CN104053784B - 进行定量测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于确定分析物分子或粒子的浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室，所述(N)隔室包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分分子或粒子提供可测量的信号并且所述分子或粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，以及涉及用于本发明的方法的装置，本发明方法的应用，在用于本发明方法样品架和试剂盒。

Description

进行定量测定的方法

技术领域

本发明涉及用于确定粒子的浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室，所述(N)隔室包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分粒子提供可测量的信号并且粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，以及在本发明的方法中使用的装置，本发明方法的应用，在本发明的方法中使用的样品架和试剂盒。

背景技术

在分析化学中，定量分析物粒子浓度的标准(或“类似的”)方法为：校准其如何关联物理量的可测量振幅，例如光穿过样品的吸收度。然后将所述分析物粒子的浓度估值E(C)恢复为所述信号的函数。

聚合酶链反应(PCR)构成用于定量核酸浓度的现有技术的一种方法。PCR程序一般允许复制DNA链的片段。代表性地，所复制的片段长度不超过10k碱基对(bp)，并且在定量PCR中，通常复制较短的片段。根据现有技术的方法，所复制的DNA副本例如用仅在与双链DNA形成复合物(染料-DNA复合物)后显示强荧光的荧光染料(例如SYBR Green或EvaGreen.[Advan.Physiol.Educ.29:151-159,2005])进行标记以提供可测量的信号(荧光水平)。所述荧光水平随着DNA片段的增加成比例地增加。

当靶DNA片段存在于样品中时，它们的数目在所述PCR过程期间增加得非常快，作为已完成循环数的函数几何级地增加。副本数目的快速增加在制备应用中以及在旨在检测靶DNA存在的定性诊断测定(例如，作为特定微生物在样品中存在的证据)中是吸引人的。同时，靶DNA的复制的指数增长(作为循环数的函数)大大妨碍了进行PCR过程前的样品中的靶DNA副本的初始数的测定。根据现有技术，所谓的real-time PCR提供了方法，其中在每个PCR循环后检测样品的荧光活性(即，信号强度)，随后通过比较作为时间函数的样品的荧光强度与校准曲线来估计样品中的初始DNA浓度。这些程序的准确性是有限的。它们的额外的缺点为对于每个定量必须进行额外的比较(参照)实验。

在1999年，Vogelstein和Kinzler提出一种使用观察者的能力检测二元随机函数k(C)的数字测定，当已检查的体积发生于包含至少一种分析物粒子时采取正值(k＝1)或者否则采取负值(k＝0)。根据“正”隔室的部分(即，产生k＝1的那个)估计浓度。由于所述测定需要存在的分析物粒子的强扩增，所以它们的关键应用通常在定量PCR或酶联免疫吸附测定(ELISA)中。

根据现有技术的数字PCR方法，将总体积V的PCR混合物(样品和试剂)分至等体积(v＝V/N)的N个隔室。然后，在全部隔室中(优选同时)进行PCR反应循环，例如通过温度的周期性变化。随后，在每个隔室分别完成PCR过程后(终点测量)测量代表性地荧光强度，并且对于其中完成反应的隔室的数目，计数产生“正”信号的隔室并且正隔室数K连同N用于计算所测试样品中的靶DNA副本的实际初始数目M的估值E(M)。

数次测定概念的发展在分析化学中提供了新范式。它允许绝对定量而无需实验装置(set-up)的校准。并且，它得益于简化的实验室程序，即终点测量，以及解释实验结果所需要的相对简单的数学工具。然而，现有技术的数字测定是受限制的。

1.在测定中，有待确定的分析物粒子的最大数目M与隔室的数目N成正比。在许多应用中以及诊断性定量测定的潜在应用中，动态范围的跨度(Ω＝C⁺/C^-)(C⁺代表测定中的分析物粒子的估计浓度的上限以及C^-代表下限)较大，例如等于1百万或更多。为了达到标准数字PCR程序中的这样大跨度的动态范围，根据不利地忽略了在非常小浓度的小的精确度的本领域的知识状态所述样品必须被分至适当大量的隔室(在所述实施例中)，分至多达200,000个隔室或者实际上如下文中的描述所示，甚至600,000个隔室中。但是将样品分至这样巨大数目的隔室中可能是不利的，因为这样的测定需要执行专业的、复杂的和昂贵的设备。尤其是，旨在分配、扩增和检查好几万或数十万或数百万的隔室的测定的设计需要从许多小体积的微加工、自动化以及快速和感光检测的昂贵技术。

此外，通过现有技术的数字测定所实现的精确度和动态范围不能独立地调整(tuned)，缩小了应用的范围并提高了测定的技术成本。因此，当使用现有技术的数字测定使用少数N的隔室时，在缩小范围的浓度获得高的精确度(低标准偏差)是不可能的。

现有技术提高了增加测定的动态范围跨度的解决方法以及通过将传统的数字定量测定与不同的动态范围结合而减少隔室的数目[Shen,F.；Sun,B.；Kreutz,J.E.；Davydova,E.K.；Du,W.；Reddy P.L.；Joseph,L.J.；Ismagilov,R.F.,“MultiplexedQuantification of Nucleic Acids with Large Dynamic Range Using MultivolumeDigital RT-PCR on a Rotational SlipChip Tested with HIV and Hepatitis C ViralLoad”,J.Am.Chem.Soc.,Article ASAP(X2011)]。所述解决方法依赖同时进行对多组隔室的测定。属于每组的隔室具有相同的体积。在引用的实例中，使用N_z＝4组，每组Nj＝160个隔室(j＝1至4)，四组的每组中的隔室体积等于V_j＝1、5、25和125nL。所述程序在于i)将所述样品分至组和隔室中，ii)同时进行信号扩增，iii)在N_z组的每组中分别计数正信号的数目K_j以及iv)计算样品中的粒子的最可能的初始浓度。所述计算是费劲的和要求高的，因为反复计算乘积(product)的需求其中乘法算子表示对于N_z隔室家族的每个所计算的N_z项的乘积，每个项包括观察来自j-th家族的K_j正信号的可能性。结果的计算需要所测试的每个的所述乘积，在测试动态范围内的C的假设值的迭代计算，直到找到对于其上述乘积假定最大值的值C。在来自样品的信号的每个测量后必须重复上述程序，其干扰了测试结果的分析，需要足够快的电子设备(device)或者延长获得样品中的粒子数目的估值所需要的时间。上述程序在通过所述隔室在一个组内具有相同的体积，但是对于每两个不同的组具有不同体积表征的大数目(例如，十个，或数十个，或百个或更多)组的隔室的情况下将特别肯定不利。

此外，WO2012/100198A2公开了用不同的体积进行数字测量并因此拓宽了动态范围的方法。

尽管前述数字测定提供了动态范围的增加，然而所述分析是非常费劲的并且隔室的数目依然比较高。因此，提供更容易被分析和允许使用较小数目的隔室以降低对于制备样品架，对于分配样品、扩增和检测的程序，对于实现这些任务的装置以及对于测定结果的分析的技术需求的方法将是可取的。

因此，存在提供用于确定粒子浓度估值E(C)的需要，其中期望的动态范围和期望的测定精确度可被独立地调整，和/或数学分析更容易，和/或其中对于预定的动态范围和预定的标准偏差

a)可调整，优选地减少包含预定样品体积的隔室的总数目(N)和/或

b)可调整，优选地减少全部(N)隔室中的包含样品、适合于将至少部分粒

子扩增至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组

成的混合物的总体积和/或

c)每个(N)隔室中的包含样品、适合于将至少部分粒子扩增至可测量信号

的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的体积，

优选地最小或最大体积可被预先确定。

发明内容

前述需求部分或全部借助于要求专利保护的发明主题来满足。在从属权利要求、发明详述和/或附图中特别描述了优选的实施方案。

因此，本发明的第一个方面涉及用于确定粒子浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室，存在于任一个(N)隔室的至少部分粒子提供可测量的信号以及粒子的估计浓度E(C)为测量信号的函数，其特征在于，所述方法包含以下或由其组成：

a)确定分离的隔室的数目(N)，其中数目(N)小于或等于函数的值

其中(A)表示为整数6的实数，其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定上限，其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定下限，其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值E(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

b)确定调制因数(z_i)，其中(z_i)为至少部分或全部(N)隔室中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数以及将所述样品分至(N)隔室，其中两个或更多(N)隔室的至少部分或全部包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，其中(i)表示由整数0至N-1表示的(N)隔室的索引号，并且其中(v_i)表示体积以及(d_i)表示隔室(i)中的样品的稀释因数。

因此，本发明的第二个方面涉及供在依照本发明的方法确定粒子的浓度中使用的装置，其特征在于，所述装置被配置为：

a)确定分离的隔室的数目(N)，其中数目(N)小于或等于函数的值

其中(A)表示为整数6的实数，其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定上限，其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定下限，其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

b)确定调制因数(z_i)，其中(z_i)为至少部分或全部(N)隔室中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，这样两个或更多(N)隔室的至少部分或全部包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，其中(i)表示由整数0至N-1表示的(N)隔室的索引号，并且其中(v_i)表示体积和(d_i)表示隔室(i)中的预定体积的样品的稀释因数。

因此，本发明的第三个方面涉及本发明方法或本发明装置的使用，用于

a)调整，优选地减少包含预定样品体积的隔室的总数目(N)和/或

b)调整，优选地减少全部(N)隔室中的包含样品、适合于将至少部分粒子扩增至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的总体积和/或

c)预先确定用于将预定的样品体积分至(N)隔室中的调制因数(z_i)，优选地最小或最大适合的调制因数(z_i)。

因此，本发明的第四个方面涉及供在本发明的方法中使用的样品架，其特征在于，所述样品架被配置为：

a)包含预定数目(N)的隔室或由其组成，其中所述数目(N)小于或等于函数的值

其中(A)表示为整数6的实数，其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定上限，其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定下限，其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

b)其中所述(N)隔室被配置为包含预定的样品体积与预定的调制因数(z_i)，其中(z_i)为至少部分或全部(N)隔室中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，这样两个或更多(N)隔室的至少部分或全部包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，其中(i)表示由整数0至N-1表示的(N)隔室的索引号，并且其中(v_i)表示体积和(d_i)表示隔室(i)中的样品的稀释因数。

因此，本发明的第五个方面涉及用于确定粒子浓度的，优选地用于依照本发明的方法确定粒子浓度的包含本发明的样品架和适合于将包含在样品架的隔室中的至少部分粒子扩增至可测量的信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种适合的稀释剂的试剂盒。

前述的本发明的实施方案可(到现在为止考虑到技术专家它是合理的)包含优选的本发明实施方案的任意可能的组合，其在下文中以及尤其在从属权利要求中被公开。

附图说明

图1a)，1b)和1c)：这些图显示可用包含相同隔室的测定和本发明的方法取得的动态范围和精确度的组合，根据本发明产生给定的动态范围和精确度所需要的隔室数目N的比较。

图2a)和2b)：这些图显示由本发明的定量测定提供的动态范围C⁺/C^-＝Ω和相对标准偏差σ以及等比序列的公比x与根据本发明的隔室的副本数目N′之间的关系。

图3a),3b),3c),3d)：来自根据本发明的测定的有效条带(active stripe)、微态(microstate)和估值精确度的发明构思。

图4a),4b),4c)：这些图显示根据本发明的方法分析来自隔室的信号的两种不同方法(求和和微态)的粒子浓度估值E(C)的标准偏差。

图5a)和5b)：这些图显示在根据本发明设计的两种不同测定中前10(图5a)和前90(图5b)最频繁出现的微态的概率分布p(μ|C)。

图6：该图显示用于本发明的定量测定的粒子初始浓度C＝M/V的校准修正函数f_corr＝C/E(C)。

图7a),7b),7c)：该图显示作为粒子数目M的函数的、具有权重w_i＝1/d_i的值的加和K＝Σw_i·k_i(图7a)；该图显示作为K的函数的粒子初始浓度的估值E(C)的值(图7b)；该图显示作为用于本发明的定量测定的粒子初始浓度C＝M/V的对数的函数的估值E(C)的相对标准偏差σ(C)(图7c)。

图8a)和8b)：这些图显示对于本发明的测定和作为本发明方法性能的实验和数值验证的7个或8个实验的100蒙特卡洛(MC)模拟的结果。

图9a)和9b)：这些图显示作为来自包含相同隔室的测定的信号的函数并被用于分析样品中的有限数目的粒子的浓度(用非独立随机变量分析)和用于分析作为储库(reservoir)缩放浓度的样品中的粒子浓度(相同的和独立随机变量)的相对标准偏差，动态范围和浓度估值。

具体实施方式

发明人已意外地发现，通过利用本发明的实施方案(A、B、C、D、E和/或F部分，其中A、B、C、D、E和F部分的优选的发明实施方案可独立地彼此结合)，尤其是本发明的方法，本发明的装置，本发明的样品架和/或本发明的试剂盒，构成本发明基础的一个或多个需求可被满足(特别参见图1a)，1b)和1c)和详细的附图说明中的各部分)。

通常，本发明依赖如果各个分区中的靶粒子数目的估计值是不同的，那么可以优选和显著减少以定义范围的浓度与规定的精确度和规定的准确性进行测定需要的分区数目的意外发现。形式上，第i个隔室中的粒子的估计数为m_i＝C·d_i·v_i]其中v_i意为第i个隔室的体积，d_i意为第i个隔室的稀释因数以及C为样品中的未知的浓度。本发明的真髓在于施加值m_t彼此不等，优选它们基本上是不同的，以及最优选它们大约跨越与浓度的必需范围相同的值范围的需求，对于其所述测定应提供靶粒子的初始浓度的精确估计，允许优选减少以定义范围的浓度和规定的精确度进行粒子初始数目的定量测定需要的分区数目。

本发明的发明人已意外地发现，通过依照创造性地已确定的隔室数目N和已确定的调制系数z_i分配样品，所述测定动态范围C⁺/C^-的跨度和粒子的浓度估值E(C)的相对标准偏差(σ_Max)的最大值可各自被预先确定，或者换言之被控制或调整(特别参见图1a)和详细的附图说明中的各部分)。

本发明的粒子浓度估值E(C)的确定通常包括样品中的粒子的浓度估值E(C_sample)的确定以及储库中的粒子的浓度估值E(C_reservotr)的确定或样本(specimen)中的粒子的浓度估值E(C_specimen)的确定，其在下文中进行了详细地解释。浓度估值E(C)为各来源的粒子的估计数目E(M)的函数，例如，样品体积，储库体积或样本体积。因此，假使关于本发明使用粒子的浓度估值，那么这一术语通常包括样品中的粒子的浓度估值E(C_sample)，储库中的粒子的浓度估值E(C_reservotr)和样本中的粒子的浓度估值E(C_specimen)，除非另有说明。

