CN104069065A - 一种注射用桂皮醛亚微乳剂的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桂皮醛的亚微乳注射剂的制备方法及应用，所述组成成分按重容百分比计为：油为5.1％-30.6％，乳化剂为0.5％-3.0％，渗透压调节剂为1％-4％，稳定剂为0.1％-0.3％，抗氧化剂为0.05％-0.2％，其余成分为蒸馏水。该亚微乳注射剂具有良好的稳定性、生理相容性和安全性；制备方法简单、质量可控并可工业化生产；本药物可以用于治疗肿瘤等疾病。

Description

一种注射用桂皮醛亚微乳剂的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种桂皮醛亚微乳注射剂的制备方法及其应用。

背景技术

桂皮醛(cinnamaldehyde，CA)亦称肉桂醛、桂醛、β-苯丙烯醛、3-苯基-2-丙烯醛，广泛存在于肉桂油、桂皮油、藿香油、风信子油和玫瑰油等精油中；目前桂皮醛已可以化学合成。桂皮醛的分子式为C₉H₈O，分子量132.16，CAS号：104-55-2，EINECS号：203-213-9，FEMA：2286；其密度：1.046-1.520，熔点：-7.5℃，折光率：1.619-1.623，沸点：253℃。桂皮醛常温下为无色或淡黄色液体；具有强烈的桂皮油和肉桂油的香气，温和的辛香气，其香气强烈、持久。桂皮醛难溶于水、甘油和石油醚，易溶于乙醇、乙醚中，能随水蒸气挥发；在强酸性或者强碱性介质中不稳定，易导致变色，在空气中易氧化。桂皮醛有顺式和反式二种异构体，目前，商用的桂皮醛无论是天然的还是合成的桂皮醛均为反式异构体。

桂皮醛具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、解热、镇痛等多种药理作用。

黄敬群等[中国新医药，2004，3(9)：61-63]研究发现桂皮醛对体外培养的多种肿瘤细胞，如人皮肤黑色素瘤A375细胞、肝细胞瘤HCC-9727细胞、肾癌GRC-1细胞、乳腺癌SKBr-2HL细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC-7901细胞、食道癌Eca-109细胞等均具有不同程度的增殖抑制作用；Moon等[Drug Chem Toxieol.1983，6(6)：521-535]证实桂皮醛对小鼠白血病L1210细胞的活性抑制率可达到50％；刘黎琼等[中国医药导报，2011；13(6)：1044-1045]研究发现，桂皮醛呈时间和剂量依赖性抑制慢性髓细胞白血病细胞株K562增殖，使细胞周期阻滞于G2/M期并诱导细胞凋亡；桂皮醛还可显著抑制急性髓系白血病细胞株U937细胞增殖、诱导其凋亡；桂皮醛抑制细胞增殖与其阻滞细胞周期有关；研究表明抑制U937细胞VEGF分泌可能是桂皮醛抗白血病重要机制之一[临床血液学杂志，2011；24(11)：665-671]。Shux[Biochem Pharmacol.2012；83(9)：1229-1240]和Warner[Melanoma Res.2010；20(2)：85-96]的研究亦证明桂皮醛具有明显抗肿瘤作用。曹桂芬[国口腔医学杂志，2013；40(1)：10-13]等证实，256mg/L、128mg/L、64mg/L、32mg/L桂皮醛对人口腔鳞状癌细胞的增殖表现出明显抑制作用，且抑制作用随着药物浓度的升高而加强，呈现明显的剂量-效应关系；药物作用24小时，16mg/L组对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的抑瘤率达到58.33％；32mg/L组对KB细胞及人颊黏膜鳞状细胞癌BCaCD885细胞株的抑制率分别为66.08％、76.61％，其抑制率随着药物作用时间的延长而增加。周凌等[第三军医大学学报,34(7)：602-604]发现10μmol/L桂皮醛作用24h即能抑制A375细胞增殖，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L桂皮醛的抑制强度具有统计学意义(P＜0.01)；40μmol/L桂皮醛作用72h的细胞增殖抑制率最高达(88.91±4.5)％；随桂皮醛作用时间延长，A375细胞分泌VEGF的量逐渐减少，72h后各浓度间的抑制作用具有统计学意义(P＜0.01)；40μmol/L桂皮醛作用72h后A375细胞分泌的VEGF含量最低，为9.55pg/mL。王跃新等[中国微生态学杂志，2011；23(6)516-524]研究证实，桂皮醛能上调宫颈癌HeLa细胞P21蛋白表达和下调CDK4蛋白表达。我们早年的实验研究发现，以小鼠移植性肿瘤为模型，桂皮醛25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg三个剂量组对鼠源性肉瘤S₁₈₀的生长均具有明显抑制作用，其瘤重抑制率分别为7.69％、33.08％和46.92％，而且桂皮醛对荷瘤小鼠胸腺和脾脏指数无明显影响[中国临床康复，2006；10(11)：107-110]；50mg/kg、100mg/kg桂皮醛对SGC-7901人源性胃癌的瘤重抑制率分别为41.67％、60.61％[解放军药学学报，2006；22(5)：343-346]。我们近期研究证实，桂皮醛原料药及亚微乳对人源性A549肺癌细胞的IC₅₀分别1.476μg/mL和0.149μg/mL；500mg/kg和250mg/kg桂皮醛原料药对A549裸鼠移植瘤的瘤重抑制率分别为82.91％和48.72％，而顺铂注射液(1mg/L)为70.94％。桂皮醛具有抗肿瘤作用是肯定的，但其作用机制尚不完全清楚。Wu等[Life Sci.2005；77(8)：938-951]发现，桂皮醛通过Bcl-2蛋白家族中部分具有促进凋亡活性的蛋白和激活促分裂素原活化蛋白激酶信号通路诱导人肝癌细胞PLC/PRF/5凋亡；Ka等[Cancer Lett.2003；196(2)：143-152]认为桂皮醛通过活性氧介导的线粒体通透性转换以及由此产生的细胞色素C的释放诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡，同时还证实给小鼠长期服用桂皮醛可延缓肝癌的发生，抑制肿瘤细胞的增殖；其机制可能与桂皮醛诱发机体活性氧簇(ROS)介导线粒体膜渗透性转换并促使细胞色素C释放有关。

