CN104072485B

CN104072485B - 含三唑侧链苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物及其应用

Info

Publication number: CN104072485B
Application number: CN201410245502.0A
Authority: CN
Inventors: 李晓莲; 尹方敏; 刘馨月; 张英利; 赵赫
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2014-06-04
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-06-04
Also published as: CN104072485A

Abstract

本发明涉及一类含三唑侧链苯并[c,d]吲哚‑2(1H)‑酮类化合物及其应用。所述化合物具有以下的化学分子结构通式Y。本发明通过缩合、取代、叠氮化、“Click chemistry”等反应，在萘内酰亚胺的2位引入生物活性的丙二腈结构来维持其较好的抗肿瘤活性，并通过柔性侧链引入具有生物活性的三唑结构和各种环状胺来改善该系列衍生物的溶解性，同时提高药效、降低毒副作用，设计合成了一类具有广泛的抗肿瘤活性的化合物，该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞的正常生长具有较好的抑制作用。

Description

含三唑侧链苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物有机合成领域中的一类抗肿瘤含三唑侧链苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物，其制备方法及其在抑制肿瘤细胞生长中的应用。

背景技术

随着人们对DNA结构和功能研究的深入，以DNA作为药物作用的靶点为抗肿瘤药物的研发提供了新的研究思路和理论依据。萘内酰胺衍生物是科研人员寻找新型DNA嵌入剂母体的重要发展。

萘内酰亚胺是含有三个环的平面小分子，并且分子结构中有三个活性位点。这样的特性逐渐被人们所认知，进而应用到DNA嵌入剂的研究中。人们对萘内酰亚胺母体的改造已经有了很大的进展，胸苷酸合成酶(TS)抑制剂AG331已进入临床试验阶段。我们课题组对萘内酰亚胺进行丙二腈的引入，尤其对肝癌7721细胞抗肿瘤活性的提高。以及Ahmed Kamal等设计合成的一系列萘内酰亚胺衍生物表现出良好的抗癌活性，特别地当X为SO2，n为4时，化合物浓度为1和2μΜ时就能使A549细胞在SubG1期被捕获并且导致细胞凋亡。

三唑类化合物有广泛的药理活性，如抗菌、镇痛、抗炎、局部麻醉、抗病毒、抗恶性细胞增生、抗高血压、抗癌等。羧胺三唑(CAI)是美国国家癌症中心研发的新型抗肿瘤药物，具有典型的三唑结构，现已进入临床III期试验阶段。主要用于恶性黑色素瘤，与长春醛碱和卡氮芥合并使用可提高其疗效。另外，对肺鳞癌、肉瘤、平滑肌肉瘤、纤维肉瘤也有一定疗效。

发明内容

本发明的目的是一方面希望在萘内酰亚胺的2位引入生物活性的丙二腈结构来维持其较好的抗肿瘤活性，另一方面希望通过柔性侧链引入具有生物活性的三唑结构和各种环状胺来改善该系列衍生物的溶解性并同时提高药效、降低苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮酰胺结构作为药效团的毒副作用。因此，本发明提供一类抗肿瘤含三唑侧链的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物，是在苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮母体上通过柔性侧链引入三唑药效团。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：含三唑侧链的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物，该化合物具有以下的化学分子结构通式：

通式Y中：R选自X₁、X₂、X₃、X₄、X₅或X₆

进一步地，所述化合物选自：

2-(1-(2-(4-(吗啉代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈；

2-(1-(2-(4-(硫代吗啉代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈；

2-(1-(2-(4-(吡咯代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈；

或2-(1-(2-(4-(哌啶-1-甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈。

本发明所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

①制备中间体2：将苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮溶于无水甲苯，再加入丙二腈和POCl₃，反应生成2-(苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈，作为中间体2；

②制备中间体3：将中间体2和碳酸钾溶于乙腈，加入二溴乙烷，反应生成2-(1-(2-溴乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈，作为中间体3；

③制备中间体4：将中间体3溶于DMF中，加入叠氮钠，反应生成2-(1-(2-叠氮基乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈，作为中间体4；

④将三乙胺、溴丙炔和相应环状胺混合，溶解于叔丁醇和水的混合液，搅拌反应，再加入中间体4、抗坏血酸钠和五水硫酸铜，氮气保护下，反应生成所述化合物。

合成路线如下：

进一步地，步骤①中，苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮和丙二腈的最佳摩尔比为1:1.5，溶剂为无水甲苯，溶解后加热至80℃，再向体系中加入POCl₃，升温至100℃，苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮和丙二腈发生脱水反应引入两个氰基，冷却，加入甲醇，倒入冰水，分层后析出黑褐色沉淀，过滤，水洗，干燥，得到黑色固体。