因此，在优选的实施方案中，本发明涉及样品中的粒子浓度的确定E(C_sample)＝E(M)/V_sample，其中E(M)为V_sample体积的样品中的粒子的估计数目。在该程序中，所述体积的样品被分配并与适当体积的试剂混合，以允许将在隔室中存在的粒子扩增至可测量的信号并获得期望的体积v_i和稀释因数d_i＝(m_i/v_i)/(M/V_sample)，其中m_i为第i个隔室中的粒子的估计数目。系数(M/V_sample)和(m_t/v_t)可被编码为样品中的粒子浓度(C_sample)和第i个隔室中的粒子浓度(C_sample)，然而由于样品中由有限数目的粒子，并且一个隔室中的粒子的放置影响在另一个隔室中找到它的概率，所以我们需要理解没有真实的浓度，因为它们仅表示由样品或隔室的体积衡量的分子的估计数目。如将要在下文讨论的，分析来自隔室的信号的适当的(和现有技术中已知的)方法基于隔室中粒子放置的相依随机变量。这样的分析产生样品中的粒子的估计数目E(M)，其可表示为样品中的粒子的估计浓度E(C_sample)。

在另一个优选实施方案中，优选地，从样本的体积V_spectmen制备含有感兴趣粒子的样品体积V_smaple(例如通过粒子的分离或纯化)。在这种情况下，样品中的粒子数目的估值E(M)与样本中的粒子数目的估值相同。这些可由样品中的粒子的估计浓度E(C_sample)＝E(M)/V_sample或由样本中的粒子的估计浓度(C_specimen)＝E(C_sample)(V_sample/V_specimen)＝F(M)/V_specimen表示。

在本发明的另一个优选实施方案中，体积V_specimen的样本可来自更大体积的储库(例如有机体或环境)。估计所述储库中的粒子浓度E(C_reservatr)也许是感兴趣的，并且借助于本发明是可能的。在这种情况下，将通过分配以及任选地还有稀释样品而形成的粒子在隔室中的放置作为一组独立随机变量。在任意给定的隔室中发现粒子的概率(在该方法中)仅为隔室的体积，样品在隔室中的稀释比例以及样品中的粒子浓度C_sample(其反过来等于储库中的粒子浓度)的函数，通过样品和样本的体积的适当系数进行衡量。作为基于来自隔室的信号的计算结果，本发明允许恢复样品中粒子的浓度估值E(C_sample)。储库中粒子的浓度估值与样本中粒子的浓度估值相同：E(C_reservotr)＝E(C_specimen)＝E(C_smple)(V_sample/V_specimen)。

或者，储库中的粒子浓度估值E(C_reservotr)还可优选地通过转换从基于因变量的计算获得的样品中的粒子数目的估值F(M)来确定。在大多数通用术语中，储库中浓度的概率分布ρ(C_reservotr)等于样品中的粒子数目的概率分布的积分转换ρ(M/V_sample)。在简化的方案中，估值E(C_reservotr)可优选地通过由修正函数f_corr(E(M))乘以E(M)/V_sample以及通过由系数V_sample/V_specimen衡量它而确定。

因此，本发明的确定粒子浓度估值E(C)的方法也比现有技术有利，因为它提供了对于确定样品中的粒子浓度估值E(C_sample)的解决方案，表示为在隔室间非独立分布的粒子的有限数目的估值除以样品体积，或者对于确定储库(样本从其采集，样品由其制备)中的粒子浓度估值E(C_reservotr)的解决方案，用基于它们在隔室中的独立放置从粒子的浓度估值计算的E(C_reservoir)。

本发明A部分的实施方案：

本发明为特别优选的，因为它教导了如何改变第i个隔室中的样品的体积和/或稀释因数，并因此允许独立地调整定量测定的动态范围和精确度。

此外，本发明方法教导了如何确定隔室的数目(N)和要以所述方法估计的浓度(c)区间的预定上限(C⁺)和下限(c^-)以及预定的粒子浓度估值E(C)的最大可允许的相对标准偏差(σ_MAX)的调制因数(z_i)，以便

a)可调整，优选减少包含预定的样品体积的隔室的总数(N)，并且例如可实现具有良好精确度和小的N的宽动态范围(例如Ω＝10⁹与σ<50％可用N＝60来实现)，ii)具有高精确度和小的N的宽动态范围(例如Ω＝10⁹，σ<10％，N＝1615)或者iii)具有高精确度和小的N的窄动态范围(例如具有用N＝80获得σ<30％和用N＝631获得σ<10％的益处的Ω＝10³)和/或

b)可调整，优选减少全部(N)隔室中的包含样品、适合于将至少部分粒子扩增至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的总体积和/或

c)每个(N)隔室中的包含样品、适合于将至少部分粒子扩增至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的体积，优选地最小或最大体积可被预先确定。

此外，本发明的方法优选地相对于进行数学分析更容易，并可优选地在进行本发明程序的扩增、测量和分配以及确定浓度的步骤之前提供关于浓度估值E(C)的精确度的反馈，其将在下面的描述中进一步地相对于有效条带和微态μ的发明构思进行详细地描述。

关于本发明方法的步骤a)，隔室的数目(N)表示0至N-1的整数，其中所述整数通常依照给定的函数预先确定，其中所述整数大于所述函数的真实结果，优选地，其中所述整数为大于所述函数的真实结果的最小整数。

在本发明方法的步骤b)中，调制因数(z_i)的值优选基于良好定义的幂序列，指数序列，优选地等比序列；多项式序列或者基于在隔室组中的分布(优选地通过高斯分布预先确定的)或者它们的组合进行确定。更优选地，调制因数(z_i)的值基于指数序列，比如等比序列(表示术语等比数列的后面的隔室的体积和或稀释(v_id_i～eⁱ))进行确定，从而可获得动态范围C⁺/C^-内的关于粒子的估计浓度E(C)的统一的小数精确度。在下面的描述中还公开了进一步优选的实施方案。一般地说，某组乘积v_id_i的值可通过索引i的偏差范围内的非统一的任意函数进行确定，并且可为测定的动态范围、测定的精确度和测定和其技术实现的其它重要参数的函数。

本发明的方法通常适合于确定在隔室中任选地在适当的扩增后表现出适当的测量信号的任意粒子的浓度。在优选的实施方案中，本发明的方法可用于确定优选地选自由病毒，细菌，核酸(NA)，优选地脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，肽，蛋白质，或另外的粒子，或纳米粒子或胶体粒子或它们的组合组成的组的适当的粒子。

本发明的方法更普遍适用于根据现有技术的粒子浓度估值E(C)的所有定量测定方法(例如分析和/或诊断定量测定)，其中存在于任意(N)隔室的至少部分粒子提供可测量的信号或者被扩增以提供通过普通程序的可测量信号，并且粒子的估计浓度E(C)为通过普通统计模型确定的测量信号的函数。

优选地，本发明的方法适用于扩增存在的发明合适的粒子至可测量的信号的测定，优选地，其中所述粒子用聚合酶链反应(PCR)进行扩增，优选地包括周期性温度变动；环介导等温扩增法(LAMP)；滚环扩增(RCA)；级联滚环扩增(级联RCA)；解旋酶依赖的扩增；基于核酸序列的扩增(NASBA)；切口酶扩增反应(NEAR)；单分子酶联免疫吸附试验(数字ELISA)；或用于将存在的粒子扩增至可测量信号的任何其它程序，或它们的组合。

关于本发明的粒子浓度估值E(C)的确定，用于在定量测定中确定粒子浓度估值E(C)的任何普通统计方法均可使用。本发明的优选实施方案在下面的描述中被进一步公开。

依照本发明，步骤b)中预先确定的样品体积至N隔室的分配可通过任何合适的常用方法进行。在优选的方法中，所述样品通过合适的移液样品体积的方法；通过合适的通过微流体系统的微滴产生的方法，优选地主动的和/或被动的微滴产生；通过合适的数字微流体技术(也称为“电介质上的电润湿”EWOD)，或者通过用于获得分配的隔室组的任何其它合适的方法(比如，例如在WO2012/109600A2中公开的，其与分配相关的内容以其整体并入本文)根据已确定的隔室数目N以及根据已确定的调制因数z_i进行分配。

关于移液技术，通过重复的混合、拆分和加入稀释剂(合适的缓冲液)的普通的系列稀释通常能够实现本发明的依照已确定的隔室数目N并根据已确定的调制因数z_i的预定样品体积的分配。作为实例，所述系列的第一隔室可包含具有浓度c₀的预定样品体积的某体积v₀，然后所述系列的第二隔室包含预定样品体积的分数x其然后通过加入合适的稀释剂进行稀释以达到体积v₀，以便第二隔室包含C₁＝C₀x¹。重复该程序产生等比级数的浓度C_i＝C₀xⁱ。用于进行这样的移液程序的合适的装置例如手动移液器，或者任何大众公知的机器人移液工作站，或者致力于移液超小体积的装置，例如由TTP Labtech销售的Mosquito装置。

通常，前述的移液方法还可用于制备通过以任意的顺序或组合调制每个隔室的浓度或体积或两者而呈现等比级数的粒子估计数目：(d_iv_i)/(d₀v₀)＝z_i＝xⁱ的一组隔室。

关于微流体系统技术，所有合适的普通技术均可用于本发明，尤其是，普通的主动微滴微流体系统和被动微流体系统，其能够实现本发明的依照已确定的隔室数目N并根据已确定的调制因数z_i的预定样品体积的分配。

关于主动微滴微流体系统技术，本发明人已特别开发了在微流体芯片中对微滴按需执行操作的一系列技术。所述操作包括i)精确确定体积的小滴的生成，ii)转化小滴，iii)合并小滴，iv)拆分小滴。这些操作允许实际执行任何稀释方案和本发明的分配。前述的主动微流体技术已在下面的专利申请中被特别公开：2011年1月21日提交的PCT/PL2011/050002"System and method for automated generation and handling of liquidmixtures"以及后面的国家申请；2011-07-27提交的PL395776"Sposób dzielenia kropelnaw ″；2011-07-27提交的PL395777"Sposóbdzielenia kropel naw″；2011-07-27提交的PL395778"Sposób dzielenia kropel naw″，其中每个申请的与主动微流体技术有关的内容以整体相对于本发明并入本文。

关于被动微流体系统(阱)，本发明人(为Scope Fluidics)已特别开发了以被动方式对小滴执行精密操作的系统和方法。该构思基于微流通道中良好几何学定义的“阱”的构建。所述阱，取决于它们的精确的几何学，可i)诱捕比给定体积小的小滴并使它保持在适当的地方，ii)诱捕精确设置体积的小滴并使它保持在适当的地方，iii)交换所诱捕的小滴中的部分液体(即接受小的附加体积并释放相同体积的原始混合物)，iv)诱捕，等待新小滴的到来，然后合并它们并释放，v)诱捕，等待随后的滴的到来，然后只释放第一个，而锁定第二个等。这些功能允许建立许多不同的液体处理方案，其可以依照本发明进行使用。前述的被动微流体技术(所谓的“TRAPS”系统和方法)已在下面的专利申请中被特别公开：2012-04-25提交的PL-398979″ jedno lub″，其中其与被动微流体技术有关的内容以整体相对于本发明并入本文。

此外，用于被称为“数字微流体”或“电介质上的电润湿(EWOD)”的在平面基板上的小滴操作的良好的技术平台能够实现本发明的依照已确定的隔室数目N并根据已确定的调制因数z_i的预定样品体积的分配。所述数字微流体技术/电介质上的电润湿(EWOD)技术允许按需生成小滴，移动它们，合并，混合和拆分它们。

将预定的样品体积依照本发明分配至N隔室中，其中可使用适合于保持分离的体积以便所述体积可进一步被处理和/或依照本发明的数字测定进行分析的任何普通样品架。

在优选的实施方案中，将预定的样品体积分配至根据本发明的第四个方面的本发明样品架。本发明的样品架可包括适合于实施本发明的例如合适的试管，微阵列上的孔阵列，或者微流体芯片，被配置以生成小滴的微流体芯片以及能保持离散体积的其它市售的或其它通常已知的设备。在另一个优选的实施方案中，使用依照本发明的第五个方面的本发明试剂盒分配预定的样品体积。本发明的第四和第五方面的所有优选实施方案可彼此独立地与本发明方法相结合。

在本发明方法的优选实施方案中，调制因数(z_i)为可确定的，优选地通过函数z_i-(v_id_i)/(v₀d₀)7或其类似函数进行确定，其中所述类似函数表达关于隔室中粒子估计数目逐对差异的信息，

其中(i)、(v_i)和(d_i)如上文所陈述的进行定义并且

其中(v₀)表示体积以及(d₀)表示参照隔室中的样品的稀释因数，其中所述参照隔室与隔室(i)不同，优选地其中所述参照隔室表示(N)隔室系列中的第一隔室。术语“(N)隔室系列中的第一隔室”相对于本发明被定义为包含具有起始体积和起始稀释因数的预定样品体积的一部分的隔室。

在本发明方法的优选实施方案中，在步骤b)中，1％，优选5％，更优选25％，甚至更优选50％，甚至更优选75％以及最优选100％的(N)隔室的调制因数(z_i)值彼此不同。越多的(N)隔室的调制因数(z_i)值彼此不同，可被测定的样品中的粒子的浓度范围越宽广。

然而，将预定的样品体积分配至已确定的(N)中的实施，其中所述(N)隔室包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，并因此调制因数(z_i)不同，可能对某些实验室来说太具挑战性，因为当分配样品时由已确定的调制因数(z_i)引起的差别相对于不同隔室的体积和/或稀释可仅导致细微的变化。在这种情况下，本发明方法提供另一种优选的实施方案以将样品分配至一定数目的(N_LIB)的两个或更多分离组的隔室(库)，每个库组用(j)进行索引并含有N_j’>0个隔室，相同库中的每个隔室包含或者由具有相同的调制因数(z_j)值的一部分样品体积组成，其中z_j为库组(j)中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，并且其中所述N_LIB个分离的库组j可通过不同的调制因数(z_j)值彼此区分，其中j表示由整数0至N_LIB-1表示的库组数(N_LIB)的索引号。所述库的概念用进一步优选的实施方案进行进一步地详细描述。

本发明的方法为亦此亦彼或非此即彼地(cumulatively or alternatively)优选的，其中在步骤b)中，将样品以这样的体积(v_i)和稀释因数(d_i)分配至(N)隔室中为了满足条件:v_id_i-v_od_oz_i

其中z_i>0，并且至少对于(i)的一个值，系数z_i+1/z_i不同于1。

依照本发明的优选的方法，在步骤b)中，调制因数(z_i)基于指数序列并且将样品以这样的体积(v_i)和/或稀释因数(d_i)分配至(N)隔室中为了满足条件:和/或其中(A)和(B)表示独立于彼此的任意实数并且其中优选地A＝1/C⁺和/或B＝[1.95·ln{(C⁺/C^-)/N}]^0.856。在这种情况下，甚至更优选地将所述样品分至(N)隔室中