桂皮醛对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、伤寒和副伤寒甲杆菌、肺炎球菌、产气杆菌、变形杆菌、炭疽杆菌、肠炎沙门氏菌，霍乱弧菌等均有明显抑制活性，且对革兰氏阳性菌杀菌效果显著，可用于治疗多种细菌感染而引起的疾病[广东饲料，2012；21(12)：29-32]。冯雅君等[河北医药，2011；33(21)：3324-3325]研究桂皮醛了的抗菌活性，结果发现桂皮醛组在第3天将粪肠球菌全部杀死，与甲醛甲酚组、氢氧化钙丙二醇糊剂组无差别，提示桂皮醛对口腔根管内粪肠球菌有很强的抗菌作用，其作为一种新型根管消毒药物具有良好应用前景。刘蓉等[中药药理与临床，2012，28(2)：75-78]证实，桂皮醛能够明显抑制甲型流感病毒(H₁N₁)在犬肾传代细胞中的增殖，并对流感病毒株感染小鼠有较好的治疗作用；同年该团队的汤奇等[时珍国医国药，2012，23(7)：1622-1624]进一步发现桂皮醛在鸡胚内具有良好的抗流感病毒作用；之后，刘蓉团队[中药药理与临床，2013；29(4)：33-36]发现0.264mg/kg、0.132mg/kg桂皮醛可有效减少病毒性肺炎小鼠的死亡；还证实桂皮醛抗H₁N₁作用机制可能与其激活TLR7信号通路、活化IRAK-4、诱导IFN-B高表达有关[刘蓉，等.中草药，2013；44(11)：1460-1464]。汪昆等[食品与发酵工业，2012，38(3)：68-72]发现桂皮醛具有显著抗真菌作用，特异性抑制真菌细胞壁葡聚糖和几丁质的合成是其抑制真菌生长的主要机制之一。王刚生等[中国中医药信息杂志，2013；20(6)：41-43]比较了桂皮醛等三种中药单体成分对肺念珠菌体外的抗菌活性，发现桂皮醛对白色念珠菌、热带念珠菌的最低抑菌浓度为0.02μg/mL，对克柔氏念珠菌的最低抑菌浓度为0.04μg/mL，对白色念珠菌、热带念珠菌的最低杀菌浓度为0.04μg/mL，对克柔氏念珠菌的最低杀菌浓度为0.08μg/mL，显示其抗真菌作用最强。代立娟等[中国老年学杂志，2013；33(6)：1309-1312]证实，桂皮醛在一定浓度范围内可通过直接灭活病毒、抑制病毒复制及作用于病毒吸附阶段而发挥抗呼吸道合胞病毒的作用。我们的研究证实，桂皮醛还具有明显抗柯萨奇病毒[丁媛嫒，等.中国病原生物学杂志，2010；5(5)：321-326/Yuanyuan Ding,etc.Am J MedSci.2010；340(2)：114-20]作用。

