CN104069483B - 肿瘤抑制因子cylindromatosis在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肿瘤抑制因子cylindromatosis（CYLD）在治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病中的功能和应用。通过高脂饮食诱导的模型研究CYLD基因的功能，发现与野生型C57小鼠对比，CYLD基因敲除小鼠的体重、空腹血糖水平均高于对照组WT小鼠，腹腔注射葡萄糖耐量实验发现CYLD基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱；从小鼠肝脏大体外观、肝脏重量、肝脏/体重比值以及脂质成分病理染色结果等均说明HFD组的CYLD-KO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加，这些结果表明A20基因敲除显著恶化脂肪肝、Ⅱ型糖尿病。针对CYLD的上述作用，其可用于制备治预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物。
Description
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种肿瘤抑制因子cylindromatosis（CYLD）在治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病中的功能和应用，以及CYLD作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病的药物中应用。
背景技术
糖尿病是严重危害人民健康的代谢性疾病，已经成为全球的第三大非传染性疾病。世界卫生组织按糖尿病病因和发病机制将其大致分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病。Ⅱ型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病，约占糖尿病总人数的90%以上。II型糖尿病的发病机制目前尚不清楚，胰岛β细胞功能障碍与胰岛素抵抗被公认为是II型糖尿病发病的两个重要机制。
糖尿病疾病本身，同时加上它可怕的且不易逆转的并发症对患者的生活质量和生命健康影响极大，也是当前临床与研究界的重要难题。糖尿病慢性并发症是导致糖尿病患者致死致残的主要原因，不仅累及心脑血管、肾脏、视网膜、神经等重要脏器和组织，肝脏也是其重要的靶器官之一。肝脏是糖代谢最主要的器官之一，是物质代谢的中枢，它具有许多重要的生理功能，如葡萄糖的合成和分解，脂质合成和分解，胆汁合成和分泌等。肝脏是人体生化工厂，脂质由肝脏合成和输出。随着糖尿病病程的延长，发生肝脏病变的危险性及其病变程度也随之增加。糖尿病性肝损伤是指糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化，是糖尿病的一种慢性并发症。糖尿病的早期诊断，防治糖尿病慢性并发症对减轻患者负担尤为重要。
肿瘤抑制因子cylindromatosis（CYLD）是新发现的一种细胞因子，这个基因可编码含3个细胞骨架相关甘氨酸蛋白保守结构域（CAP-GLY），具有去泛素化酶活性。多发性家族性毛发上皮瘤等基因突变和CYLD有关联。CYLD在经典的NF-κB信号转导途径中发挥重要的生物学作用，影响炎症、免疫反应及肿瘤的形成，参与多种皮肤病的发生发展，在细胞的分裂及迁移过程中发挥重要作用。肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）是NF-κB信号转导途径中的一员，TRAF2如果发生Lys48相互连接的多聚泛素化，则导致其自身的降解；如果发生Lys63相互连接的多聚泛素化，则能开启NF-κB的下游信号通路。CYLD很可能是通过把TRAF2上Lys63相互连接的多聚泛素链去掉，而在NF-κB信号转导途径中起负调节物的作用，阻止下游信号途径的转导（1）。CYLD与肝癌患者中癌症细胞的发展有密切关系（2，3）；乳腺癌患者中CYLD的表达明显下调，是通过激活NF-κB从而促进促进乳腺癌转移（4）；CYLD可通过抑制NF-κB信号转导途径负性调控艾滋病病毒转录（5）；CYLD和微管相关末端结合蛋白1相互作用，可共同调节微管动力学和细胞迁移（6）；CYLD在调控纺锤体有丝分裂和细胞分裂的方向，以及在健康和疾病方面发挥重要作用（7）。
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发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种CYLD基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因CYLD的新用途，进而把CYLD基因应用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治疗。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明以野生型C57小鼠与CYLD基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型（dietinducedobesity，DIO）模型研究CYLD基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，CYLD基因敲除小鼠表现出肥胖，其体重明显高于同种饲料饲养的WT小鼠，并且CYLD基因敲除小鼠的体重及空腹血糖水平均高于对照组WT小鼠，CYLD基因敲除小鼠的肝功能明显差于WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现CYLD基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠肝脏大体外观，肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分病理染色结果等均说明HFD组（Highfatdiet，高脂饮食）的CYLDKO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加。这表明CYLD基因敲除会加剧脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，CYLD基因能够改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。
一种CYLD基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，具体体现在CYLD具有维持糖代谢稳态和改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的功能。
针对CYLD的改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的功能，CYLD可在制备用于预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物方面应用。
一种预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物，包含CYLD。
针对CYLD的改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的功能，CYLD可在制备用于预防、缓解和/或治疗Ⅱ型糖尿病的药物方面应用。
一种预防、缓解和/或治疗糖尿病的药物，包含CYLD。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明发现CYLD基因的新功能，即CYLD基因具有能够改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。