进一步地，步骤②中加入过量二溴乙烷至反应体系，按照反应式通常要过量10倍以上。反应温度最优选为82℃，即为乙腈回流温度，反应完成后，冷却，过滤，滤液旋蒸，干燥后硅胶柱层析分离，得橙红色固体。

进一步地，步骤③中中间体3与叠氮钠的最佳摩尔比为1:1.5，反应温度一般要小于60℃，最佳反应温度为55℃，二者发生亲核反应生成叠氮化物，反应完成后体系冷却，倒入水中，析出固体，抽滤，水洗得到黄色固体；

进一步地，步骤④中所述三乙胺、溴丙炔和相应环状胺的最佳摩尔比为2:1:1.2，叔丁醇和水以1:1混合，中间体4的加入量按与溴丙炔的摩尔比为1:3加入，经Cu(I)催化的“Click chemistry”反应，N₂保护下，70℃避光反应完全，体系冷却，倒入冷水，抽滤，水洗，干燥，经硅胶柱层析分离得黄色固体即为所述化合物。

本发明所述化合物具有抑制肿瘤细胞生长的作用，所述肿瘤细胞包括MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞。

将本发明所述的化合物用四氮唑盐还原法对MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，结果表明，该类化合物对宫颈癌、肝癌、乳腺癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性。

所述四氮唑盐还原法实验步骤如下：

1、接种细胞

分别将乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和肝癌SMMC-7721细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200μL细胞悬液，保证每孔中约2000～5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37℃、5％CO₂的环境中温育24h～48h。

2、添加药物

用培养基将本发明所述化合物分别稀释成0.5×10^-5，10^-5，2.0×10^-5，4.0×10^-5M四个梯度浓度，吸去96孔板中2-11列的培养基，此处要小心不要吸走细胞；然后加入药物，设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO₂培养箱中，培育48h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO，溶解残留的MTT-甲臜结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：

肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。

本发明的有益效果：

本发明通过缩合、取代、叠氮化、“Click chemistry”等反应，一方面在萘内酰亚胺的2位引入生物活性的丙二腈结构来维持其较好的抗肿瘤活性，另一方面通过柔性侧链引入具有生物活性的三唑结构和各种环状胺来改善该系列衍生物的溶解性并同时提高药效、降低苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮酰胺结构作为药效团的毒副作用，合成了含三唑侧链苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物，试验证明其对体外肿瘤细胞生长具有抑制能力。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

2-(1-(2-(4-(吗啉代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(化合物T1)的合成：

(1)2-(苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(中间体2)

在干燥环境下，将5.0g(29.6mmol)苯并吲哚酮加入盛有40mL无水甲苯的100mL双口瓶中，加入丙二睛2.93g(44.4mmol)，机械搅拌下加热至80℃，此时向反应体系中滴加3.5mL(13.5mmol)POCl₃，继续升温至100℃，在100℃下反应3h后，冷却体系至室温，加入15mL甲醇，然后倒入冰水中，溶液分层，析出黑褐色沉淀，过滤，水洗，干燥，得到5.4g黑色固体，即中间体2，产率：84.1％。

(2)2-(1-(2-溴乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(中间体3)

在100mL双口瓶中，加入5.4g(24.9mmol)中间体2，碳酸钾3.4g，用15mL无水乙腈溶解，向体系中加入30mL(0.34mol)二溴乙烷，干燥环境下升温至82℃反应4h，TLC跟踪至反应完全，冷却至室温，直接过滤，滤液旋蒸，干燥后硅胶柱层析分离(层析液：CH₂Cl₂:石油醚＝2:1)得橙红色固体即中间体3，产率：85.0％。

(3)2-(1-(2-叠氮基乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(中间体4)

将1g(3.1mmol)中间体3溶解于20mL DMF中，缓慢加入0.31g(4.8mmol)的叠氮化钠，加热到55℃，继续搅拌1.5h，TLC跟踪至完全反应，待体系冷却后倒入水中，析出黄色固体，抽滤，水洗得到黄色固体，产率：93.6％。

(4)2-(1-(2-(4-(吗啉代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(化合物T1)

将835μL(6mmol)三乙胺，235μΜ(3mmol)溴丙炔，3.6mmol吗啉加入25mL双口瓶，用8mL叔丁醇和水的1:1的混合溶液溶解，室温反应1h。在磁力搅拌下加入286mg(1mmol)中间体4，催化剂0.58g(3mmol)抗坏血酸钠(VC钠)和0.25g(1mmol)五水硫酸铜，氮气保护，升温至70℃，避光密封反应24h，TLC跟踪至反应完全。体系冷却至室温，倒入冷水中，抽滤，水洗，干燥。经硅胶柱层析分离(层析液：CH₂Cl₂:CH₃OH＝12:1)得黄色固体，产率：97.5％。熔点：224.1-226.0℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.72(d,J＝7.5Hz,1H),8.13(d,J＝8.1Hz,1H),7.83(t,J＝7.8Hz,1H),7.62(d,J＝8.3Hz,1H),7.55–7.31(m,2H),6.86(d,J＝7.3Hz,1H),4.96(s,4H),3.60(s,6H),2.32(s,4H).