Subash等[Phytomedicine.2007；14(1)：15-22]对链脲佐菌素诱发的糖尿病大鼠给予5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg桂皮醛(从肉桂中提取)，1次/d，连续45d，治疗组大鼠血糖明显下降且呈剂量依赖性(63.29％)，同时高剂量组大鼠的糖化血红蛋白、总胆固醇、三酰甘油水平均显著降低(P＜0.05)，血浆胰岛素、肝糖原、高密度脂蛋白水平明显升高。Kim等[J Ethnopharmacol.2006；104(1-2)：119-123]将肉桂提取物(主要含桂皮醛)灌胃给药6周，50mg/kg/d、100mg/kg/d、150mg/kg/d和200mg/kg/d剂量组均能显著降低C57BL/Ks db/db型小鼠的血糖水平，其中以高剂量组降血糖作用最明显。李鸣一等[武汉大学学报(医学版)，2009；30(6)：723-731]研究证实，桂皮醛的降糖调脂作用可能与升高糖尿病大鼠腓肠肌中IRS-1和降低P85a水平有关。

在Shu等[J Asian Nat Prod Res.2010,12(1)：76-82]研究证实桂皮醛具有显著解热和镇痛作用的基础上，张畅斌等[中国中药杂志,2012；37(9)：1274-1278]进一步确证桂皮醛是肉桂抗炎解热的主要活性成分之一，抑制PGE₂生成是其主要作用机制，而桂皮醛抑制mPGES-1表达，是其下调COX-2之外，抑制PGE₂生成是另一分子机制；我们近期研究证实桂皮醛具有保护心肌缺血再灌注损伤等作用[Fan Song,etc.J Ethnopharmacology.2013；150：125-130]。

桂皮醛还在食品、卫生制品和农业防治病虫害等领域具有广泛的用途。如Michael[Annu.Rev.Food Sci.Technol.2013.4：163-90]综述富含桂皮醛的桂皮油作为天然抗菌剂用于食品防腐。Sparagano[Annu.Rev.Entomol.2014.59：447-66]报道，桂皮醛可能成为新型家禽杀螨剂等。

2.5mmol/kg桂皮醛给大鼠灌胃后24小时内，62％从尿中、16％从粪便中排出，72小时累积排泄量分别增加至86％和24％；以相同剂量给小鼠腹腔注射24至72小时后，尿和粪便排出量依次由54％增至63％、15％至26％。采用250mg/kg¹⁴C-标记桂皮醛给大鼠腹腔注射24小时后，雄鼠的尿和粪便中分别检出89％和86％，雌鼠分别为90％和79％。Peters团队采用250mg/kg桂皮醛分别给大鼠和小鼠灌胃24小时后，发现该剂量的98％和85％桂皮醛经尿和粪便中排出；该结果在二名自愿受试成年人体内得到验证，口服0.7mg/kg桂皮醛8小时，在尿中获得100％检出[Bickers，etc.Food and Chemical Toxicology.2005；43：799-836]。Yingrong等[Euro J.Drug Metabolism and Pharmacokinetics.2009；34(1)：51-56]进一步研究了桂皮醛的药代动力学，发现桂皮醛灌胃给予大鼠后部分在胃和小肠迅速代谢成桂皮酸，而绝大部分在肝脏中几乎完全代谢成桂皮酸。而我们采用GC-MS研究证实[Hang Zhao，etc.J Pharmaceut Biomed.2014；89：150-157]，桂皮醛给大鼠灌胃后，有少量桂皮醛进入血液，其半衰期为6.7±1.5小时；研究还证实其在肺、心等组织中具有分布；该结果说明，桂皮醛虽然在进入体内后大部分很快被代谢成桂皮酸，但还有少部分以原型形式进入血液循环并发挥药理作用。

桂皮醛的体内毒性较小，经口LD₅₀大鼠为2220mg/kg，豚鼠1160mg/kg；小鼠腹腔注射的LD₅₀为460mg/kg；分别灌胃给大鼠和小鼠200mg/kg/d和550mg/kg/d桂皮醛2年无动物死亡，观测食物消耗量、体重、生化和组织病理学等指标，综合评价具有安全性；目前的研究资料尚未发现桂皮醛具有遗传毒性和致癌性[Bickers，etc.Food and Chemical Toxicology.2005；43：799-836]。