优选地

(C⁺)，(C^-)和(σ_MAX)如上文中关于本发明的第一个方面所述。

预定样品体积按照本发明方法的步骤b)的情况以等比数列进行分配，本发明的分配满足下列条件：

(v_i+1d_i+1)/(v_id_i)＝Z_i+1/z_i＝x

其中x>0且x≠1，优选地其中(x)值由大约0.1,0.5,0.8,0.9,0.91,0.92,0.93,0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99,1.01,1.02,1.03,1.04,1.05,1.06,1.07,1.08,1.09,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2或10表示。在这个优选的实施方案中，比较两个连续隔室(i+1)和(i)的调制因数并且比较(i)并从而表示等比数列，其由于可提供上文已提及的动态范围内的统一的小数精确度而被优选(见图2a和详细附图说明中的各部分)。

发明人已意外地发现，包含具有系数x＝(v_i+1d_i+1)/(v_id_i，的等比数列的本发明方法的所需精确度的粒子浓度估值E(C)可优选测量。对于任何特定的输入浓度值C^*，可预先确定隔室(i^*)j其特征在于乘积。然后人们可能关心等比数列中与i^*邻近的隔室中的潜在输出(粒子的存在或不存在)。尤其是，人们可能关心来自任一“侧”的ΔN/2隔室的信号：n∈(-ΔN/2，ΔN/2)。由于获得信号的概率隔室i^*+n的体积和/或稀释因数 发明人发现具有比大得多或小得多的体积和/或稀释的隔室将不引入关于粒子的浓度估值E(C)≈C^*的重要信息(见详细附图说明中的各部分的图3a)。因此，发明人发现用于确定粒子浓度C≈C^*的相关信息应优先地来自有限组的隔室，也就是说依照本发明被称为“有效条带”并包含ΔN隔室或由其组成。

发明人已意外地发现，为了评价所需动态范围内C∈(C^-，C⁺)的任意浓度的测定，制备i)呈现跨越从ln(2)/C^-至ln(2)/C⁺的值的因数v_id_i的等比数列的一组主要隔室和ii)用呈现相同等比级数并被强加于前述主要组的每个终端的ΔN/2隔室的差数补充该组。

根据前述的优选实施方案，本发明的方法被额外地优化，因为发明人还发现由实验的任何输出表达的全部信息被包含在信号的特定排列(在本发明的上下文中称为“微态(μ)”)中，其导致将第一个(k_i)指定给包含预定的临界数目的粒子或更多(正值)或由其组成的隔室(i)。换句话说，在本发明的上下文中，将解释每个隔室状态的信号的具体分布称为微态(μ)。

有效条带内的被指定第一值(k_i)的各隔室的数目和定位为随机变量。用相同粒子初始浓度的重复实验将产生不同的应答。每个这样的输出具有来自不同粒子输入浓度的不同的发生概率。因此，每个特定微态(μ)的观测传送对粒子估计浓度E(C)的不同预期(见详细附图说明中的各部分的图3a，3b，3c，3d)。

使用等比数列，粒子的估计浓度E(C)的精确度通常取决于等比数列的公因数和隔室的数目。然后可作出两个重要的观测。首先，依照标准差的值，大多数估计浓度E(C)的输出下降至非常接近于输入浓度(见详细附图说明中各部分的图3d)。第二，由分析微态提供的标准差小于从分析正值的加和K获得的那些(见详细附图说明中各部分的图4a)，4b)和4c))。进一步地，与微态相关的标准差具有从上面明确定义的包络(envelope)。这种限制使用贝叶斯理论转化ρ(μ|C)由适合于最可能的微态的标准差的概率ρ(C|μ)给出。这种微态具有其中产生第一值(k_i)的全部隔室和包括具有指定的第二值(k_i)的的全部其它隔室，其中所述第二值(k_i)被指定，假如隔室(k_i)包含小于指示第一值的临界数目的粒子或由其组成(负值)(见图5a)和5b)和详细附图说明中的各部分)。

包含长序列隔室的本发明方法将在测定的绝大多数使用中产生或者与之相同，或者更可能高于，或者最可能显著高于基于最可能的本发明微态估计计算的精确度的浓度估值精确度。此外，发明人意外地发现，特别是(即最可能)，对于与方法的动态范围的限值接近的浓度(即C≈C^-或C≈C⁺)，本发明方法可以小概率返回产生低的估计精确度的不太可能的信号/值并因此将告知使用者(通过提供比需要的高的标准差值)不成功的事件已经发生以及应该重复实验。尽管现有技术的数字测定也允许提供误导的浓度估值的小概率不可能事件，然而仅使用微态方法的前述优选的本发明的特征可向使用者提供关于这样的不成功不可能事件发生的反馈。

在根据本发明的有效条带中增加分配的数目ΔN明显改善E(C)的估计但是仅到一定的限度，因为比大得多和小得多的隔室逐渐传送越来越少的信息。事实上，对于估计浓度的x标准差的任意值，随着增加ΔN而下降仅到限度σ_max(x)≈1.2739(1-x)^1.9895。在高精确度和隔室的小数目之间折中的ΔN的对应值可优选通过函数ΔN(x)＝4.5637(1-x)^-0.798确定。

实施前述优选的本发明方法的一种方式为具有具有系数x＝(v_i+1d_i+1)/(v_id_i)的等比数列的本发明方法是可确定的，优选通过以下函数确定：

将隔室的数目(N)优选设置为不小于由以下函数确定的值的整数：

其中(ΔN)优选为不小于可确定的，优选通过以下函数确定的值的整数：

ΔN-4.5637(1-x)^-0.798

并且，其中d_ov_o值是可确定的，优选通过以下函数确定：

(C⁺)，(C^-)，(σ_MAX)，(d_o)和(v_o)如前文对于本发明的第一个方面所定义的。

根据前述优选的本发明方法的样品的分配可以下列步骤进行设计：(i)对于给定的(C⁺)、(C^-)和(σ_MAX)，确定N、ΔN和x的值，(ii)使用x和ΔN，确定所述序列中的第一个隔室的体积v_o和稀释因数d_o以及(iii)具有(v_id_i)＝(v₀v₀)xⁱ的N隔室的序列，其中(i)表示所述N隔室的索引号，为0至N-1的整数。

本发明方法的上述一次方程式创建了有力的分析工具。首先，动态范围可完全独立于精确度进行调整。其次，对于给定的必需的最小精确度和动态范围，本发明方法需要比在隔室中使用相等体积的标准数字测定甚至少10²至10⁴倍的隔室。

例如，用传统的测定，为了说明Ω＝10⁴或Ω＝10⁷的动态范围，一个人需要，根据本领域中的知识状态N≥2·10³或N≥2·10⁶分别测试体积。如果估值的精确度E(σ)<50％是满意的，那么相同的Ω可通过仅包含像35或47那么少的隔室的本发明方法进行评估。如果需要较高精确度的实验(即σ<25％或σ<10％)，那么相对于本发明的方法仅需要分别140和795，或者192和1120的测试体积。这些数字为比定性改变技术需求以运行它们的经典测定的情况下小的数量级。

对测定的算法运算从数值模拟和实验方面以不同的动态范围和精确度：(i)Ω＝10³，σ≤80％，N＝10，x＝0.50，和(ii)Ω＝10²，σ≤60％，N＝10，x＝0.60进行了验证(见实施例以及图8a)和图8b)和详细附图说明中的各部分)。

本发明的方法进一步证明由于现有技术的多体积(multivolume)数字测定方法[Shen,F.；Sun,B.；Kreutz,J.E.；Davydova,E.K.；Du,W.；Reddy P.L.；Joseph,L.J.；Ismagilov,R.F.,“Multiplexed Quantification of Nucleic Acids with LargeDynamic Range Using Multivolume Digital RT-PCR on a Rotational SlipChipTested with HIV and Hepatitis C Viral Load”,J.Am.Chem.Soc.,Article ASAP(X2011)]，其与使用相等体积的标准数字测定相比已增大了动态范围的跨度。Ismagilov的多体积方法显示3倍的分辨率(相当于30％的sigma(估计的标准差))，下列动态范围：(a)当使用640个隔间(4家族，设计1)时大约10⁴(5.2·10²与4.0·10⁶之间)和(b)当使用880个隔间(6家族，设计2B)时大约10⁵(1.7·10²与2.0·10⁷之间)。

比较Ismagilov的方法与本发明的方法，本发明的方法用以下获得相同的动态范围和精确度：(a)N＝98隔室(x＝0.881373264)和(b)N＝117隔室(x＝0.881373264)。

从不同的侧面，如果允许使用640个隔室，那么本发明方法可产生下列动态范围和精确度的组合：2·10³的动态范围与σ<10％；5·10⁷的动态范围与σ<15％；>10¹⁰的动态范围与σ<30％。如果允许使用880个隔室，那么本发明方法可产生3·10⁴的动态范围与σ<10％；10¹⁰的动态范围与σ<15％；>>10¹⁰的动态范围与σ<30％。因此，上文的比较显示，数量上，本发明的方法可i)从640到98，和从880到117地降低隔室的数目，ii)对于相同数目的隔室可增大动态范围数百万倍或更好，以及iii)提供自由调整动态范围和精确度的选择。

在诊断学中，常考虑的测定参数为其在两个样品具有不同浓度的统计学上显著的判定中的分辨率。本发明方法的分辨率通过标准偏差的标准乘法而非常接近，即对于浓度不同的样品通过具有r＝1,2或3的rσ的因数实现区分两个样品的70、90、95％的置信。因此，如果一个人知道测定的必需的分辨率R＝C₁/C₂和必需的置信，那么要被写入设计测定的方程式的标准差为σ＝(R-1)/r。

本发明方法的另一个好处是它可产生来自实验的任何一个单一的随机实现的完整信息。换句话说，上文所列的优选的衡量提供可能最高的标准偏差(即由测定保证的最小精确度)：对于在对范围内的C(C∈(C^-，C⁺))的测定中观察的所有微态的估值E(C)的已公开的标准偏差σ为可能最高的值σ_μi。然而，可能会发生所述方法返回产生估值E_μi(C)的较小标准偏差σ_μi并因此产生较高的精确度的幸运的应答(微态)μ_i，其中这里的i指示微态，i＝0至2^N-1。随着x的增大，σ_μi的分布变得越来越窄并越来越接近最大标准偏差值。有趣的是，标准偏差的期望值σ_期望的(x)可优选表示为x的多项式函数。这可代替最大标准偏差σ_max(x)用作设计测定的基础。

使用本发明的构思，进一步优选构建在不同的浓度范围提供不同需求精确度的测定。这可用于诊断学，其中例如在低和高浓度下为了动态范围可能牺牲精确度，而在中间浓度范围精确的估计在临床上是有益的。

因此，另一种优选的本发明方法涉及将区间(C^-,C⁺)分成q个亚区间(C_n ^-,C_n ⁺)，优选地分解一个，在每个亚区间中，值d_iv_i的组为具有系数x_n的等比数列，然而：

1)对于

ΔN_n＝4.5637(1-x_n)^-0.758

2)对于

ΔN_n＝4·5637(1-x_n)^-0.793

2.其中：C^-意为用于确定未知浓度C的区间下限，C⁺意为用于确定未知浓度C的区间上限，C_n ^-意为号码n的亚区间下限，C_n ⁺意为号码n的亚区间上限，意为亚区间(C_n ^-,C_n ⁺)中的样品中粒子未知浓度C的估值E(C)的最大允许标准偏差，n为亚区间号，为从1至q的整数，并且i为第n个区间的隔室的号码，为从0至N_n-1的整数。

根据进一步的亦此亦彼或非此即彼地优选的本发明方法，本发明方法包括或由下列步骤组成：

c)任选地用一种或多种合适的试剂和任选的一种或多种稀释剂扩增隔室的粒子以获得指示隔室中粒子的预定临界数目的存在的可测量信号，所述粒子优选地有一个、两个、三个或更多，

d)在(N)隔室中的每一个中测量所述信号并对至少部分、优选地全部隔室指定值(k_i)，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号并且如果隔室(i)包含预定临界数目的粒子或更多粒子或由其组成，将隔室(i)指定第一值(k_i)，以及如果隔室(i)包含少于指示第一值的临界数目的粒子或由其组成，将隔室(i)指定第二值(k_i)，以及

e)确定粒子的估计浓度E(C)，其中粒子的估计浓度E(C)可通过以下函数确定：

i.第一和/或第二值(k_i)的加和K，其中所述函数优选使用校准修正函数进行修正，和/或

ii.加权的第一和/或第二值(w_ik_i)的加和K，其中至少部分值(k_i)，优选地每个值(k_i)用权重值(w_i)进行调制，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号，以及其中权重值(w_i)优选地与编号(i)的隔室的体积和/或稀释的程度成反比，以及其中所述函数优选使用校准修正函数进行修正，和/或

iii.微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含反映步骤e)中测量的至少部分值(k_i)的信息或由其组成，优选地包含表示微态μ的矢量k≡{k_i}，或由其组成，其中所述矢量(k)包含步骤e)中测量的至少部分，优选地全部值(k_i)或由其组成。

假如要被测量的粒子不提供像这样的可测量信号，根据本发明方法的步骤c)优选扩增粒子以便至少部分粒子，优选地全部粒子提供可测量的信号。合适的可测量信号为可在视觉上和/或通过合适的手段检测的任何信号。在优选的方法中，所述粒子用合适的元件例如报道分子进行标记，其以另一种方式与粒子结合、形成复合体或相互作用以便它们激发特定波长的光和/或基于合适的激发的电流，优选地它们表现出荧光(向上和向下转换)，表现出红外线(IR)范围内的光(近和/或远红外线波长，NIR/FIR)，或者表现出电流。特别适合用于任一种下文所述方法的报道分子为众所周知的。在优选的方法中，可使用两种报道分子，其竞争粒子的单一结合位点以被测定并因此进一步延伸本发明方法的动态范围。在WO2012/049316A1中给出了合适的报道分子的实例，其中不同的报道分子(标记)用于与样品的粒子相互作用(直接或间接)，其中所述报道分子优选为核酸分子，例如寡核苷酸。这样的报道分子优选在基于紧贴探头的检测试验中使用并且WO2012/049316A1的关于所述合适报道分子(标记)的内容以其整体并入本文。

本发明方法根据步骤c)适用于定量确定粒子存在的任何扩增方法。优选地，本发明方法适用于扩增存在的粒子至可测量的信号的方法，优选地，其中所述粒子借助于聚合酶链反应(PCR)进行扩增，优选地通过周期性温度变动，环介导等温扩增法(LAMP)，滚环扩增(RCA)，级联滚环扩增(级联RCA)，解旋酶依赖的扩增，基于核酸序列的扩增(NASBA)，切口酶扩增反应(NEAR)，单分子酶联免疫吸附试验(数字ELISA)，或用于将存在的粒子扩增至可测量信号的任何其它程序，或它们的组合。前述扩增方法为现有技术已知的并且本领域技术人员将容易地了解可使用适当的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂。