+ESI MS(M+H):C₂₃H₂₁N₇O，计算值：412.1808，实测值：412.1855。

实施例2

2-(1-(2-(4-(硫代吗啉代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(化合物T2)的合成：

除在(4)中用硫代吗啉代替吗啉外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(层析液：CH₂Cl₂:CH₃OH＝20:1)得黄色固体，产率：98.6％。熔点：248.7-250.9℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.72(d,J＝7.5Hz,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.83(t,J＝7.8Hz,1H),7.63(s,1H),7.50(d,J＝17.4Hz,1H),7.00(s,1H),6.84(s,1H),4.99(s,4H),3.54(s,4H),3.00–2.34(m,6H).

+ESI MS(M+H):C₂₃H₂₁N₇S，计算值：428.1579，实测值：428.1643。

实施例3

2-(1-(2-(4-(吡咯代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(化合物T3)的合成：

除在(4)中用吡咯烷代替吗啉外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(层析液：CH₂Cl₂:CH₃OH＝20:1)得黄色固体，产率：85.1％。熔点：217.5-218.4℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.72(d,J＝7.4Hz,1H),8.45(s,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.88–7.77(m,1H),7.60(d,J＝8.2Hz,1H),7.53–7.43(m,1H),6.97(d,J＝19.7Hz,1H),4.99(s,4H),4.20(s,2H),3.41(s,2H),2.85(s,2H),2.28–1.90(m,4H).

+ESI MS(M+H):C₂₃H₂₁N₇，计算值：396.1858，实测值：396.1982。

实施例4

2-(1-(2-(4-(哌啶-1-甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈(化合物T4)的合成：

除在(4)中用哌啶代替吗啉外，其它合成及实验处理方法同实施例1。经硅胶柱层析分离(层析液：CH₂Cl₂:CH₃OH＝22:1)得黄色固体，产率：89.3％。熔点：200.2-202.1℃。

¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.3Hz,1H),8.12(d,J＝8.2Hz,1H),7.82(t,J＝7.7Hz,1H),7.61(d,J＝8.2Hz,1H),7.44(t,J＝7.7Hz,1H),6.84(d,J＝7.3Hz,1H),4.96(s,4H),3.71(s,2H),2.43(s,4H),1.60(s,4H),1.44(s,3H).

+ESI MS(M+H):C₂₄H₂₃N₇，计算值：410.2015，实测值：410.2091。

应用例

体外抑制肿瘤细胞生长活性测定：

用四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性测定。

以化合物T1为例，四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：

1、接种细胞

将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞收集到培养基中，将细胞稀释后每孔接种200μL细胞悬液，保证每孔中约2000～5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至37℃、5％CO₂环境的培养箱中温育24h。

2、添加药物

用培养基将实施例1制备的化合物M1分别稀释成0.5×10^-5，10^-5，2.0×10^-5，4.0×10^-5M四个梯度浓度；吸去96孔板中2-11列的培养基，此处要小心不要吸走细胞，然后加入药物，每个浓度设置6个复孔，减小误差；处理完成后，将96孔板放回CO₂培养箱中，培育48h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的培养基和MTT，加入200μL DMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率：

肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％。

化合物T2～T4的检测方法同上。

根据化合物T1～T4的肿瘤抑制率，计算其IC₅₀值，结果如下表：

表1.化合物T1～T4对Hela、MCF-7和7721癌细胞的IC₅₀值

通过表一中的体外生测数据可以看出，该系列化合物T1-4对三种肿瘤细胞株都表现出良好的抑制效果，细胞毒性都在μM级。所有化合物对MCF-7的选择性要好于Hela和7721两种癌细胞。其中化合物T1对MCF-7和Hela细胞的IC₅₀值分别为8.29μM和9.23μM。

Claims

1.含三唑侧链的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类化合物，其特征在于该化合物具有以下的化学分子结构通式：

通式Y中：R选自X₁、X₂、X₃、X₄、X₅或X₆

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物选自：

2-(1-(2-(4-(吡咯烷代甲基)-1H-1,2,3-三唑)乙基)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-亚基)丙二腈；

3.权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括以下步骤：

4.权利要求1或2所述的化合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用；所述的肿瘤细胞选自MCF-7乳腺癌细胞、Hela子宫颈癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞。