双核铜配合物的化学式为[CuL(NO₃)₂]₂·CH₃CH₂OH，其中L为二(2-喹啉甲基)苄胺。

本发明提供的双核铜配合物属于三斜晶系，空间点群为P-1，晶胞参数为 α＝77.437(10)°，β＝78.198(10)°，γ＝85.112(9)°，单胞体积为

本发明提供的所述铜配合物的结构可描述如下：在配合物的一个最小非对称基本单元中包含两个独立的单核铜单元和一个乙醇分子。每一个单核单元由一个与中心铜离子配位的三齿氮配体，及两个硝酸根离子构成。其中每一个硝酸根离子都是其中一个氧原子与中心铜离子配位，配位模式为η-NO₃ ^-。根据addison-reedijk几何学标准，两个独立单元中铜离子τ值分别为Cu1(0.30)，Cu2(0.18)，这说明两个铜离子均处于五配位的畸变四方锥构型。其中配体L的三个N原子和硝酸根的一个O原子占据赤道平面位置，另外一个硝酸根的O原子占据轴向位置。

本发明提供的双核铜配合物的制备方法包括如下步骤：

将等摩尔配体L溶于无水乙醇中，加入等摩尔的硝酸铜的水溶液，搅拌3-5小时后，过滤，将滤液放置缓慢挥发20天后，得到蓝绿色晶体即为产物。所述的硝酸铜与配体二(2-喹啉甲基)苄胺的摩尔比为1∶1。

本发明提供的双核铜配合物的应用是用于制备抗癌药物。

电子吸收光谱实验和荧光淬灭实验证实所述配合物与CT-DNA之间有中等键合的插入作用。

琼脂糖凝胶电泳实验证明，配合物在不加氧化还原剂的生理条件下，对质粒DNA表现出明显的切割作用，通过引入自由基清除剂的切割机理实验表明配合物能够通过自氧化途径断裂质粒DNA，而且主要的活性物种为羟基自由基。

荧光淬灭滴定实验证实配合物能够有效地与BSA白蛋白结合，并且能够通过静态淬灭方式引起BSA内源性荧光淬灭。

总之，本发明制备步骤简短，常温搅拌、自然挥发条件下即可得到目标产物，不需过多外界辅助如加热回流、水热合成等。目标产物具有良好的水溶性，从而为进一步性质测试及临床试验提供一个良好的开端。产物与CT-DNA存在较强的键合作用。产物能够通过自氧化途径诱导双螺旋DNA的有效断裂，避免了外加条件(氧化还原剂，光照)对身体产生的伤害。此外，化合物还能够有效地与BSA键合，为化合物作为潜在药物在体内有效运输提供了有价值的信息。具体地将讲，运用多种光谱方法证实配合物与CT-DNA(小牛胸腺DNA)存在较强的键合作用，而且作用方式为部分插入作用。琼脂糖凝胶电泳实验表明：配合物能够在不加氧化还原剂的条件下，通过自氧化切割模式断裂pBR322质粒DNA。此外，运用荧光光谱法探讨了配合物与BSA(牛血清白蛋白)的相互作用，结果显示配合物能够通过静态淬灭的方式引起BSA的内源性荧光淬灭。

附图说明

图1：本发明双核铜配合物的单元结构图。

图2：加入不同量的CT-DNA后，双核铜化合物的电子吸收光谱变化示意图。

图3：本发明双核铜配合物与EB竞争的荧光淬灭实验结果。

图4：生理条件下，本发明双核铜配合物对pBR322DNA的浓度依赖切割实验结果。

图5：生理条件下，本发明双核铜配合物对pBR322DNA的机理切割实验结果。

图6：加入不同量配合物后，本发明双核铜配合物与BSA的荧光淬灭实验结果。

具体实施方式

实施例

铜配合物的合成：

将0.1mmol的配体L溶于10ml乙醇溶液中，然后加入0.2mmol三乙胺溶液和0.1mmol的硝酸铜5ml水溶液。常温搅拌3h，过滤，溶液为浅蓝绿色澄清溶液，缓慢挥发溶剂，数周后，析出适合X射线分析的绿色针状晶体。产率大约：45％，元素分析结果(％)，实验值：C，56.23％；H，4.25％；N，11.73％；理论值(C₅₆H₅₂Cu₂N₁₀O₁₃)：C，56.04％；H，4.37％；N，11.67％。实验值与理论值基本一致。实施加入不同量的CT-DNA，观察配合物(1)的电子吸收光谱变化试验：

实验过程：

在室温下，向样品池和参比池中各加2.0mL缓冲溶液(缓冲溶液用三蒸水配制，含50mM NaCl和5mM Tris，用盐酸调至pH＝7.2)，然后向样品池加入一定量体积的配合物溶液并向参比池中补加相应等体积的缓冲溶液。用微量进样器向样品池和参比池中加入一定量相同体积的CT-DNA储备液，使CT-DNA与配合物的浓度比值不断增加，观察配合物吸收峰的变化并将数据保存以便拟合处理。