富含桂皮醛的桂皮油已在医药辅料、食品和轻化工业中应用十分广泛，但桂皮醛作为重要的医药原料药至今尚未见新药或制剂应用于临床。易醒等[肉桂油纳米乳注射剂的制备方法(201010273216.7)]提出肉桂油纳米乳注射剂的制备方法，主要由肉桂油、复合乳化剂、助乳化剂、去离子水等组分构成的一种肉桂油纳米乳注射剂体系。每100毫升纳米乳注射剂液中含有肉桂油2-17克，复合乳化剂20-35克，助乳化剂10-15克，分散剂2-18克。在20℃-60℃下磁力搅拌均匀即得纳米乳注射剂，封装后进行灭菌。本乳化剂粒径在25nm-40nm之间，载药量在2％-17％，包封率80％。欧阳五庆等[一种水包油型肉桂醛纳米乳药物(201110246102.8)]公开了一种水包油型肉桂醛纳米乳药物，该纳米乳的粒径在10-100nm之间，其原料组成为表面活性剂18.09％-37.19％、助表面活性剂0-6.86％、油0-8.62％、肉桂醛0.10％-8.31％。彭雪萍[食品工业科技，2012；33(1)：138-140]采用饱和水溶液法制得肉桂醛-β-环糊精包合物，并研究了包合前后抗氧化及抑菌效果，证实包合物的抑菌强度分别是肉桂醛的1.10倍，山梨酸钾的1.36倍，对酵母菌而言，分别是1.15和1.24倍，说明包合后比包合前的抑菌效果有所提高，且明显好于山梨酸钾。张清峰[食品与发酵工业，2006；32(8)：60-71]采用悬浮液法，向100mg/mL的β-环糊精(CD)悬浮溶液中加入摩尔比为1∶1的桂皮醛，搅拌或振荡数小时，混合物在4℃冰箱中存放12小时，使包合物结晶析出，过滤得包合物粗品用体积分数30％乙醇溶液洗2次，以便完全洗去吸附在β-CD表面的桂皮醛，60℃真空干燥3小时，即得包结物。此外，王四旺团队针对桂皮醛的药理作用进行了较系统的研究，证实其具有抗柯萨奇病毒和抗非小细胞肺癌等药理作用，并先后申报了中国发明专利[桂皮醛系列制剂及其制备工艺(200410073298.5)/肉桂油及其主成分肉桂醛抗肺癌的新用途(201210346901.7)]。

综上，桂皮醛具有诸多肯定的药理作用而且安全，为将其开发成治疗肿瘤、炎症(包括由细菌、病毒和真菌诱发的感染性疾病)、心脑血管和代谢等疾病的药物奠定了重要基础。但是，桂皮醛由于水溶性差、体内代谢不稳定，口服或静脉给药后迅速氧化为肉桂酸(cinnamicacid，CD)，使得桂皮醛在血中的浓度很低，血管外给药生物利用度不高(低于20％)，严重制约着桂皮醛的临床应用。

亚微乳(submicro emulsion)是以植物油为基质，由油相、乳化剂(磷脂)、水相制成粒径在100-1000nm范围的稳定的O/W型分散体系。药物可包封于油相和磷脂界面膜中，外观呈不透明的浑浊或乳状。作为一种新型药物转运系统，它可选择性地蓄积于炎症及肿瘤部位，使治疗药物在靶区浓度超出传统制剂的数倍至数百倍，明显提高疗效。同时能够延长药物的半衰期，减少药物在正常组织分布量，减轻不良反应，达到高效低毒的效果。

静脉注射亚微乳从载药与否的角度可分为两类：一类是以提供高能量与人体必需脂肪酸为目的的营养型静脉注射脂肪乳剂，它以植物油脂为主要成分，经加入乳化剂与注射用水而制成水包油型乳剂，可与氨基酸输液、维生素、电解质适当配伍，是一种比较理想的静注营养剂。各国静脉注射脂肪乳剂的处方基本相同，多以长链甘油三酸酯(LCT)为油相，精制天然卵磷脂为乳化剂，甘油为等渗剂，经高压均质制成的O/W型乳剂，如Intralipid、LiposynII、Lipofundin等。另一类是以提高难溶性药物的溶解度、减少静脉刺激性、提高药物靶向性等为目的制成的载药型静脉注射用脂肪乳剂。近年来上市的品种主要有地西泮、异丙酚、依托咪酯、前列腺素E、棕榈酸地塞米松和脂溶性维生素、前列地尔等静脉注射乳剂，它们多以Intralipid、LiposynII、Lipofundin脂肪乳注射液为基本处方改进制得。目前还有很多药物处于研究中，如盐酸布比卡因、鸦胆子油乳、粉防己碱、大蒜油、紫杉醇、伊曲康唑、两性霉素B、替拉扎特等。