关于本发明方法的步骤d)，包含所述粒子和任选的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂的每个隔室中的混合物通常被适当地激活以便至少包含粒子的隔室表现出指示粒子存在的信号，例如通过荧光和/或磷光和/或电流强度。在至少部分，优选地全部隔室中的信号值用适当的手段进行测量。随后信号值通过适当的工具被分别转化，适当的工具比如适合于测量荧光、磷光强度并将信号转化为分别对至少部分、优选地全部隔室(i)指定的第一或第二值(k_i)的探测器。优选地，临界数目的粒子为1、2、3、4、5、6、7或更多粒子，更优选地1个粒子在隔室中。所述第一和第二值(k_i)可为任何合适的值，优选地其中第一值(k_i)表示正值指示临界数目的粒子在隔室(i)中的存在以及第二值(k_i)表示负值指示隔室中的临界数目的粒子在隔室(i)中不存在。优选地，所述第一和第二值(ki)包括二进制值，其中所述第一值(k_i)优选通过“1”或其它任意整数、实数或符号表示以及第二值(k_i)优选通过“0”或不同于表示第一值(k_i)的整数的其它任意整数、实数或符号表示。

根据本发明方法的步骤e)，公开了确定粒子的估计浓度E(C)的优选方法。

根据本发明方法的第一种选择i)，第一和/或第二值(k_i)，优选地{k_i}、N和{v_id_i}或P(v_id_i)值组的加和K，其中P(v_id_i)优选为体积和/或稀释的函数，通过已知的统计算法，优选地通过使用贝叶斯定理转化为浓度估值。

优选地，前述函数使用校准修正函数进行修正。可使用具有在测试动态范围内的靶粒子浓度的标准样品从实验上确定合适的校准修正函数。所述校准修正还可基于样品中粒子的浓度估值E(C)和在隔室中随机分布的粒子的真实数目M除以样品的体积的相依性用数字计算：C＝M/V_sample：f_corr(C)＝C/E(C)。当已计算出校准修正f_corr(C)时，修正的粒子数目估值是可确定的，优选地用公式E_corr(C)＝E(C)·f_corr(C)进行确定。例如，对于用由公式v_i＝e^0.0115*i给出的体积的474个分区的分布，对于从值0至473的索引i，所述修正为f_corr(C)＝(-1.48·10^-5·C+1.09)^-1(见图6和详细附图说明中的各部分)。

为了克服前述多体积测定分析中的缺陷，发明人已意外地发现，应用常见的统计方法通过使用第一和/或第二加权值(w_ik_i)的简单加和K创造性地确定粒子的估计浓度E(C)，其中至少部分值(k_i)，优选地每个值(k_i)用权重值(w_i)进行调制，其中权重值(w_i)优选地为隔室的稀释因数和/或体积的函数(w_i＝f(d_i，v_i))并且更优选地与编码(i)的隔室的稀释因数和/或体积的程度成反比(见详细附图说明中的各部分的图7a)，7b)和7c))。优选地，粒子浓度C的确定使用集优选地{k_i}、N和{v_id_i}或P(v_id_i)值组进行，其中P(v_id_i)优选为体积和/或稀释的非递增函数，通过已知的统计算法，优选通过使用贝叶斯定理转化为浓度估值。假如，权重值(w_i)取决于隔室体积和稀释，那么利用权重的分布w(d_iv_i)，所述分布选自包括以下的组：

a.w(d_iv_i)≡1，

b.w(d_iv_i)＝(d_iv_i)^β，其中指数β表示任意实数，

c.w(d_iv_i)＝exp(βd_iv_i)，其中乘数β为任意实数。

优选地，根据备选ii)的前述方法，使用如上文所述的校准修正函数与备选i)进行修正(见图6和详细附图说明中的各部分)。

备选i)和ii)的确定粒子浓度估值E(C)的前述方法涉及确定预定的样品体积中的粒子的浓度估值E(C_samples)，因为隔室间的粒子的随机分布为因变量的分布。上文中，描述了如何在储库中的粒子浓度估值E(C_reservotr)或样本中的粒子浓度估值E(C_spectmen)将所述函数转化为结果。

然而，根据方法i)和ii)的本发明的求和程序导致某些信息的丢失，因为值、优选二进制值的加和K或者值、优选二进制值的加权加和K不包含关于哪些隔室包含至少一个靶粒子，和哪些不包含的清楚的信息。

如果使用优选的本发明构思，微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示优选用于确定粒子的估计浓度E(C)，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含反映步骤e)中测量的至少部分值(k_i)的信息或由其组成，优选地包含表示微态μ的矢量k＝{k_i}，或由其组成，其中所述矢量(k)包含步骤e)中测量的至少部分，优选地全部值(k_i)或由其组成。相对于本发明方法的步骤e)的如上文所述的第一和/或第二值(k_i)的优选实施方案也对前述优选的方法适用。使用微态μ方法的意外的好处是用于计算粒子浓度估值E(C)的程序的计算复杂性降低，并且关于引起所观察的隔室包含至少临界数目的粒子的可信浓度的信息增加。微态μ方法优选提供(即最可能)，对于浓度接近所述方法的动态范围限值(即C≈C^-或C≈C⁺)的反馈，并且本发明方法将通知使用者(通过提供高于需要的标准偏差值)不成功的事件已经发生以及应重复所述方法。如上文所提及的，本发明的方法可用于估计样品中或从其制备样本和样品的储库中的粒子浓度。

优选地，在步骤e)中，微态μ的计算借助于神经网络进行，将矢量k转换为估值E(C)。

根据微态μ方法的优选实施方案，在本发明方法的步骤e)中，粒子的估计浓度E(C)为通过贝叶斯定理被转化为p(C|μ)的条件概率p(μ|C)的函数，优选地通过下列操作确定：

e1)由以下公式计算条件概率p(μ|C)：

e2)由以下公式计算条件概率p(C|μ)：

其中：

C_min＝-C^-1n(p_TR)/1n(2)，c_max＝-C⁺1n(1-p_TR)/1n(2)，并且：C^-意为用于确定未知浓度C的区间的下限，C⁺意为用于确定未知浓度C的区间的上限，0＜p_TR＜1为说明测定精确度的参数，优选地C_min＝0并且C_max＝∞；在系列值v_id_i为具有系数x＜1的等比数列的情况下，C_min和C_max等于：C_min＝C^-x^ΔN/2，C_max＝C⁺x^-ΔN/2，其中ΔN＝4.5637(1-x)^-0.798。

e3)作为估值E(C)的浓度C的确定，其中

具有标准偏差其中：

如上文已经描述的，本发明方法还提供了假如已确定的隔室数目N和已确定的调制因数z_i导致预定样品体积的分配，其在实践中不能在各自的实验室进行处理——例如当在那儿不存在分配样品的合适的工具时——的优选解决方案。在这种情况下，本发明的方法建议使用库方法，其中在步骤b)中，所述样品被分配至一定数目的(N_LIB)两个或更多分离组的隔室(库)，每个库组用(j)进行索引并且包含个隔室，相同库中的每个隔室包含具有相同调制因数(z_j)值的一部分样品体积或由其组成，其中z_j为所述库组(j)中的样品的体积(v_j)和稀释因数(d_j)的函数，并且其中所述N_LIB个分离的库组j可通过不同的调制因数(z_j)值彼此区分，其中j表示由整数0至N_LIB-1表示的库组数(N_LIB)的索引号。

关于所述库方法，调制因数(z_j)优选通过函数z_j＝(v_jd_j)/(v₀d₀)或其类似函数进行确定，其中(v_j)表示体积以及(d_j)表示库组(j)的隔室中的样品的稀释因数，其中(v₀)表示体积以及(d₀)表示经过选择的参考库组(j)的隔室中的样品的稀释因数。

根据所述库方法的另一个优选的实施方案，在本发明方法的步骤b)中，至少部分、优选地全部数目(N_LIB)的库组(j)的每个库组(j)包含N_j′＝N′个隔室或由其组成，并且满足条件：(v_j+1d_j+1)/(v_jd_j)＝z_j+1/z_j＝x，

其中x＞0并且x≠1。通过使用具有系数x＝(v_j+1d_j+1)/(v_jd_j)的等比数列，优化了浓度估值E(C)的精确度，优选地与上文描述的微态μ方法相比所述精确度仅因数20％为最差。

根据本发明方法的另一个亦此亦彼或非此即彼优选的实施方案，值组v_jd_j＝v₀d₀z_j表示具有系数x＝(v_j+1d_j+1)/(v_jd_j)的等比数列，其中函数：

表示系数(x)的最大优选值，其中可调整系数(x)至执行所述方法的技术参数，并且将每个库组(j)中的隔室数目N_j’设置为不小于可通过以下函数确定的值的整数：

并且优选将分离的库组(j)的数目设置为不小于可由以下函数确定的值的整数：

其中ΔN_LIB为可确定的，优选通过以下函数确定：

ΔN_LIB＝4.5637(1-x)^-0.758

并且其中v₀d₀为可确定的，优选通过以下函数确定：

(C⁺),(C^-)和(σ_MAM)如上文关于本发明第一方面的，并且(d₀)和(v₀)如上文关于本发明库方法所定义的。

关于本发明，隔室的数目N_LIB和ΔN_LIB代表整数，其中所述整数为确定的，其与相关函数的真实结果接近，优选最近。

根据进一步优选的本发明方法，将N_LIB个库组(j)的至少部分或优选地每一个指定值所述值为对步骤d)中的库组(j)所包含的隔室的每一个指定的至少部分、优选地全部值(k_i)的函数，并随后将所述值转换为微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含反映至少部分值的信息或由其组成，优选地包含表示微态μ的矢量或由其组成，其中所述矢量(k_LIB)包含至少部分、优选地全部值或由其组成，其中优选地所述值包含对步骤d)中的库组(j)所包含的隔室的每一个指定的值(k_i)的加和K_j或由其组成。

3.根据本发明的优选的实施方案，确定粒子浓度估值E(C)的特征在于，进行下列操作：

e1)从以下公式计算条件概率p(μ|C)：

e2)从以下公式计算条件概率p(C|μ)：

其中：C_min＝-C^-1n(p_TR)/1n(2)，C_max＝-C⁺1n(1-p_TR)/1n(2)，并且：C^-意为用于确定未知浓度C的区间的下限，C⁺意为用于确定未知浓度C的区间的上限，0＜p_TR＜1为说明测定精确度的参数，优选地p_TR→1；在v_id_i值系列为具有系数x＜1的等比数列的情况下，C_min和C_max优选等于：C_min＝C^-x^ΔN/2，C_max＝C⁺x^-ΔN/2，其中ΔN＝1.5637(1-x)^-0.798

e3)E(C)的浓度C的确定，其中：

具有标准偏差其中：

根据本发明方法的进一步优选的实施方案，每个库中的隔室的副本数是相等的N_j′＝N′，提供了用于调节等比级数的公比的技术优选值x和N′而保证需要的动态范围和测定精确度的方便的方法(见图2b和详细附图说明的各个部分)。

根据本发明方法的另一个优选实施方案，所述信号使用Real-Time PCR方法在具有编号i的库的每个隔室中进行测量并且那个隔室被指定实际值，该实际值取决于那个隔室中的靶粒子的初始副本数，随后具有编号i的库被指定值k_i，值k_i说明在属于那个库的全部隔空中存在的靶粒子副本比在某些任意选择的阳性隔室v_smind_smin中多多少倍，并且将所测量的信号以说明微态μ、连续包含参数k_i值的矢量k≡{k_i}的形式进行转换，其中i为库编号，为0至N-1的整数。

4.根据根据本发明第一个方面的进一步优选的本发明方法，所述方法的特征在于，在步骤d)中，测量来自全部库的全部隔室中的总信号，同时对用于所述测定中的第j个库中的每个隔室指定参数参数为在那个隔室中测量的信号的函数，然后将所测量的信号转换为说明微态μ、连续包含参数K_j值的值的形式，其中j为所述库编号，为0至N_lib-1的整数，并且为加和权重，并且优选地对于每个i和每个j的假如为这种优选的本发明方法，那么在步骤e)中优选进行下列操作：

e1)从以下公式计算条件概率p(K|C)：

e2)从以下公式计算条件概率：

其中：C_min＝-C^-1n(p_TR)/1n(2)，C_max＝-C⁺1n(1-p_TR)/1n(2)，并且：C^-意为用于确定未知浓度C的区间的下限，C⁺意为用于确定未知浓度C的区间的上限，0＜p_TR＜1为说明测定精确度的参数，优选地p_TR→1；在v_id_i值系列为具有系数x＜1的等比数列的情况下，C_min和C_max等于：C_min＝C^-x^ΔN/2，C_max＝C⁺x^-ΔN/2，其中ΔN＝4.5637(1-x)^-0.798

e3)作为估值E(C)的浓度C的确定，其中：

具有标准偏差其中：

进一步地，假使本发明方法对于不同的动态范围允许不同的标准偏差，那么进行下列优选的本发明方法，其中所述方法的特征在于区间(C^-，C⁺)被分为q个亚区间优选地分解一个，在每个亚区间中，值d_iv_i的组为具有系数x_n的等比数列，并且所述库具有恒定的基数N′_n，然而：

a)对于

b)对于

其中C^-意为用于确定未知浓度C的区间的下限，C⁺意为用于确定未知浓度C的区间的上限，意为具有编号n的亚区间的下限，意为具有编号n的亚区间的上限，意为亚区间中的粒子浓度C的估值E(C)的最大允许标准偏差，n为亚区间编号，为1至q的整数，并且i为库编号，为0至的整数。

优选地，前述计算借助于神经网络进行。

根据本发明的另一个亦此亦彼或非此即彼优选的实施方案，本发明的方法可相对于多重PCR方法进行使用。因此，优选使用本发明方法，其中两个或更多不同的粒子和/或基本上相同的粒子的两个或更多不同部分的浓度被确定，其中存在于所述(N)隔室的任一个的至少部分、优选地全部所述不同粒子和/或基本上相同的粒子的不同部分提供，优选地被放大以提供两个或更多可区别的可测量信号，其中所述(N)隔室的任一个中的两个或更多可区别的信号被测量以及其中对于所述(N)隔室的每一个，分别指定两个或更多不同的值，其中不同的值彼此独立表明临界数目的相同粒子和/或相同部分的基本上相同的粒子在隔室中存在或不存在。

根据本发明第一个方面的本发明方法的另一个优选实施方案可如下进行描述：

在数字定量测定的潜在应用中，使用者优选对获得样品中的粒子数目的估值E(M)有兴趣。如果将所述样品分至N个相同的一组隔室，用于分析测定结果的适当的算法为将粒子在隔室之间的随机分布当作因变量的分布。由这种分析给出的估值的标准偏差取决于样品中的粒子浓度E(C_sample)＝E(M)/V_sample并且估值自身取决于来自测定的信号(见图9a)和9b)以及详细附图说明)。在本发明方法的应用中，优选地，所述估值的相对标准偏差σ不大于给定的浓度C_sample＝M/V_sample范围内的已知临界值。浓度的动态范围Ω＝C⁺/C^-和范围C_sample∈(C^-，C⁺)内的估值的相对标准偏差σ的最大值之间关系，Ω(σ)具有典型的拐点其定义了作为隔室数目N的函数的动态范围Ω(N)和精确度σ(N)的优化组合。包含N个隔室的单个测定具有它不允许彼此独立地调整动态范围3精确度的缺陷。

发明人意外地发现对于该问题的解决方案，其允许适合于粒子浓度估值E(C)的需要的和独立预定的动态范围和精确度的隔室总数的最小化。对于该技术问题的解决方案为使用测定的组合，每个包含一定数目的相同的隔室，并且所述隔室的体积和/或稀释因数在测定之间不同。根据本发明，考虑到组合测定的动态范围(Ω_tot)的要求值和由所述测定返回的由浓度估值E(C_sample)表示的粒子数目估值E(M)的最大相对标准偏差(σ)，所述测定的参数可借助于下列简单方案进行计算。相同隔室的组的数目N_lib由以下给出：

每组中的隔室的数目(N′)优选由以下给出：

N′＝γ·σ^δ，

并且表征不同测定中的隔室的调制因数z_i＝d_iv_i/d₀v₀＝xⁱ的等比数列的公因数x＝d_i+1v_i+1/d_iv_i，其中i∈(0，Nlib-1)，优选由以下给出：

参考调制因数z₀＝d₀v₀的值优选由下式给出：

其中常量具有以下值：α＝0.1624，β＝2.2307，γ＝0.0328以及δ＝-2.361，ε＝3.2605以及

在本发明方法的非此即彼优选的应用中，可优选估计从其采集所述样本的大的储库(例如液体或体液等的)中的粒子浓度。然后将粒子在隔室中的放置当作一组独立随机变量，该独立随机变量为样品中的粒子浓度C_sample＝C_reservatr(V_spectmen/V_sample)和隔室的体积和稀释比例的函数。然后由所述测定传达的粒子浓度估值将描述估值E(C_reservatr)＝E(C_sample)(V_sample/V_specimen)和该估值的相对标准偏差σ。用于分析测定结果的适当的算法为将粒子在隔室之间的随机分布当作相同的独立分布的变量的分布。由这种分析给出的估值的标准偏差取决于浓度C_sample＝C_reservatr(V_specimen/V_sample)并且估值自身取决于来自测定的信号(见图9a)和9c)和详细附图说明中的各部分)。

在本发明方法的非此即彼优选的应用中，优选地，所述估值的相对标准偏差σ不大于给定的浓度C_reservetr范围内的已知的临界值。浓度的动态范围和范围C_sample∈(C^-，C⁺)内的估值的相对标准偏差σ之间的关系Ω(σ)具有典型的拐点其定义了作为隔室数目N的函数的动态范围Ω(N)和精确度σ(N)的优化组合。包含N个隔室的单个测定具有它不允许彼此独立地调整动态范围和精确度的缺陷。对于该技术问题的解决方案为使用测定的组合，每个包含一定数目的相同的隔室，并且所述隔室的体积和/或稀释因数在测定之间不同。Ismagilov等人[Shen,F.；Sun,B.；Kreutz,J.E.；Davydova,E.K.；Du,W.；Reddy P.L.；Joseph,L.J.；Ismagilov,R.F.,“MultiplexedQuantification of Nucleic Acids with Large Dynamic Range Using MultivolumeDigital RT-PCR on a Rotational SlipChip Tested with HIV and Hepatitis C ViralLoad”,J.Am.Chem.Soc.,Article ASAP(X2011)]已显示这样的组合然而所提供的解决方案没有最小化对于取得浓度估值的动态范围和相对标准偏差的一组给定值需要的隔室数目。本发明人已意外地发现对于该问题的解决方案，其允许最小化适合于粒子浓度估值的需要的和独立预定的动态范围和精确度的隔室的总数。根据本发明，考虑到组合测定的动态范围的要求值和由所述测定返回的浓度估值E(C_sample)的最大相对标准偏差(σ)，本发明方法的参数可借助于下列简单方案进行确定。相同的隔室的组的数目N_lib优选通过以下给出：

每个组中的隔室的数目(N′)优选通过以下给出：

N′＝γ·σ^δ

并且表征不同测定中的隔室的调制因数z_i＝d_iv_i/d₀v₀＝xⁱ的等比数列的公因数x＝d_i+1v_i+1/d_iv_i，其中i∈(0，N_lib-1)，优选由以下给出：

参考调制因数z₀＝d₀v₀的值优选由下式给出：

其中常量具有下列值：α＝0.6813，β＝-2.0966，γ＝0.9925以及δ＝-2.065，ε＝0.746和

根据本发明的第二个方面，提供了用于根据本发明方法确定粒子浓度的装置。本发明的第一方面的所有实施方案可相对于本发明的第二方面彼此独立地组合。

本发明的装置能够通过合适的工具确定数目(N)和确定调制因数(z_i)。合适的工具为常见的装置，优选包含用存储其上的可执行指令配置的具有存储设备的计算机，所述指令——当由处理器执行时，使处理器根据本发明的第一方面的本发明方法确定数目(N)和调制因数(z_i)。因此，本发明的装置至少在一定程度上能够满足本发明相关的需求。

根据本发明装置的亦此亦彼或非此即彼优选的实施方案，配置所述装置以

c)将至少部分预定的样品体积分配进确定数目(N)的分离的隔室，其中至少部分、优选地全部隔室包含预定的样品体积与确定的调制因数(z_i)

d)任选地用一种或多种合适的试剂和任选的一种或多种稀释剂扩增隔室的粒子以获得指示隔室中粒子的预定临界数目的存在的可测量信号，所述粒子优选地有一个、两个、三个或更多

e)在所述(N)隔室的每一个测量所述信号并对至少部分、优选地全部隔室指定值(k_i)，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号并且如果所述隔室(i)包含预定临界数目的粒子或更多或由其组成，将隔室(i)指定第一值(k_i)，并且如果所述隔室(i)包含小于指示第一个值的临界数目的粒子或由其组成，将隔室(i)指定第二值(k_i)，以及

f)确定粒子的估计浓度E(C)，其中粒子的估计浓度E(C)通过以下函数确定：

i.值(k_i)的加和K，其中所述函数优选使用校准修正函数进行修正，和/或

ii.加权值(w_ik_i)的加和K，其中至少部分值(k_i)、优选地每个值(k_i)用权重值(w_i)进行调制，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号，以及其中权重值(w_i)优选地与编号(i)的隔室的体积和/或稀释的程度成反比，以及其中所述函数优选使用校准修正函数进行修正，和/或

iii.微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含反映步骤e)中测量的至少部分值(k_i)或由其组成，优选地包含表示微态μ的矢量k≡{k_i}，或由其组成，其中所述矢量(k)包含步骤e)中测量的至少部分、优选地全部值(k_i)或由其组成。

优选的本发明装置能够通过如前文描述的合适的工具进行数目(N)的确定和调制因数(z_i)的确定以及通过用合适的工具进行任选的扩增反应确定浓度估值E(C)，用合适的工具测量值，用合适的工具指定第一个和第二个值k_i以及通过合适的工具(比如用存储其上的可执行指令配置的具有存储设备的计算机，所述指令——当由处理器执行时，使处理器根据本发明确定浓度估值E(C))实际确定浓度估值E(C)的最终确定。

用于配置优选的装置的合适的工具以相对于本发明的第一个方面进行了公开并且可彼此独立地与前述本发明的优选装置进行组合。

根据本发明的第三个方面，提供本发明方法或本发明装置的使用为了

a)调整，优选地减少包含预定的样品体积的隔室的总数目(N)和/或

b)调整，优选地减少全部(N)隔室中的包含样品、适合于扩增至少部分粒子至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的总体积和/或

c)预先确定每个(N)隔室中的包含样品、适合于扩增至少部分粒子至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的体积、优选地最小或最大体积和/或

d)预先确定将预先确定的样品体积分配至所述(N)隔室的调整因数(z_i)、优选最小或最大适合的调制因数(z_i)。

本发明第一个和第二个方面的所有优选的实施方案可彼此独立地与本发明第三个方面的实施方案组合。

根据本发明的第四个方面，提供了供在本发明的方法中使用或与本发明装置一起使用的样品架，其中所述样品架创造性地被配置为，

a)包含预定数目(N)的隔室或由其组成，其中所述数目(N)小于或等于以下函数的值：

其中(A)表示为整数6的实数，其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定上限，其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定下限，其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

b)其中所述(N)隔室被配置为包含预定的样品体积与预定的调制因数(z_i)，其中(z_i)为至少部分或全部(N)隔室中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，这样两个或更多(N)隔室的至少部分或全部可包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由其组成，其中(i)表示由整数0至N-1表示的(N)隔室的索引号，并且其中(v_i)表示体积以及(d_i)表示隔室(i)中的样品的稀释因数。

本发明的第一个、第二个和第三个方面的所有优选的实施方案可彼此独立地与本发明的第四个方面的实施方案组合。

本发明的样品架可优选包括合适的试管，微阵列上的孔阵列，或者微流体芯片，被配置以生成小滴的微流体芯片以及能保持离散体积并允许各个信号扩增和测量的其它市售或其它通常已知的设备。

本发明的第五个方面涉及包含本发明样品架和适合于扩增所述样品架的隔室中包含的至少部分粒子至可测量信号的一种或多种试剂和任选地用于确定粒子浓度，优选地用于根据本发明的方法确定粒子浓度的一种或多种合适的稀释剂的试剂盒。

本发明的第一个、第二个、第三个和第四个方面的所有优选的实施方案可彼此独立地与本发明的第五个方面的实施方案组合。

详细附图说明

图1a)，1b)和1c)

图1a)，1b)和1c)显示不同数字测定设计的性能比较。

在图1a)中，阴影区显示通过用通过用ΔN＝γ·(1-x)^-δ，N＝2·ΔN-log_x(Ω)和v_o＝ln2·x^-ΔN1/C^-，其中α＝1.24，β＝1.9493，γ＝4.5637以及δ＝0.798设计的等比序列确定的隔室体积的本发明定量测定获得的浓度估值的动态范围和精确度的组合(表示为浓度估值的相对标准偏差)。灰线显示用于等比测定中的恒定数目的隔室的示例性迹线。黑色点线显示用被作为相同的和独立随机变量的相同隔室的测定的相对标准偏差和动态范围的可能的组合，而黑色短划线指示包含被作为相依随机变量的相同隔室的相同的测定。空的方形(□)指示包含被作为独立随机变量的相同隔室并覆盖浓度范围Ω＝10⁶的测定。灰色实方形(■)指示包含被作为相依随机变量的相同隔室并覆盖浓度范围Ω＝10⁶的测定。

图1b)显示用本发明方法设计的测定的可能的调整同时保持动态范围恒定并等于Ω-10⁶。所述图表显示用于本发明的设计和来自技术发展水平的设计作为参数p＝1n(Ω)/σ²的函数的隔室的最小数目。

长的短划线表示包含由其中A＝1/C⁺并且＝[1.95·ln{(C⁺/C^-)/N}]^0.356给出的体积序列的本发明定量测定，而在该测定中的隔室数目等于并且覆盖浓度范围Ω＝10⁶。

点线表示更优选地包含隔室并覆盖浓度范围Ω＝10⁶的本发明定量测定。

实线表示用通过用ΔN＝γ·(1-x)^-δ，N＝2·ΔN-log_x(Ω)和v_o＝ln2·x^-ΔN1/C^-，其中α＝1.24，β＝1.9493γ＝4.5637和δ＝0.798设计的等比序列确定的隔室体积，并覆盖浓度范围Ω＝10⁶的本发明定量测定。

短划-点线表示目的在于提供粒子储库(其大于从那个储库中抽取的样品)中的粒子浓度(C_R)估值的本发明多体积测定。所述测定借助于下列方程式进行设计：和其中α＝0.6813，β＝-2.0966，γ＝0.9925以及δ＝-2.065，并覆盖浓度范围Ω＝10⁶。

短的短划线(2)表示目的在于提供样品中的粒子浓度(C_sample)估值的多体积定量测定。所述测定借助于下列方程式进行设计：和其中α＝0.1624，β＝2.2307，γ＝0.0328以及δ＝-2.361，并覆盖浓度范围Ω＝10⁶。

空的方形(□)指示包含被作为独立随机变量的相同隔室并覆盖浓度范围Ω＝10⁶的测定。

灰色实方形(■)指示包含被作为相依随机变量的相同隔室并覆盖浓度范围Ω＝10⁶的测定。

图1c)显示根据关于本发明以及关于与其相比较的现有技术的测定的不同设计的产生给定的浓度范围和精确度所需要的数目N的隔室的比较。通过函数N_max＝6p标准化的隔室数目作为参数p＝1n(Ω)/σ²的函数进行绘制。

空的(◇)和实的(◆)黑色菱形显示其中隔室体积通过等比级数的调制因数，与其中A＝1/C⁺以及＝[1.95·1n{(C⁺/C^-)/N}]^0.856确定的本发明测定的性能。该测定中隔室的数目等于(用实的黑色菱形标记◆的测定)，或者优选地(用空的黑色菱形标记◇的测定)。

实的三角形(▲)表示用通过用ΔN＝γ·(1-x)^-δ，N＝2·ΔN-log_x(Ω)和v_o＝ln2·x^-ΔN1/C^-，其中α＝1.24，β＝1.9493，γ＝4.5637和δ＝0.798设计的等比序列确定的隔室体积的本发明定量测定。

空的三角形(Δ)表示用通过具有重复的等比序列确定的隔室体积(或者每个隔室N’个副本)的本发明定量测定，其中对于给定数目的副本(N’)所述等比数列的公因数具有值并且所有其它参数以与没有重复的等比数列相同的方式进行定义。

空的黑色圆形(○)表示目的在于提供粒子储库(其大于从那个储库抽取的样品)中的粒子浓度(C_reservoir)估值的本发明多体积测定的隔室数目。所述测定借助于下列方程式进行设计：和其中α＝0.6813，β＝-2.0966，γ＝0.9925以及δ＝-2.065。

实的黑色圆形(●)表示目的在于提供样品中的粒子浓度(C_sample)估值的多体积定量测定。所述测定借助于下列方程式进行设计： 和其中α＝0.1624，β＝2.2307，γ＝0.0328以及δ＝-2.361。

加号与短划线表示在F.Shen,R.F.Ismagilov et al.,JACS2011133:17705-17712中由R.F.Ismagilov描述的现有技术的多体积测定的性能。

黑色实线显示由Ismagilov提供的解决方案和本申请中公开的技术上更有利的技术方案之间的清楚的分界线。此处描述的定量测定和先前提供的多体积测定之间的区别清楚可见。

图2a)和2b)

图2a)显示由包含具有由具有公比(或系数)x的等比序列确定的体积的N个隔室的本发明定量测定提供的动态范围C⁺/C^-＝Ω和相对标准偏差σ的图表。所述动态范围C⁺/c^-＝Ω可独立于精确度σ进行调整，并且对于给定的需要的动态范围，提议的测定需要比标准数字测定少甚至10²至10⁴倍的隔室。

图2b)显示展示确定本发明测定的隔室体积的等比序列的公比x和提供估值E(C)的最大相对标准偏差σ(C)的本发明测定中的每个隔室的副本数之间的关系的图表。对于任意预定的动态范围，和精确度，体积的等比级数的因数x可与隔室的副本数N’相互交换，允许将测定的设计调整至其实践中的技术需求。

图3a)，3b)，3c)和3d)

图3a)显示包含不同体积的隔室的本发明测定，每个隔室显示其自身的特征浓度C。相当于，对于任一个任意输入浓度C^*，仅一个隔室最密切地显示这个浓度。逐渐增大(或变小)的隔室携带逐渐减少的关于输入浓度的信息。这反映在从这些隔室获得信号的概率接近一致(或零)。有效条带(此处用灰色短划线矩形标记并包含具有的隔室)被定义为由发出明显不同于0或1的信号的概率表征的有限组的隔室。具有比有效条带内的更大的体积的有效条带外的隔室(深灰色标记的具有的隔室)包含总是阳性信号的概率，即，指示将测量至少临界数目，而对于包含比有效条带内的更小的体积的有效条带外隔室(浅灰色标记的具有的隔室)包含总是阴性信号的概率，即，指示将测量小于临界数目。

图3b)显示包含一组测试体积的根据本发明的有效条带在每个测定的运行中产生信号(微态)的随机组合，其中整数1指示至少临界数目的粒子、优选地至少1个粒子存在于隔室中并且整数0指示少于临界数目、优选地没有粒子存在于那个隔室中。每个微态产生其提供比从唯一数目的值K恢复的(ρ_K)更多的信息。这些分布中的每一个通过不同的标准偏差(即关于C的不同的信息)进行表征。所述分布ρ(C)的标准偏差的包络(即最大值)由最可能的微态给出。根据求和(Δ)和微态(◆)方法，这被示为包含三个隔室在图3c)中和十六个隔室在图3d)中的有效条带。有趣的是，许多较小可能的微态携带比最可能的那个明显更多的关于C的信息。

图4a)，4b)和4c)

图4a)，4b)和4c)显示展示用于根据本发明方法从隔室分析信号的两种不同方法(求和(Δ)和微态(◆))的粒子浓度估值的标准偏差的图表。三角形显示来自值的加和(求和)的粒子浓度估值的标准偏差，而菱形显示来自每个独一无二的微态μ＝{k_i}的粒子浓度估值的标准偏差，其对于K的给定值是可能的。对于绝大多数可能的微态，来自微态的粒子浓度的标准偏差比基于值的加和的更小。每个图表对应于用不同系数的等比数列d_i+1v_i+1＝x(d_iv_i)的不同测定。

图5a)和5b)

图5a)显示展示20μL体积样品的本发明定量测定的十个最频繁出现的微态的概率分布p(μ|C)的图表，旨在提供从C^-＝1mL^-1至C⁺＝10²mL^-1浓度范围内(即C⁺/C^-＝10²)的具有小于σ_max＝62%的相对标准偏差的粒子浓度估值。所需要的浓度范围通过以稀释比C_i/C_s＝d_i＝x_i，其中x＝0.5将样品分配至10个分区中实现。黑色线标记微态，其中前五个隔室显示至少一个副本的靶粒子的存在。分布的宽度定义了测量精确度，在这种情况下等于62％。附图中显示的每个曲线由对于阳性分区的和对于阴性分区的的连乘积产生，其分别在左侧(阳性分区)和右侧(阴性分区)形成陡峭的脊。

图5b)显示展示20μL体积的样品的本发明定量测定的前90个最频繁出现的微态(灰色线)的概率分布p(μ|C)的图表，旨在提供从[1/mL]至[1/mL]的浓度范围内(即)的具有小于σ_{max_1}＝62%的相对标准偏差，从至的浓度范围内(即)的σ_{max_2}＝25％以及从至的浓度范围内(即)的σ_{max_3}＝62％的所述样品中的DNA粒子浓度估值。所需要的浓度范围通过以稀释比C_i/C_s-d_i-xⁱ，其中x＝0.5将样品分配至连续的14个隔室中，以x＝0.917分配至86个隔室中，以及以x＝0.5分配至14个隔室中实现。使用存在于本发明的描述中的数值算法，估值E(C_s)基于条件概率分布p(C_s|μ)进行计算，其中μ为用于进行分析测定的分配系统的微态。黑色线标记两个微态；在第一个(在左边)，前7个分区显示至少一个副本的靶粒子的存在，而剩余的那些为阴性，在第二种情况下(在右边)——前57个分区显示至少一个副本的靶粒子的存在，而剩余的那些为阴性。一个人可容易地从第一组(x＝0.5)和从第二组(x＝0.917)区分所述微态。来自第二组的微态明显较窄(其导致较高的测定精确度)并更密集地出现在浓度轴上。

图6

图6显示展示用于包含具有稀释因数其中x＝0.99814的2,814个隔室的本发明定量测定的粒子初始浓度的校准修正函数f_corr＝C/E(C)的图表，其中来自隔室的信号通过因数w_i＝1/d_i进行加权。

图7a),7b)和7c)

图7a)显示展示作为随机分布在根据本发明的N＝2,814个隔室的粒子数目M的函数、具有权重w_i＝1/d_i的值的加和K＝Σw_ik_i的图表。被编索引i的隔室通过稀释因数与等比数列的系数x＝0.99814进行表征。选择隔室的数目和系数x以便所述定量测定提供浓度的动态范围C⁺/C^-＝10⁵内的具有小于σ_MAX＝10％的最大相对标准偏差的粒子浓度估值c＝E(C)。存在于图1中的结果由100次迭代的数值算法获得。

图7b)显示展示用于包含具有稀释因数其中x＝0.99814的2,814个隔室的本发明定量测定的、作为K的函数的粒子的初始浓度估值E(C)的值的图表，其中K为用权重w_i＝1/d_i加权的信号的加和K＝Σw_ik_i。

图7c)显示展示用于包含具有稀释因数其中x＝0.99814的2,814个隔室的本发明定量测定的、作为粒子的初始浓度C＝M/V的对数的函数的估值E(C)的相对标准偏差σ(C)的图表，其中来自隔室的信号通过因数w_i＝1/d_i进行加权。

图8a)，8b)和8c)

图8a)，8b)和8c)的图表显示对于下列测定的每一个和作为本发明方法的性能的实验和数值验证的7或8个实验(也见实施例部分)的100蒙特卡洛(MC)模拟的结果。根据本发明，已设计了具有不同的动态范围和精确度：(i)Ω＝10³，σ≤80％，N＝10，x＝0.50，(ii)Ω＝10²，σ≤60％，N＝10，x＝0.60，和(iii)Ω＝10¹，σ≤25％，N＝30，x＝0.92的一组等比测定。上述本发明测定的每一个用蒙特卡洛模拟进行验证。此外，实验性地运行本发明定量测定。对于每一个本发明测定，对于a、b和c分别用输入浓度C_input的单一固定值：1420，568和66[粒子/mL]制作轨迹。来自MC的结果显示为黑色线，显示70％的置信区间(E(C)±σ)。从来自实验测定的信号恢复的期望值用红色菱形显示以及所述70％的置信区间用误差线。灰色条带显示C_input±σ_max的范围。

图9a)和9b)

图9a)和9b)的图表显示基于i.i.d.(短划线)和非i.i.d.方法(实线)的样品中的分子浓度/数目的估值和其本身作为信号的函数的浓度估值的标准偏差。点线显示估值的标准偏差的示例性的临界值。对于每个临界值，一个人可明确地确定动态范围Ω＝C⁺/C^-，其中C^-为以至少所需要的精确度测定的最小浓度以及C⁺为最大浓度。用于非i.i.d.方法的西格玛分布的“波浪”行为由计算准确性引起。

发明B部分的进一步的实施方案：

1.一种用于确定样品中的粒子浓度的方法，包括下列步骤：

a)将所述样品分为N个不相交的亚体积，每个具有体积v_i，其中i为所述亚体积的索引，其中

·要么将所述样品以确定的方式分为亚体积，即这样所述体积v_i通过分析函数f(i)的一系列值或通过预先定义的值组给出，

·要么将所述样品以随机方式分为亚体积，即这样所述亚体积的体积分布对应于概率分布P(v)，意为具有范围(v，v+Δv)内的体积v_i的亚体积的数目通过式：给出。

b)在这样获得的亚体积的每一个中进行将存在的至少一个所述粒子扩增至可测量信号的过程；

c)在所述亚体积的每一个中测量所述信号并对这个亚体积指定参数k_i，其中参数k_i具有等于1的值，如果所述信号测量的结果指示在给定的亚体积中具有至少一个所述粒子以及否则地具有等于0的值，并且i为所述亚体积的编号；

d)计算加和K＝Σk_i·w_i(v_t)，其中i为所述亚体积的编号并且所述加和是对所述样品被分为其的所有亚体积i＝1…N，并且w_i(v_i)为权重，其可能取决于亚体积的体积；

e)用基于贝叶斯公式(Bayes formalism)的已知的统计算法，基于K、N和{v_i}或P(v)的值确定样品中所述粒子的浓度估值E(C)，

其特征在于，在步骤a)中所述分样品包括具有不同体积的至少两个亚体积。

波兰专利申请PL397028(提交:2011年11月17日；名称:Sposób przeprowadzaniacyfrowych oznaczeńanalitycznych i diagnostycznych)相关的特别是包括所有优选的实施方案和实施例和相关附图的相对于本发明的公开内容以整体并入本文并且还展示了相对于本发明的进一步的发明实施方案。

2.发明C部分的进一步的实施方案：

1.一种用于确定样品中的粒子浓度的方法，包括下列步骤：

a)将所述样品分为N个不相交的亚体积，每个具有体积v_i，其中i为所述亚体积的索引，其中

·要么将所述样品以确定的方式分为亚体积，即这样所述体积v_i通过分析函数f(i)的一系列值或通过预先定义的值组给出，

·要么将所述样品以随机方式分为亚体积，即这样所述亚体积的体积分布对应于概率分布P(v)，意为具有范围(v，v+Δv)内的体积v_i的亚体积的数目通过式：给出。

b)在这样获得的亚体积的每一个中进行将存在的至少一个所述粒子扩增至可测量信号的过程；

c)在所述亚体积的每一个中测量所述信号并对这个亚体积指定参数k_i，其中参数k_i具有等于1的值，如果所述信号测量的结果指示在给定的亚体积中具有至少一个所述粒子以及否则地具有等于0的值，并且i为所述亚体积的编号；

d)用已知的统计学算法基于{k_i}、N和{v_i}或P(v)的值组确定样品中的所述粒子的浓度估值m；

2.其特征在于，在步骤a)中样品被分为其的N个亚体积的每一个的体积v_i是不同的。

波兰专利申请PL397027(提交:2011年11月17日；名称:Sposób przeprowadzaniacyfrowych oznaczeńanalitycznych i diagnostycznych)相关的特别是包括所有优选的实施方案和实施例和相关附图的相对于本发明的公开内容以整体并入本文并且还展示了相对于本发明的进一步的发明实施方案。

3.发明D部分的进一步的实施方案：

1.一种用于确定具有已知体积V_P的样品中未知粒子浓度C_p的方法，包括下列步骤：

a)将具有体积V_P的样品与对于进行将存在的至少一种所述粒子扩增至可测量信号的反应所需的体积V_R的试剂的溶液混合，作为结果，获得包含未知浓度C_S＝C_P·V_P/(V_P+V_R)的所述粒子具有体积V_s的反应溶液，

b)从具有体积V_P的反应溶液和对于进行将存在的至少一种所述粒子扩增至可测量信号的反应所需的试剂的额外的溶液创建每个具有体积u的N个不相交的亚体积，通过这种方式，那些亚体积的每一个包含需要浓度的试剂和给定稀释d_n的所述粒子，其中其中所述索引n指示所述亚体积并为从0至N-1之间的整数，并且C_n表示编号n的亚体积中所述粒子的未知浓度；

c)在每个这样获得的亚体积中进行将存在的至少一个所述粒子扩增至可测量信号的过程；

d)测量每个亚体积中的所述信号并对该亚体积指定参数K_n，其中所述参数K_n具有等于1的值，如果所述信号测量的结果指示在给定的亚体积中具有至少一个所述粒子以及否则地具有等于0的值，并且n为所述亚体积的编号；

e)使用已知的统计学算法，优选地基于贝叶斯公式，基于{k_n}、N和{d_n}的值组确定具有体积V_s的反应溶液中所述粒子的浓度估值E(C_s)；

f)从公式：C_P＝C_S·(V_P+V_R)/V_P确定浓度C_p

2.其特征在于，对于在步骤b)中提及的亚体积的至少两个，稀释d_n是不同的。

波兰专利申请PL397026(提交:2011年11月17日；名称:Sposób przeprowadzaniacyfrowych oznaczeńanalitycznych i diagnostycznych)相关的特别是包括所有优选的实施方案和其实施例和相关附图的相对于本发明的公开内容以整体并入本文并且还展示了相对于本发明的进一步的发明实施方案。

3.发明E部分的进一步的实施方案：

1.一种用于确定已知体积V_s的样品中未知粒子浓度C_s的方法，包括下列步骤：

a)通过将至少一部分样品与进行将存在的至少一个靶粒子扩增至可测量信号的反应所需的某体积的试剂的溶液混合，将所述样品分配至N个分离的隔室中每个体积为v_i以及稀释为d_i，其中0<d_i≤0意为稀释因数，即给定隔室中的粒子浓度C_i与样品中的粒子未知浓度C_s的比例，即d_i＝C_i/C_s，并且i为隔室编号，为0至N-1的整数；

b)在这样产生的每个隔室中进行将存在的至少一个所述粒子扩增至可测量信号的过程；

c)测量每个隔室中的所述信号并对所述隔室指定参数k_n，所述参数k_i假设值1，如果所述测量的结果指示给定的隔室包含至少一个所述粒子，以及在相反的情况下为0；

d)构建矢量k≡{k_i}，指定微态μ，依次包含在步骤c)中测量的k_i参数值；

2.其特征在于

e)样品中的未知的粒子浓度Cs被计算为估值，其为在步骤d)中构建的矢量k的函数并规定微态μ：E(C_s)＝f(μ)，而从步骤a)中产生的隔室当中的至少两个的调制因数z_i值(等于系数z_i＝(v_id_i)/(v₀d₀))彼此不同。

波兰专利申请PL399673(提交:2012年6月26日；名称:Sposób przeprowadzaniacyfrowych oznaczeńanalitycznych i diagnostycznych)相关的特别是包括所有优选的实施方案和其实施例和相关附图的相对于本发明的公开内容以整体并入本文并且还展示了相对于本发明的进一步的发明实施方案。

3.发明F部分的进一步的实施方案：

1.一种用于确定已知体积V_s的样品中未知粒子浓度C_s的方法，包括下列步骤：

a)将所述样品分配至被称为库的N组分离的隔室中，而每组包含N_i’>0个隔室并且在每个组内，式d_iv_i的值通过将至少一部分样品与进行将存在的至少一个靶粒子扩增至可测量信号的反应所需的某体积的试剂的溶液混合设置，其中：v_i意为给定隔室的体积，d_i>0意为稀释因数，即给定隔室中的粒子浓度C_i与样品中的未知粒子浓度C_s的比例，即d_i＝C_i/C_s，并且i为库编号，为0至N-1的整数；

b)在这样产生的每个库的每个隔室中进行将存在的至少一个所述粒子扩增至可测量信号的过程；

c)测量每个隔室中的所述信号，并将所测量的信号映射为编号、矢量、矩阵、或任意阶张量的形式，指定微态μ，其中索引用给定的稀释因数d_i和用给定的体积v_i清楚地鉴定每个隔室，并且具有给定索引组的元件值映射来自那个隔室的信号值；

2.其特征在于

d)样品中的未知的粒子浓度Cs被计算为估值，其为在步骤c)中获得的所述编号、矢量、矩阵或任意阶张量的函数并规定微态μ：E(C_s)＝f(μ)，而从步骤a)中产生的库当中的至少两个的调制因数zi值(等于系数z_i＝(v_id_i)/(v₀d₀))彼此不同。

波兰专利申请PL399908(提交:2012年7月11日；名称:Sposób przeprowadzaniacyfrowych oznaczeńanalitycznych i diagnostycznych)相关的特别是包括所有优选的实施方案和其实施例和相关附图的相对于本发明的公开内容以整体并入本文并且还展示了相对于本发明的进一步的发明实施方案。

实施例：

在本发明的优选的实施方案中，进行定量测定Epstein-Barr病毒DNA的试验。被复制的序列为具有218个碱基对长度的高度保守的EBNA-1基因。使用具有下列序列的引物：正向引物：CTATATGCCTGCTTCCTCCGGCGGACCCGGCCCACAACCTGGC，和反向引物：CGCCGGAGGAAGCAGGCATATAGCGACTCAATGGTGTAAGACGAC。所述方法通过分析测定以每个反应10个副本至10,000个副本的浓度用于实时PCR反应的校准器(包含EBNA-1扩增子的质粒溶液)的DNA浓度的试验的一致性进行验证。

体积V_sample＝20μl的反应混合物每个包含4μl水、1μl10×引物、10μl Master Mix(热启动DNA，Taq聚合酶，dNTP混合物，MgCl₂)，5μl(20/5)[副本/mL]浓度C_sample的DNA模板。对于每个实验，还制备用于稀释所述反应混合物的需要体积的混合物。

在非限制性实例中，将体积V_s＝20μl的反应混合物和用于稀释所述样品的需要体积的试剂混合物储存于由PDMS或聚碳酸酯制备的微流体系统。然后，按需要产生包含相同的体积{u_si}的溶液的液滴和包含体积{u_Ri}的反应试剂的液滴，以便在合并具有相同索引的液滴(u_st+u_Ri≡u)后获得一系列恒定体积u的液滴和已定义数列的未知浓度的靶分子C_i＝C_sample(u_si/u)。

在非限制性实例中，将这样制备的混合物在稀释后以每次20μl用移液器吸取至条(strips)中的试管中。离心后，将所述条放置在LightCycler纳米装置中。

使用下列反应方案：95℃10min的起始变性，然后45个由95℃30s的变性、55℃30s的退火和72℃30s的延伸组成的循环。通过冷却芯片至20℃完成整个程序。计数通道530-548nm中的显示高荧光水平的部分。

实施例1

在优选实施方案中，设计对20μl体积样品的定量测定以便提供从C-＝1mL^-1至C⁺＝10²mL^-1的浓度范围(即C⁺/C^-＝10²)的，具有低于σ_max＝62％的相对标准偏差的所述样品中的DNA分子浓度估值。所述测定返回借助于独立随机变量计算的样品浓度，因此，通过缩放，样品中的浓度估值可转化为储库中的浓度估值。所需要的动态范围通过将样品分配至具有稀释比例C_i/C_sample＝d_i＝xⁱ(其中x＝0.5)的10个分区实现。使用本发明描述中出现的数值算法，估值E(C_sample)基于条件概率分布f(C_sample|μ)进行计算，其中μ为用于进行分析测定的分区系统的微态(参见图5a)和详细附图说明中的各部分)。

在优选实施方案中，Epstein-Barr DNA副本数使用20μl体积的样品进行确定。将反应混合物置于PDMS/聚碳酸酯制成的系统中并按需要产生具有稀释比例di＝xi(其中x＝0.5)的10个液滴。将具有液滴的系统置于热循环仪中，进行PCR反应，随后读出来自每个液滴(系统微态)的信号。

例如，使用包含C_sample＝55.5mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中μ₁＝{1，1，1，1，1，0，0，0，0，0}，在第二个试验中μ₂＝{1，1，1，1，0，0，0，0，1，0，}，在第三个试验中μ₃＝{1，1，1，0，0，0，0，0，0，0，}，在第四个试验中μ₄＝{1，1，1，0，0，0，0，0，0，0}，以及在第五个试验中μ₅＝{1，1，0，1，0，0，0，0，0，0，}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c_i＝E_i(Csample)，c₁＝56.8、c₂＝45.2、c₃＝34.8、c₄＝34.8以及c₅＝27.9mL^-1。

实施例2

在优选实施方案中，设计对20μl体积样品的定量测定以便提供从C-＝5mL^-1至C⁺＝5·10²mL^-1的浓度范围(即C⁺/C^-＝10²)的，具有低于σ_max＝25％的相对标准偏差的所述样品中的DNA分子浓度估值。所述测定返回借助于独立随机变量计算的样品浓度，因此，通过缩放，样品中的浓度估值可转化为储库中的浓度估值。所需要的动态范围通过将样品分配至具有稀释比例d_i＝xⁱ(其中x＝0.917)的86个分区实现。使用本发明的描述中出现的数值算法，估值E(C_sample)基于条件概率分布f(C_sample|μ)进行计算，其中μ为用于进行分析测定的分区系统的微态。在优选实施方案中，Epstein-Barr DNA副本数使用20μl体积的样品进行确定。将反应混合物置于PDMS/聚碳酸酯制成的系统中并按需要产生具有稀释比例d_i＝xⁱ(其中x＝0.917)的86个液滴。将具有液滴的系统置于热循环仪中，进行PCR反应，随后读出来自每个液滴(系统微态)的信号。

例如，使用包含C_sample＝1.5·10²mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中μ₁＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,1,1,0,1,1,1,1,1,1,0,1,1,0,1,1,1,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,1,0,1,0,1}，在第二个试验中μ₂＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,0,0,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,0,1,0,0,0,0,0,1,0,0,1,0,0,0,1,1,1,0,0,1,0}，在第三个试验中μ₃＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,0,1,0,1,1,0,1,0,0,1,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第四个试验中μ₄＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,0,1,1,0,1,1,1,1,0,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,0,0,0,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,1,1}，以及在第五个试验中μ₅＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,1,1,0,0,0,1,0,0,1,0,0,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,0,0,1,0,0,1,0,1,1,1,0,0,1,0,1,1}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c_i＝E_i(C_sample)，c₁＝1.51·10²、c₂＝1.72·10²、c₃＝1.52·10²、c₄＝1.61·10²以及c₄＝1.84·10²[mL^-1]。

实施例3

在优选实施方案中，设计对20μl体积样品的定量测定以便提供从 至的浓度范围(即)的、具有低于σ_{max_1}＝62%的相对标准偏差的，从至的浓度范围(即的、具有低于σ_{max_2}＝25％的相对标准偏差的，以及从至 的浓度范围(即)的、具有低于σ_{max_3}＝62％的相对标准偏差的所述样品中的DNA分子浓度估值。所述测定返回借助于独立随机变量计算的样品浓度，因此，通过缩放，样品中的浓度估值可转化为储库中的浓度估值。所需要的动态范围通过将样品分配至具有稀释比例d_i＝xⁱ(其中x＝0.5)的连续的14个分区，x＝0.917的86个分区以及x＝0.5的14个分区实现。使用本发明的描述中出现的数值算法，估值E(C_sample)基于条件概率分布p(C_sample|μ)进行计算，其中μ为用于进行分析测定的分区系统的微态(参见图5b和详细附图说明中的各部分)。

在优选实施方案中，Epstein-Barr DNA副本数使用20μl体积的样品进行确定。将反应混合物置于PDMS/聚碳酸酯制成的系统中并按需要产生具有稀释比例d_i＝xⁱ(其中x＝0.5)的14个液滴，具有x＝0.917的86个液滴，和具有x＝0.5的14个液滴。将具有液滴的系统置于热循环仪中，进行PCR反应，随后读出来自每个液滴(系统微态)的信号。

例如，使用包含C_sample＝5·10³mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中μ₁＝{1,1,1,1,1,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第二个试验中μ₂＝{1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第三个试验中μ₃＝{1,1,1,1,1,0,0,1,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第四个试验中μ₄＝{1,1,1,1,0,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，以及在第五个试验中μ5＝{1,1,1,1,1,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c_i＝E_i(C_sample)，c₁＝2.30·10³、c₂＝6.12·10³、c₃＝2.14·10³、c₄＝2.90·10³以及c₅＝2.30·10³[mL^-1]。

例如，使用包含C_sample＝1.5·10⁵mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中μ₁＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,0,1,0,1,0,1,0,1,0,1,1,0,1,1,0,1,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第二个试验中μ₂＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,1,0,1,0,0,1,0,1,1,1,0,0,1,1,0,0,0,1,0,0,1,0,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第三个试验中μ₃＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,0,1,0,1,0,1,0,1,0,0,0,1,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第四个试验中μ₄＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,0,0,0,1,1,0,1,0,0,0,0,1,0,0,1,0,0,1,0,1,0,0,1,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第五个试验中μ₅＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,1,0,1,1,1,1,1,0,0,1,0,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值ci＝Ei(Csample)，c₁＝1.45·10⁵、c₂＝1.84·10⁵、c₃＝1.74·10⁵、c4＝1.43·10⁵以及c₅＝1.52·10⁵[mL^-1]。

例如，使用包含C_sample＝5·10⁷mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中μ₁＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,1,0,0,0,0,0,0}，在第二个试验中μ₂＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,1,0,0,0,0,0,0}，在第三个试验中μ₃＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第四个试验中μ₄＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，在第五个试验中μ₅＝{1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,0,0,0,0,0,0,0}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c_i＝E_i(C_sample)，c₁＝2.84·10⁷、c₂＝3.08·10⁷、c₃＝3.42·10⁷、c₄＝3.81·10⁷以及c₅＝3.31·10⁷[mL^-1]。

实施例4

在优选实施方案中，设计对20μl体积样品的本发明定量测定以便提供从c^-＝50[1/mL]至的浓度范围(即(C⁺/C^-)＝10⁵)的、具有低于σ_max＝15％的相对标准偏差的所述样品中的DNA分子浓度估值。所述测定返回借助于独立随机变量计算的样品浓度，因此，通过缩放，样品中的浓度估值可转化为储库中的浓度估值。所需要的动态范围通过将样品分配至具有稀释度(其中x＝0.9886)的474个分区实现。使用本发明的描述中出现的数值算法，一个人可计算出样品中分子的修正的初始浓度估值c_corr＝c2f_corr(c)，其中c＝E(C_sample)为使用条件概率分布P(C_sample|K)计算的、样品中的分子浓度估值，其中K为用权重w_n＝1/d_n计算的来自各分区的信号的加权和。

这样拟定的统计工具(f_corr(c)和c(K)函数)可用于确定样品中靶DNA分子的初始未知浓度。

在优选实施方案中，Epstein-Barr DNA副本数使用20μl体积的样品进行确定。将反应混合物置于PDMS/聚碳酸酯制成的系统中并按需要产生具有稀释度(其中x＝0.9886)的474个液滴。将具有液滴的系统置于热循环仪中，进行PCR反应，随后计算来自每个液滴的信号。显示高荧光水平的来自液滴的信号使用权重w_n＝1/d_n进行加和。

例如，使用包含C_sample＝5·10²mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中K₁＝0.178，在第二个试验中K₂＝0.404，在第三个试验中K₃＝0.292，在第四个试验中K₄＝0.155以及在第五个试验中K₅＝0.212，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c₁＝8.53·10²，c₂＝1.56·10³，c₃＝1.27·10³，c₄＝7.41·10²和c₅＝1.02·10³[mL^-1]。考虑到修正c_corr(c)＝c(K)·f_corr(c)，获得下列估值：c_corr1＝7.84·10²，c_corr2＝1.43·10³，c_corr3＝1.17·10³，c_corr4＝6.80·10²和c_corr5＝9.32·10²[mL^-1]。

例如，使用包含C_sample＝5·10⁵mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中K₁＝54.60，在第二个试验中K₂＝59.62，在第三个试验中K₃＝58.65，在第四个实验中K₄＝62.03以及在第五个试验中K₅＝55.55，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c₁＝3.88·10⁵，c₂＝4.57·10⁵，c₃＝4.38·10⁵，c₄＝4.89·10⁵以及c₅＝3.94·10⁵[mL^-1]。考虑到修正ccorr(c)＝c(K)·f_corr(c)，获得下列估值：c_corr1＝3.99·10⁵，c_corr2＝4.79·10⁵，c_corr3＝4.57·10⁵，c_corr4＝5.17·10⁵和c_corr5＝4.05·10⁵[mL^-1]。

例如，使用包含C_sample＝10⁶mL^-1浓度的基因副本的20μl样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个试验中K₁＝74.99，在第二个试验中K₂＝78.99，在第三个试验中K₃＝77.16，在第四个实验中K₄＝75.85以及在第五个试验中K₅＝79.22，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c₁＝7.48·10⁵，c₂＝8.50·10⁵，c₃＝8.06·10⁵，c₄＝7.80·10⁵和c₅＝8.55·10⁵[mL^-1]。考虑到修正c_corr(c)＝c(K)·f_corr，(c)，获得下列估值：c_corr1＝8.62·10⁵，c_corr2＝1.01·10⁶，c_corr3＝9.47·10⁵，c_corr4＝9.09·10⁵和c_corr5＝1.02·10⁶[mL^-1]。