实验结果：

配合物(1)在306nm处有强的紫外吸收，如图2所示，随着CT-DNA的逐渐等量加入，配合物的最大紫外吸收强度出现明显的下降，即出现了明显的“减色效应”，表明配合物与DNA发生了插入作用。为了定量比较化合物与DNA结合的强弱，根据加入DNA前后配合物吸收光谱变化(图2中的嵌入图)，按方程式(ε_b-ε_f)/(ε_b-ε_f)＝(b-(b²-2K_b ²C[DNA]/S^1/2)/2K_bC(1)和b＝1+K_bC+K_b[DNA]]/2s(2)计算了配合物与DNA的结合常数K_b和插入配合物之间碱基对数量s值，式中[DNA]表示DNA的浓度，C为配合物浓度，而ε_a，ε_b和ε_f分别表示表示当前配合物浓度下的摩尔吸光系数，完全结合后的配合物的摩尔吸光系数和自由配合物的摩尔吸光系数。以(ε_a-ε_f)/(ε_b-ε_f)对[DNA]作图，拟合得到结合常数K_b值为2.11×10⁵M^-1，键合数大小s为0.26，表明配合物(1)与DNA为中等强度键合。

实施加入不同量的配合物(1)，观察EB-DNA的荧光淬灭试验：

铜配合物本身不产生荧光，所以不能采用直接荧光光谱法研究配合物与DNA的相互作用。故我们采用配合物淬灭EB-DNA结合物的荧光，通过研究EB-DNA结合物荧光强度的变化来间接测定配合物与DNA的结合程度。

实验过程：

配制CT-DNA和EB的混合溶液，其含量分别为2.4×10^-6M EB和4.8×10^-5MCT-DNA，储备于4℃冰箱中。配合物配制成10^-3M储备液。淬灭滴定实验时，向样品池中加入2.0mL储备的EB-DNA混合液，观察其荧光强度，然后用微量进样器每次向样品池中加入等体积的配合物储备液，观察发射光谱的变化并将数据保存以便拟合处理。

实验结果：

配合物(1)淬灭EB-DNA的荧光光谱如图3所示，在加入配合物(1)后，EB-DNA的荧光强度出现明显的降低，并且随着配合物浓度的增加，其荧光强度逐渐降低，表明配合物(1)与CT-DNA的竞争结合取代了EB。根据经典的荧光淬灭理论Stern-Volmer方程式，I₀/I＝1+K[Q]，以加入配合物前后EB-DNA的荧光强度比值(I₀/I)为纵坐标，配合物的浓度为横坐标，做出了Stern-Volmer图(图3中的嵌入图)，对测试数据进行拟合，得到较好的线性关系。根据方程K_EB[EB]＝K_app[complex]，K_EB＝1.0×10⁷M^-1([EB]＝2.38μM)，计算出配合物的表观键合常数K_app为3.09×10⁵M^-1，小于经典键合常数10⁷M^-1。说明配合物与DNA之间为中等键合作用。

实施近生理条件下，铜配合物对pBR322DNA的切割实验：

为了检测配合物(1)的核酸酶活性，我们采用琼脂糖凝胶电泳法对配合物进行DNA切割实验研究。

在不加氧化还原剂的条件下，探测配合物的浓度依赖切割实验。

实验过程：

配合物在近生理条件环境下(pH＝7.2，37℃)，加入pBR322DNA，再将梯度浓度铜化合物与200ng pBR322DNA混合，3h后加loading buffer并进行电泳实验，铜化合物浓度梯度数据如下：5μM，20μM，35μM，50μM，65μM。

实验结果：

如图4所示，配合物(1)在近生理条件下(pH＝7.2，37℃)，实验表明在近生理条件下铜配合物表现出明显DNA切割活性。当配合物浓度为20μM，有50％的质粒DNA断裂为单链DNA。

由于实验是在未采用外界诱导条件(光照、氧化还原剂)下进行，说明铜合物切割机理可能是水解或者自氧化切割作用，因此我们通过加入一些自由基清除剂来进一步确定配合物切割DNA的机理。

实验过程：

配合物在近生理条件环境下(pH＝7.2，37℃)，加入pBR322DNA，保持铜化合物浓度为50μM与200ng pBR322DNA混合，泳道0为DNA对照，1为DNA加配合物；泳道2-8为DNA加入配合物，然后再加入碘化钾，L-组氨酸，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(catalase)，大沟槽抑制剂(甲基绿)，小沟槽抑制剂(SYBR Green)，金属离子螯合剂(EDTA)，3h后加loading buffer并进行电泳实验。