羟基喜树碱对动物及人体实体瘤均有较好的疗效，但由于其水不溶、脂难溶的性质，使得目前市售羟基喜树碱注射液抗肿瘤活性降低、给药频繁，胃肠道不良反应严重，在一定程度上限制了其应用。将羟基喜树碱制成乳剂静脉给药后，显著延长了羟基喜树碱在体内的循环时间，同时显著改变了药物的组织分布，使得药物在吞噬细胞比较丰富的肝、脾内高浓度蓄积，在治疗RES系统肿瘤时能提高局部药物浓度，减小全身的毒副作用[吴泊.羟基喜树碱静脉注射脂肪乳的研究.硕士学位论文，2009]。

因此，本发明旨在创制一种注射用桂皮醛亚微乳新型制剂，使其在药物组成、制备方法等关键技术区别于现有制剂的基础上，同时具备高选择性和高效低毒特性，用于治疗肿瘤、炎症(包括由细菌、病毒和真菌诱发的感染性疾病)、心脑血管和代谢等疾病，以期产生巨大的社会和经济效益。

现有的专利文献CN201110246102.8公开了一种水包油型肉桂醛纳米乳药物，处方为每100克纳米乳中表面活性剂的重量百分比为18.09-37.19％，助表面活性剂的重量百分比为0-6.86％，油的重量百分比为0-8.62％，肉桂醛的重量百分比为0.10-8.31％，余量为蒸馏水。其制备方法并没有明确写出，只是在实施例中提到制备方法为先将吐温-80和无水乙醇、1，2-丙二醇混合、搅拌均匀，将肉桂醛和维生素E油混合、搅拌均匀，然后将这两个溶液混合，搅拌均匀，再缓慢向混合物中滴加蒸馏水，边加边搅拌，加蒸馏水和搅拌过程中该混合物体系会出现由稀变粘稠，又由粘稠变稀的一系列变化，直至形成水包油型纳米乳。该专利文献公开的是肉桂醛纳米乳制剂，其除了使用维生素E作为油相之外，还使用了吐温-80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油等表面活性剂；此外，还加入了一定的助表面活性剂，所制备的产品与我们申请制备的注射剂亚微乳在配方、制备工艺、剂型等方面具有本质区别。另外，该专利文献所制备的肉桂醛纳米乳制剂用于外用和口服，其主要用途为抗菌；而我们申请制备的制剂给药途径为静脉注射，主要用于肿瘤等疾病的治疗，配方中不含吐温类表面活性剂，有效克服了吐温可能产生的过敏性和溶血性[张美玉.中国中药杂志，2011；36(14)：1911-1915]和生殖毒性[王庆利等.毒理学杂志，2006；20(4)：262-264]等不良反应。

发明内容

本发明针对桂皮醛水难溶、生物利用度低的特点，提供一种水包油型、具有良好水溶性、制剂稳定并兼优缓释性能的桂皮醛亚微乳注射剂。

本发明的技术方案：一种桂皮醛亚微乳注射剂，包含桂皮醛、油、乳化剂、稳定剂、抗氧化剂。油的重容百分比为5.1％-30.6％，乳化剂的重容百分比为0.5％-3.0％，渗透压调节剂的重容百分比为1％-4％，稳定剂的重容百分比为0.1％-0.3％，抗氧化剂的重容百分比为0.05％-0.2％；其余成分为蒸馏水。

所述亚微乳注射剂pH值为6.0-8.0，优选为6.5-7.5。亚微乳注射剂的平均粒径范围为150-200nm。

所述的油为精制大豆油、花生油、鱼油、椰子油、麻油、中链甘油单酯、中链甘油双酯、中链甘油三酯中的1种或1种以上。

所述的乳化剂为大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，其中磷脂酰胆碱的含量为80％以上。

所述的稳定剂为油酸或其盐、胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐的一种或一种以上。

所述的渗透压调节剂为丙三醇。

所述的抗氧化剂为维生素E。

本发明提供一种桂皮醛亚微乳注射剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)油相的制备：油中分别加入乳化剂和桂皮醛，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)水相的制备：将稳定剂和渗透压调节剂加入到水中，搅拌使其溶解，作为水相；

(3)初乳的制备：将步骤(1)油相加入步骤(2)水相中，高速剪切分散，形成初乳；

(4)高压匀化：将步骤(3)初乳调pH至6.0-7.5，高压匀化，得精乳；

(5)灌装：将精乳灌封至100ml西林瓶中；

说明：A.步骤(1)-(5)均在氮气保护下操作；

B.将灌装好的精乳在高压灭菌锅中进行灭菌。

C.步骤(3)所述的高速剪切分散时间为10-30分钟，剪切速度为8000-20000rpm，温度为55-65℃；步骤(4)所述的高压匀化压力为600-2000bar，匀化次数为5-8次，温度为15-30℃；步骤(7)所述的灭菌条件为121℃，15分钟。