（2）基于CYLD在改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的药物。
附图说明
图1是WT和CYLD-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图；A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图（*：p＜0.05vsWTNC组，**：p＜0.01vsWTNC组，#：p＜0.05vsWTHFD组，##：p＜0.01vsWTHFD组）。
图2是WT和CYLD-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积（areaunderthecurve，AUC）比较图（**：p＜0.01vsWTNC组，##：p＜0.01vsWTHFD组）。
图3是CYLD-KO和WT小鼠的肝脏大体外观结果图；A为肝脏大体结果图，B为肝脏重量、肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图（##：p＜0.01vsWTHFD组）。
图4是WT和CYLD-KO小鼠的HE和油红O染色图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实验用动物及饲养：
实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6（WT）小鼠和CYLD-KO小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；CYLD基因敲除小鼠（CYLD-KO，购自EuropeanMouseMutantArchive（EMMA），货号：EMMA07405）。
实验动物饲料配方：高脂饲料（Highfatdiet，HFD）（购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942）：热量百分比：蛋白质20%，碳水化合物20%，脂肪60%；总的热量质量比5.24kcal/g。低脂饲料（Normalchow，NC）（购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B）：热量百分比：蛋白质20%，碳水化合物70%，脂肪10%；总的热量质量比3.85kcal/g。
动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房（许可证号：SYXK（鄂）：2009-0053）。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40-70%，小鼠自由饮水进食。
实施例1小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型（dietinducedobesity，DIO）获得
（1）实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和CYLD-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂饲料（Normalchow，NC）饲养，即WTNC组，KONC组，WTHFD组，KOHFD组共4个组别。
（2）模型通过高脂饲料诱导操作流程：
采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确CYLD基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和CYLD-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂饲料（Normalchow，NC）饲养，即WTNC组，KONC组，WTHFD组，KOHFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔4周检测1次。实验第14周，进行腹腔注射葡萄糖实验（IPGTT），以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第16周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂（TissueFreezingMedium）包埋作为病理分析用。
实施例2小鼠体重、血糖水平测定
（1）小鼠空腹体重，食量检测
1）体重检测。
①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食（不禁水），下午2:00开始实验操作。
②称重：分别在第0周、4周、8周、12周、16周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。
（2）空腹血糖水平检测实验
将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食（不禁水），即禁食6小时后开始实验操作。
①血糖仪准备：检查血糖仪（美国强生公司，ONETOUCH）电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。
②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。
③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。
④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。
Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图1所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组，给与CYLD-KO小鼠16周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第4周开始HFD组的CYLD-KO小鼠体重明显高于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第16周（见图1A）；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第4周、8周、12周、16周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的CYLD-KO小鼠空腹血糖水平也明显高于WT组小鼠空腹血糖水平（见图1B）。表明CYLD基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，CYLD基因能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明CYLD基因在高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。
实施例3葡萄糖耐量实验（intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT）
实验第14周，进行腹腔注射葡萄糖实验（IPGTT），以评价小鼠机体对糖耐受能力。
（1）在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。
（2）先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。
（3）腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
（4）分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。