实验结果：

如图5所示，加入羟基自由基的抑制剂碘化钾后，切割出现明显的抑制，说明羟基自由基有可能是切割过程中主要的活性氧物种；此外加入大沟槽抑制剂甲基绿和金属离子螯合剂乙二胺四乙酸二钠盐后，切割效果也出现明显的抑制，说明配合物有可能于DNA在大沟槽处结合而且金属离子在切割过程中也有不可替代的作用。

实施加入不同量的配合物(1)，观察BSA的荧光淬灭试验：

在血浆蛋白中一半左右的蛋白属于血清白蛋白，血清白蛋白在药物运输和新陈代谢过程中起到非常重要的作用；另一方面，牛血清白蛋白与人血清白蛋白成分极为相似，而且价廉易得；因此，研究配合物与牛血清白蛋白的相互作用，为配合物作为潜在的抗癌药物在体内运输将会提供很重要的信息。由此，我们通过荧光淬灭实验研究了铜配合物与BSA的相互作用。

实验过程：

向样品池中加入2ml缓冲溶液(缓冲溶液用三蒸水配制，10mMNaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH＝7.0)和40μL1.5×10^-3M的BSA溶液混合均匀，设置激发波长为280nm，测定345nm处BSA的荧光强度。然后用微量进样器每次向样品池中加入等体积的配合物储备液，使得配合物与BSA浓度比值不断增加，观察发射光谱的变化并记录数据以便数据处理。

实验结果：

由图6可以清晰地看出，随着配合物的不断加入，BSA荧光强度逐渐降低，峰形和位置基本不变，表明配合物与BSA之间发生了相互作用，BSA的发色团的微环境变化引起BSA内源性荧光淬灭。根据经典的荧光淬灭理论，依据Stem-Volmer方程式，I₀/I＝1+K_sv[Q]＝1+K_qτ₀[Q]，以加入配合物前后BSA的荧光强度比值(I₀/I)为纵坐标，配合物的浓度为横坐标，做出了Stem-Volmer图(图6中的嵌入图)，计算得到淬灭常数K_sv值为7.86×10⁴M^-1，τ₀已知(约为10^-8s)为无淬灭剂时荧光物质的平均寿命，计算得到淬灭速率常数K_q值为7.86×10¹²M^-1·s^-1。引起BSA荧光淬灭的原因存在静态淬灭和动态淬灭两种，一般动态淬灭中各种淬灭剂对生物大分子的最大扩散速率常数K_q值为2.0×10¹⁰M^-1·s^-1，而我们配合物的K_q数量级为10¹²均远远大于10¹⁰，实验表明配合物是通过静态淬灭方式引起BSA荧光的淬灭。判断出配合物与BSA的荧光静态淬灭机理，进一步研究了配合物与BSA的结合能力大小，利用Scatchard方程：log(I₀-I)/I＝logK_bin+nlog[Q]，如图6中的嵌入图所示，以log(I₀-I)/I对log[Q]拟合得到一条直线，由直线斜率和截距可计算得到配合物与BSA的结合常数K_bin为5.75×10⁵M^-1及结合位点数n为0.97，表明配合物与BSA有着较强的结合作用。

表1  化合物1的晶体结构的主要数据

表2  化合物1晶体的主要键长、键角

Claims (6)

1.一种双核铜配合物，其特征在于：它的化学式为[CuL(NO₃)₂]₂·CH₃CH₂OH，其中L为二(2-喹啉甲基)苄胺。

2.根据权利要求1所述的双核铜配合物，其特征在于：该配合物属于三斜晶系，空间点群为P-1，晶胞参数为 α＝77.437(10)°，β＝78.198(10)°，γ＝85.112(9)°，单胞体积为

3.根据权利要求1所述的双核铜配合物，其特征在于它的结构为：

在配合物的一个最小非对称基本单元中包含两个独立的单核铜配合物单元和一个乙醇分子；每一个单核单元由一个与中心铜离子配位的三齿氮配体，及两个硝酸根离子构成，其中每一个硝酸根离子都是其中一个氧原子与中心铜离子配位，配位模式为η-NO₃ ^-；两个铜离子均采用五配位的畸变四方锥构型，其中配体L的三个N原子和硝酸根的一个O原子占据赤道平面位置，另外一个硝酸根的O原子占据轴向位置。

4.权利要求1所述的双核铜配合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

将等摩尔配体L溶于无水乙醇中，加入等摩尔的硝酸铜的水溶液，搅拌3-5小时后，过滤，将滤液放置缓慢挥发20天后，得到蓝绿色晶体即为产物。

5.根据权利要求4所述的铜配合物的合成方法，其特征在于所述的硝酸铜与配体二(2-喹啉甲基)苄胺的摩尔比为1∶1。

6.权利要求1所述的双核铜配合物的应用，其特征在于它用于制备抗癌药物。