本亚微乳注射剂主要特征在于：(1)本亚微乳注射剂制备工艺科学、适于工业化生产；(2)配方原料来源丰富、使用安全且价格便宜，直接成本低廉；(3)本亚微乳注射剂的粒径为150-200nm，包封率高(大于97％)，制剂稳定性好；(4)生物利用度较原料药平均提高3倍，药物活性以抗肿瘤作用为例平均提高5倍。

附图说明

图1桂皮醛亚微乳注射剂成品照片。

图2桂皮醛亚微乳注射剂粒径测定分布结果示意图。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何形式限制本发明。

(一)实施例

实施例l：桂皮醛亚微乳注射剂的制备

【处方】桂皮醛1.0g，精制大豆油20.7g，蛋黄卵磷脂2.4g，丙三醇5.4g，油酸钠0.2g，维生素E0.2g，注射用水加至200ml

【制备方法】

(1)油相的制备：将精制大豆油20.7g加热至55℃，加入蛋黄卵磷脂2.4g溶解，加入桂皮醛1.0g，搅拌使其溶解；

(2)水相的制备：将油酸钠和丙三醇加入水中溶解，加热至55℃；

(3)初乳的制备：将步骤(1)油相加入步骤(2)水相中，温度55℃，高速剪切分散，剪切速度20000rpm，时间10分钟，形成初乳，快速降温至15-30℃；

(4)高压匀化：将步骤(3)初乳经高压匀化3次，压力1300bar，温度控制在20℃；

(5)灌装：将精乳灌封至西林瓶中；

(6)步骤(1)-(5)均在氮气保护下操作；

(7)将灌装好的精乳在高压灭菌锅中进行灭菌。

以下通过药效学实验进一步说明本发明所述药物的有益效果。

实施例2：桂皮醛亚微乳注射剂的中试制备

【处方】桂皮醛10.0g，精制大豆油200.0g，蛋黄卵磷脂24.0g，丙三醇50.0g，油酸钠2.0g，维生素E2.0g，注射用水加至2000mL

【制备方法】同实施例1。

实施例3：桂皮醛纳米粒的制备

【处方】桂皮醛8.0g，吐温-8064.0g，无水乙醇6.0g，1，2-丙二醇4.0g，维生素E4.0g，注射用水120mL

【制备方法】按照欧阳五庆等(一种水包油型肉桂醛纳米乳药物)制备方法制备。

(二)桂皮醛亚微乳注射剂理化性质检测及其优效特性比较研究

1、亚微乳注射剂的理化指标

(1)亚微乳的稳定性：经影响因素试验，发现所制备的亚微乳注射剂(说明书附图1：成品照片)在高温(60±2℃)，高湿(RH75±5％，25±2℃)，强光照射(4500±500LX)条件下，10天内均稳定。

(2)亚微乳粒径：取本品，用蒸馏水稀释1000倍后，用激光粒度测定仪测定粒径，(中国药典2010年版二部附录IX E)，粒径应在150-200nm之间(说明书附图2：桂皮醛亚微乳注射剂粒径测定分布结果示意图)。

(3)亚微乳的包封率：取本品500μL，用超滤离心管5000rpm离心10min，取滤液至10mL容量瓶中，用乙腈定容，吸取10μL进样。

照含量测定项下肉桂醛的测定方法进行测定，用C₁₈柱为填充剂，乙腈-水-乙酸(60∶40∶0.05)为流动相，紫外分光检测器288nm检测。所测得的包封率应在97％以上。

2、亚微乳注射剂中桂皮醛含量

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。

(1)色谱条件与系统适用性试验：用C₁₈柱为填充剂，乙腈-水-乙酸(60∶40∶0.05)为流动相，紫外分光检测器288nm检测。

(2)标准曲线的制备：取肉桂醛10mg，置于100ml棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即为对照品贮备溶液(此液在-20℃下保存，可使用2个月)。精密量取对照品贮备溶液1mL、2mL、5mL、10mL和20mL，分别置50ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取上述五种对照品溶液各10μL注入液相色谱仪中，以浓度和对应的峰面积计算回归方程。

(3)供试品溶液的制备：用内容量移液管精密量取本品1mL，置250mL容量瓶中，用上述混合溶液稀释至刻度，摇匀。

(4)测定法：精密量取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，由回归方程计算供试品含量。

(5)结果：亚微乳注射剂中桂皮醛含量范围为0.3％-1.2％。

3、细菌内毒素和无菌检验

(1)细菌内毒素：取本品，用0.1moL/L盐酸溶液调节pH值至6.5-7.5，依法检查(中国药典2010年版二部附录XIE)，每1mL中含内毒素量不得超过0.5EU。