进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验（intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT）来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第14周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和CYLD-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平（0分钟时血糖），在2小时时恢复至空腹血糖水平，且CYLD-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平（图2A）。比较各组小鼠血糖曲线下面积（areaunderthecurve，AUC），发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，CYLD-KOHFD组的AUC显著大于WTHFD组的AUC（图2B），表明CYLD对维持糖代谢稳态具有强大的调控能力。
实施例4肝脏大体外观及肝脏组织脂质成分测定
（1）终末肝脏组织取材
1）小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。
2）用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。
3）迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。
4）石蜡标本：切取部分肝脏置于10%中性福尔马林中固定。冰冻标本：切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。
2.肝脏组织处理及病理染色相关实验
1）肝脏脱水，透明，浸蜡
切取10%中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水：75%酒精（45分钟）→75%酒精（45分钟）→85%酒精（45分钟）→85%酒精（45分钟）→95%酒精（45分钟）→95%酒精（45分钟）→无水酒精（1小时）→无水酒精（1小时）；②透明：二甲苯（1小时）→二甲苯（1小时）；③浸蜡（65℃）：石蜡（1小时）→石蜡（1小时）。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。
2）肝脏组织切片
使用切片机切片（切片厚度5μm）。
3）肝脏组织苏木精-伊红（HE）染色
将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱（30分钟）→二甲苯中（5分钟×3次）→100%酒精（1分钟）→90%酒精（1分钟）→70%酒精（1分钟）→蒸馏水洗→苏木素（5分钟）→自来水洗去切片上的浮色→1%盐酸酒精（1至3秒）→自来水洗数下→Scott促蓝液（碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL）（1分钟）→自来水洗数下→伊红（1分钟）→蒸馏水洗去切片上的浮色→70%酒精一下→90%酒精一下→100%酒精（30秒×3次）→二甲苯（2分钟×3次）→在二甲苯未干时封片，拍照。
4）肝脏组织油红O染色
①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4%多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中稍洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。
②以60%异丙醇处理1分钟。
③用油红O（公司sigma，货号O0625，浓度0.5克/100mL100%异丙醇）染色30分钟。
④之后以60%异丙醇漂洗1分钟×3次，直至背景干净。
⑤用Mayer’s苏木素染液（5滴）淡染细胞核。
⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。
⑦用甘油明胶封片，拍照。
肝脏大体外观结果见图3所示，通过大体取材拍照，观察到在HFD组的CYLD-KO小鼠的肝脏体积稍较HFD组的WT小鼠的肝脏大，且CYLD-KO肝脏色泽泛黄，油脂较多（如图3A）。在HFD组的CYLD-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高（如图3B）。进一步通过组织切片，进行HE和油红O染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织在高脂饮食饲养条件下发生了显著的病理改变。通过肝脏HE染色，可以观察到在HFD饲养条件下，WT小鼠和CYLD-KO小鼠肝脏组织均有脂肪沉积，可以看到NC组小鼠的肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态已几乎完全破坏，而CYLD-KO组小鼠的肝细胞形态变化更为严重（如图4上）。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，可以发现在HFD组的WT小鼠的肝门静脉周围呈大片红色，提示有大量的脂质沉积，而在HFD组的CYLD-KO小鼠的肝门静脉周围的脂质沉积更显著（如图4下）。这些结果说明CYLD基因敲除小鼠的脂肪肝明显恶化。
上述结果显示CYLD-KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明CYLD基因对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明CYLD基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.CYLD在制备预防、缓解和/或治疗肥胖引起的脂肪肝疾病药物中的应用。
2.CYLD在制备预防、缓解和/或治疗肥胖引起的Ⅱ型糖尿病药物中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Hongliang Inventor after: Zhao Guangnian Inventor after: Wang Tao Inventor after: Du Cheng Inventor before: Li Hongliang Inventor before: Zhang Xiaodong Inventor before: Wang Tao Inventor before: Du Cheng |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: LI HONGLIANG ZHANG XIAODONG WANG TAO DU CHENG TO: LI HONGLIANG ZHAO GUANGNIAN WANG TAO DU CHENG |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200527 Address after: 430000 16 / F, building 02, phase III, software new town, No.8 Huacheng Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province Patentee after: Wuhan huikangda Technology Co., Ltd Address before: 430072 room 02, 2-3 / F, building B4, phase II, financial backstage service center base construction project, No.77, Guanggu Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province (multiple photos for one site) Patentee before: Wuhan Topaz Intellectual Property Operation Co., Ltd. |