(2)无菌：取本品不少于2瓶，用薄膜过滤法处理后，依法检查(中国药典2010年版二部附录XIH)，应符合规定。

4、桂皮醛亚微乳注射剂与桂皮醛纳米乳药理活性评价

已证实桂皮醛具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、解热、镇痛等多种药理作用，这里仅采用实施例2-3制备的桂皮醛亚微乳注射剂、桂皮醛纳米乳剂等和常规共识抗肿瘤药理实验技术与方法，评价其药理活性作用。

(1)桂皮醛亚微乳注射剂与桂皮醛纳米乳对A549肿瘤细胞抑制活性：取对数期生长的A549肿瘤细胞，用胰酶消化细胞，以含100mL/L小牛血清的RPML1640培养液配成1×10⁵个/mL的细胞悬液，接种在96孔板中，每孔接种150μL，于37℃-5％CO₂恒温培养箱中培养24小时，随即每孔中加入200μL含不同浓度桂皮醛的培养液，阳性药对照组加多柔比星，阴性对照组加入与实验组相同量的不含桂皮醛的亚微乳注射剂制剂，每组设6个平行孔，于37℃-5％CO₂恒温培养箱中培养48小时。弃去上清液，于终止前4小时每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，37℃-5％CO₂恒温培养箱中继续培养4小时。小心弃去上清液，加入150μL/孔二甲基亚砜，在振荡器上振荡数分钟，待结晶溶解后在波长为570nm的酶标仪上测A值，计算细胞生存率(表1)。

表1桂皮醛亚微乳注射剂等制剂对A549肿瘤细胞生存率的影响

从实验结果中可以看出，桂皮醛亚微乳注射剂和纳米乳剂对A549细胞的增长起到了抑制作用，并显现出浓度依赖性；但在浓度相同时(25μg/mL)，桂皮醛亚微乳注射剂与多柔比星对肿瘤细胞的抑制率无明显差异(p＞0.05)；而桂皮醛纳米乳剂显著低于多柔比星和桂皮醛亚微乳注射剂的疗效(p＜0.05)。

(2)桂皮醛亚微乳注射剂与桂皮醛纳米乳对多种癌细胞作用的IC₅₀值：取对数生长期的ECA-109、HCT-116、HEPG-2、HT-29、MNK-45、PANCA-1、SGC-7901、SW620、TCA-8113、A549、Hela、MBAMD231、PC12(鼠源)、PC3、PC3M、U87等人源性肿瘤细胞悬液100μL以5000个/孔密度种入96孔板中，37℃、5％CO₂条件培养过夜后，用培养液分别稀释肉桂醛原药和肉桂醛亚微乳注射剂7-9个剂量组，另设顺铂为阳性对照药和DMSO溶剂对照，吸去上清后每孔加药100μl，每个浓度设8复孔。分别孵育24h后，加入20μl的5mg/mL MTT，孵育4h，吸去上清后加入DMSO150μl/孔，摇床震荡15min，使晶体完全溶解，用酶标仪在490nm波长处测定各孔光吸收值(OD)。按以下公式计算：细胞存活率％＝(A_试验组-A_空白)/(A_正常组-A_空白)×100％和IC₅₀(表2)。表2结果所示：(1)桂皮醛原料药及其亚微乳注射剂和纳米乳剂对16种人源

表2桂皮醛原料药及其亚微乳注射剂和纳米乳剂抑制肿瘤细胞生长的IC₅₀值

注：CAS号：104-55-214371-10-9；分子式：C₉H₈O；分子量：132.16

性肿瘤细胞具有显著抑制活性；(2)桂皮醛原料药对消化系统肿瘤细胞的抑制活性略强于亚微乳注射剂(1-2倍)和纳米乳剂(1-3倍)；(3)亚微乳注射剂对消化系统以外的肿瘤细胞的抑制活性则显著强于桂皮醛原料药(5-18倍)和桂皮醛纳米乳剂(1-8倍)。

(3)桂皮醛亚微乳注射剂与桂皮醛纳米乳剂对裸鼠A549细胞移植瘤的作用：按照常规文献[黄敬群，等.解放军药学学报，2006；22(5)：343-346]方法，将1×10⁶A549细胞/0.1mL接种于裸鼠前肢腋窝皮下，自然生长7天使用游标尺检出瘤体达到0.3cm³的模型鼠随机分组(表3)，按实验设计桂皮醛原料药及其制剂分别灌胃(ig.三组)和腹腔注射(ip.三组)给药，对照组给予等容量生理盐水(ip.)；溶媒组分别给予等容量原料药、亚微乳剂和纳米乳剂的溶媒(ip.)，连续给药21天动物称量体重、颈椎脱臼处死、完整剥去瘤组织(块)称重，计算瘤重抑制率。表3结果所示，桂皮醛原料药、亚微乳注射剂和纳米乳剂分别灌胃和腹腔给药，均

表3桂皮醛亚微乳注射剂和纳米乳剂对裸鼠A549细胞移植瘤的瘤重抑制率()

^##P＜0.01，与对照组比较。*实际参与统计的动物数为9只，1只动物死亡原因与试药安全性无关。

具有显著抑制裸鼠A549细胞移植瘤生长作用(^##P＜0.01，与对照组比较)；而桂皮醛亚微乳注射剂各剂量组的瘤重抑制率明显优于桂皮醛原料药和桂皮醛纳米乳剂。

5、桂皮醛亚微乳注射剂与桂皮醛纳米乳剂生物利用度比较研究

经比较研究证实，桂皮醛亚微乳注射剂大鼠体内生物利用度比桂皮醛原料药提高3.4倍，桂皮醛纳米乳剂比桂皮醛原料药仅提高1.9倍；说明桂皮醛亚微乳注射剂优于纳米乳剂。

6、桂皮醛亚微乳注射剂与桂皮醛纳米乳剂对小鼠LD₅₀比较研究

比较研究证实，桂皮醛原料药、亚微乳注射剂和纳米乳剂给小鼠尾静脉注射的LD₅₀分别是81.8mg/kg、259.3mg/kg和134.9mg/kg。结果可见，桂皮醛亚微乳注射剂的毒性比原料药降低3.17倍，而桂皮醛纳米乳剂比桂皮醛原料药仅提高1.65倍。说明桂皮醛亚微乳注射剂优于桂皮醛纳米乳剂。

Claims (9)

1.一种水包油型桂皮醛亚微乳注射剂药物，其特征在于该亚微乳注射剂的粒径在150-200nm，由下列组分的原料组成：包含桂皮醛、油、乳化剂、稳定剂和抗氧化剂。油的重容百分比为5.1％-30.6％，乳化剂的重容百分比为0.5％-3.0％，渗透压调节剂的重容百分比为1％-4％，稳定剂的重容百分比为0.1％-0.3％，抗氧化剂的重容百分比为0.05％-0.2％。其余成分为蒸馏水。

2.根据权利要求1所述的桂皮醛亚微乳注射剂，其特征在于所述的油为精制大豆油、花生油、鱼油中的1种或1种以上。

3.根据权利要求1所述的桂皮醛亚微乳注射剂，其特征在于所述的乳化剂为大豆磷脂或蛋黄卵磷脂，其中磷脂酰胆碱的含量为80％以上。

4.根据权利要求1所述的桂皮醛亚微乳注射剂，其特征在于所述的稳定剂为油酸或其盐、胆酸或其盐、脱氧胆酸或其盐的1种或1种以上。

5.根据权利要求1所述的桂皮醛亚微乳注射剂，其特征在于所述的渗透压调节剂为丙三醇。

6.根据权利要求1所述的桂皮醛亚微乳注射剂，其特征在于所述的抗氧化剂为维生素E。

7.一种制备桂皮醛亚微乳注射剂的方法，所述的方法包括以下步骤：

(1)油相的制备：油中分别加入乳化剂和桂皮醛，搅拌使其溶解，作为油相；

(2)水相的制备：将稳定剂和渗透压调节剂加入到水中，搅拌使其溶解，作为水相；

(3)初乳的制备：将步骤(1)油相加入步骤(2)水相中，高速剪切分散，形成初乳；

(4)高压匀化：将步骤(3)初乳调pH至6.0-7.5，高压匀化，得精乳；

(5)灌装：将精乳灌封至100毫升西林瓶中；

(6)步骤(1)-(5)均在氮气保护下操作；

(7)将灌装好的精乳在高压灭菌锅中进行灭菌。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于骤(3)所述的高速剪切分散时间为10-30分钟，剪切速度为8000-20000rpm，温度为55-65℃；步骤(4)所述的高压匀化压力为600-2000bar，匀化次数为5-8次，温度为15-30℃；步骤(7)所述的灭菌条件为121℃，15分钟。

9.桂皮醛亚微乳注射剂可作为人类或生物的肿瘤、炎症(包括由细菌、病毒和真菌诱发的感染性疾病)、心脑血管和代谢等疾病治疗药物具有广泛的应用前景。