实施例5

在本发明的优选实施方案中，设计试验以提供从至μL^-1的浓度范围(即)的、具有低于的相对标准偏差的，从至的浓度范围(即)的、具有低于的相对标准偏差的，以及从至的浓度范围(即)的、具有低于的相对标准偏差的样品中的DNA粒子浓度估值。所需要的动态范围通过将样品分配至具有稀释比例C_i/C_s。＝d_i＝xⁱ的N＝38个库的等比数列实现，其中x＝0.5并且第一项d₀v₀＝11.1μL，然而索引从0至9的库具有基数N′₁＝10，索引从10至27的库具有基数N′₂＝40，以及索引从28至37的库具有基数N′₃＝10。使用本发明的描述中出现的数值算法，估值E(C_s)基于条件概率分布f(C_s|μ)进行计算，其中μ为用于进行分析测定的隔室系统的微态。

将反应混合物置于由PDMS/聚碳酸酯制成的系统和N＝38个具有稀释比例C_i/C_s＝d_i＝xⁱ(其中x＝0.5)的文库中，然而索引从0至9的库具有基数N′₁＝10，索引从10至27的库具有基数N′₂＝40，以及索引从28至37的库具有基数N′₃＝10。将具有液滴的系统置于热循环仪中，进行PCR反应，随后读出来自每个液滴(系统的微态)的信号，产生坐标k_i等于属于第i个库的液滴数目的N-维矢量k，以及产生阳性信号。

例如，使用包含C_s＝10²mL^-1浓度的基因副本的样品。在五个重复实验中，获得下列结果：在第一个k₁＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,9,26,18,7,7,2,2,1,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₂＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,9,25,18,7,4,2,2,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₃＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,8,26,17,11,4,5,3,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₄＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,28,16,11,8,2,2,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₅＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,25,14,11,8,3,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c₁＝104±12，c₂＝96±12，c₃＝104±12，c₄＝115±14，以及c₅＝103±12μL^-1。

例如，使用包含Cs＝105mL-1浓度的基因副本的样品。在五个重复实验中，获得下列结果：k₁＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,36,23,14,11,4,1,1,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₂＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,39,34,27,16,9,4,2,3,2,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₃＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,34,24,20,8,3,3,1,0,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₄＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,39,36,27,15,10,10,3,0,0,1,1,0,0,0,0,0,0,0,0,0},k₅＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,39,37,30,19,10,4,3,3,3,2,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}，其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c₁＝(96±10)·10³，c₂＝(98±10)·10³，c₃＝(99±10)·10³,c₄＝(108±11)·10³,以及C₅＝(123±12)·10³μL^-1。

例如，使用包含C_s＝10⁸mL^-1浓度的基因副本的样品。在五个重复实验中，获得下列结果：k₁＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,10,7,8,2,1,2,1,0,0,0},k₂＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,10,8,7,5,2,0,1,0,0,0},k₃＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,10,9,6,1,3,2,0,0,0,0},k₄＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,9,9,6,5,2,1,1,0,0,0},k₅＝{10,10,10,10,10,10,10,10,10,10,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,40,39,10,10,7,4,4,0,1,2,1,0}，其中其中所述索引为重复实验编号。使用为给定的稀释分布提供的统计模型，将这些值再计算为样品中DNA副本的初始浓度估值c₁＝(89±17)·10⁶，c₂＝(103±21)·10⁶，c₃＝(94±19)·10⁶，c₄＝(94±18)·10⁶，以及c₅＝(104±19)·10⁶μL^-l。

Claims (45)

1.用于确定粒子浓度估值E(C)的方法，其中将预定体积的样品分至一定数目的(N)隔室中，在所述(N)隔室的任一个中存在的至少部分粒子提供可测量的信号并且所述粒子的估计浓度E(C)为所测量信号的函数，其特征在于，所述方法包括以下：

a)确定分离的隔室的数目(N)，其中所述数目(N)小于或等于以下函数的值

$N_{MAX}=A\&CenterDot;ln\left(\frac{C^{+}}{C^{-}}\right)/{\mathrm{\&sigma;}}_{MAX}^2$

其中(A)表示为整数6的实数，

其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)的区间的预定上限，

其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)的区间的预定下限，

其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值E(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

b)确定调制因数(z_i)，其中(z_i)为所述(N)隔室的至少部分中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数；并将所述样品分至(N)隔室，其中两个或更多个所述(N)隔室的至少部分包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品，

其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述(N)隔室的索引号，并且

其中(v_i)表示所述体积以及(d_i)表示所述隔室(i)中的样品的稀释因数；

c)任选地用一种或多种合适的试剂和任选的一种或多种稀释剂扩增隔室的粒子以获得指示隔室中预定临界数目的粒子的存在的可测量信号，

d)测量所述(N)隔室的每一个中的所述信号并对至少部分隔室指定值(k_i)，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号并且如果隔室(i)包含预定临界数目的粒子或更多粒子，就对隔室(i)指定第一值(k_i)，如果隔室(i)包含少于指示第一值的临界数目的粒子，就对隔室(i)指定第二值(k_i)，以及

e)确定粒子的估计浓度E(C)，其中粒子的估计浓度E(C)通过以下函数确定：

i.第一和/或第二值(k_i)的加和K，和/或

ii.加权的第一和/或第二值(w_ik_i)的加和K，其中所述值(k_i)的至少一部分用权重值(w_i)进行调制，其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述隔室的索引号，和/或

iii.微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含表示微态μ的反映步骤e)中测量的值(k_i)的至少一部分的信息。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述调制因数(z_i)通过函数z_i＝(v_id_i)/(v₀d₀)或其类似函数确定，其中所述类似函数表达关于隔室中粒子估计数目的逐对差异的信息，

其中(i)、(v_i)和(d_i)如权利要求1中所定义的并且

其中(v₀)表示参照隔室中的样品的体积以及(d₀)表示参照隔室中的样品的稀释因数，其中所述参照隔室与隔室(i)不同。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述参照隔室表示(N)隔室系列中的第一隔室。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中1％所述(N)隔室在调制因数(z_i)的值上彼此不同。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中5％的所述(N)隔室在调制因数(z_i)的值上彼此不同。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中25％的所述(N)隔室在调制因数(z_i)的值上彼此不同。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中50％的所述(N)隔室在调制因数(z_i)的值上彼此不同。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中75％的所述(N)隔室在调制因数(z_i)的值上彼此不同。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b)中100％的所述(N)隔室在调制因数(z_i)的值上彼此不同。

10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b)中调制因数(z_i)的值基于良好定义的幂序列，指数序列，多项式序列或者等比序列或者基于预先确定的在隔室组中的分布，或者它们的组合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述预先确定的在隔室组中的分布通过高斯分布确定。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b)中将所述样品以这样的体积(v_i)和稀释因数(d_i)分配至(N)隔室以满足以下条件：

(v_i+1d_i+1)/(v_id_i)＝z_i+1/z_i＝x

其中x>0且x≠1，将隔室的数目(N)设置为不小于由以下函数确定的值的整数：

$N=\mathrm{\&Delta;}N+{\log }_x\left(\frac{C^{-}}{C^{+}}\right)$

其中(ΔN)为不小于由以下函数确定的值的整数：

ΔN＝4.5637(1-x)^-0.798

并且其中d_ov_o的值由以下函数确定：

$d_o{v}_o=ln2\&CenterDot;x^{-\mathrm{\&Delta;}N/2}\left(\frac{1}{C^{-}}\right)$

其中(C⁺)，(C^-)，(d_o)和(v_o)如权利要求1和2中所定义的。

13.根据权利要求11所述的方法，其中(x)的值由0.1,0.5,0.8,0.9,0.91,0.92,0.93,0.94,0.95,0.96,0.97,0.98,0.99,1.01,1.02,1.03,1.04,1.05,1.06,1.07,1.08,1.09,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,2或10表示。

14.根据权利要求12所述的方法，其中系数x＝(v_i+1d_i+1)/(v_id_i)通过以下函数确定：

$x=1-{\left(\frac{{\mathrm{\&sigma;}}_{max}}{0.8955}\right)}^{1/0.513}$

其中(σ_MAX)如权利要求1和2中所定义的。

15.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中在步骤b)中将所述样品以这样的体积(v_i)和稀释因数(d_i)分配至(N)隔室以满足以下条件：其中(A)和(B)表示相互独立的任意实数，其中(C⁺)，(C^-)和(σ_MAX)如权利要求1中所定义的。

16.根据权利要求15所述的方法，其中A＝1/C⁺和/或B＝[1.95·ln{(C⁺/C^-)/N}]^0.856，

其中(C⁺)，(C^-)如权利要求1中所定义的。

17.根据权利要求15所述的方法，其中将所述样品分至(N)隔室

$N=2\&CenterDot;{\mathrm{\&sigma;}}_{MAX}^{-1.9}\&CenterDot;{\left(\frac{C^{+}}{C^{-}}\right)}^{0.25}$

其中(C⁺)，(C^-)和(σ_MAX)如权利要求1中所定义的。

18.根据权利要求15所述的方法，其中将所述样品分至(N)隔室

$N=2\&CenterDot;{\mathrm{\&sigma;}}_{MAX}^{-1.94}\&CenterDot;{\left(\frac{C^{+}}{C^{-}}\right)}^{0.22}$

其中(C⁺)，(C^-)和(σ_MAX)如权利要求1中所定义的。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定临界数目的粒子为一个、两个、三个或更多。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少部分为全部。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和/或第二值(k_i)的加和K使用校准修正函数进行修正。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述值(k_i)的至少一部分用权重值(w_i)进行调制是每个值(k_i)用权重值(w_i)进行调制。

23.根据权利要求22所述的方法，其中权重值(w_i)与编号(i)的隔室的体积和/或稀释的程度成反比。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述加权的第一和/或第二值(w_ik_i)的加和K使用校准修正函数进行修正。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含表示微态μ的反映步骤e)中测量的值(k_i)的至少一部分的信息是包含矢量k≡{k_i},，其中所述矢量(k)包含步骤e)中测量的值(k_i)的至少一部分。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一部分是全部。

27.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b)中将所述样品分配至若干一定数目的(N_LIB)两个或更多分离组的隔室(库)，每个库组用(j)进行索引编号并含有N_j’>0个隔室，相同库中的每个隔室包含具有相同调制因数(z_j)值的一部分样品体积，其中z_j为库组(j)中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，并且其中所述N_LIB个分离的库组j通过不同的调制因数(z_j)值彼此区分，其中j表示由整数0至N_LIB-1表示的库组数目(N_LIB)的索引号。

28.根据权利要求27所述的方法，其中调制因数(z_j)通过函数z_j＝(v_jd_j)/(v₀d₀)或其类似函数进行确定，其中所述类似函数表达关于隔室中粒子估计数目逐对差异的信息，

其中(v_j)表示库组(j)的隔室中的样品的体积并且(d_j)表示库组(j)的隔室中的样品的稀释因数并且

其中(v₀)表示所选择的参考库组(j)的隔室中的样品的体积以及(d₀)表示所选择的参考库组(j)的隔室中的样品的稀释因数。

29.根据权利要求27所述的方法，其中在步骤b)中至少部分数目(N_LIB)的库组(j)中的每个库组(j)包含N_j’＝N’个隔室，并且满足以下条件：

(v_j+1d_j+1)/(v_jd_j)＝z_j+₁/z_j＝x

其中x>0且x≠1。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少部分数目是全部数目。

31.根据权利要求29所述的方法，其中以下函数：

$x_{max}=1-{\left(\frac{{\mathrm{\&sigma;}}_{max}}{0.8955}\right)}^{1/0.513}$

表示系数(x)的最大优选值，其中将系数(x)调至执行所述方法的技术优选值，并且将每个库组(j)中的隔室数目N_j’设置为不小于通过以下函数确定的值的整数：

$N_j^{\&prime;}={\left(\frac{0.8955}{{\mathrm{\&sigma;}}_{max}}\right)}^2{(1-x)}^{1.026}$

并且将分离的库组(j)的数目(N_LIB)设置为不小于由以下函数确定的值的整数：

$N_{LIB}={\log }_x\left(\frac{C^{-}}{C^{+}}\right)+{\mathrm{\&Delta;N}}_{LIB}$

其中

ΔN_LIB＝4.5637(1-x)^-0.798

并且其中通过以下函数确定：

$d_0{v}_0=\ln 2\&CenterDot;x^{-\mathrm{\&Delta;}N/2}\&CenterDot;\frac{1}{C^{-}}$

其中(C⁺)，(C^-)和(σ_MAX)如权利要求1中所定义的，并且(d₀)和(v₀)如权利要求2中所定义的。

32.根据权利要求27所述的方法，其中对N_LIB个库组(j)的至少一部分指定值所述值为对步骤d)中的库组(j)所包含的隔室的每一个指定的至少部分值(k_i)的函数，并随后将所述值绘制为微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含表示微态μ的反映至少部分值的信息。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述N_LIB个库组(j)的至少一部分指定值是对所述N_LIB个库组(j)的每个指定值

34.根据权利要求32所述的方法，其中指定的至少部分值(k_i)是指定的全部值(k_i)。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述包含表示微态μ的反映步骤e)中测量的值(k_i)的至少一部分的信息是包含矢量k≡{k_i},，其中所述矢量(k_LIB)包含至少部分值

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少部分值是全部值

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述所述值包含对步骤d)中的库组(j)所包含的隔室的每一个指定的值(k_i)的加和。

38.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中两种或更多种不同的粒子和/或基本上相同的粒子的两个或更多不同部分的浓度被确定，其中存在于所述(N)隔室的任一个中至少部分所述不同粒子和/或基本上相同的粒子的不同部分提供两个或更多可区别的可测量信号，其中所述(N)隔室的任一个中的所述两个或更多可区别的信号被测量并且其中对于所述(N)隔室的每一个，分别指定两个或更多不同的值，其中所述不同的值彼此独立地表明在所述隔室中是否存在临界数目的相同粒子和/或基本上相同的粒子的相同部分。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述至少部分是全部。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述不同粒子和/或基本上相同的粒子的不同部分被放大以提供两个或更多可区别的可测量信号。

41.用于根据权利要求1至40的任一项确定粒子的浓度的装置，其特征在于，所述装置被配置为包括：

单元a)，用于确定分离隔室的数目(N)的单元，其中所述数目(N)小于或等于以下函数的值

$N_{MAX}=A\&CenterDot;ln\left(\frac{C^{+}}{C^{-}}\right)/{\mathrm{\&sigma;}}_{MAX}^2$

其中(A)表示为整数6的实数，其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定上限，其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定下限，其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

单元b)，用于确定调制因数(z_i)，其中(z_i)为至少部分(N)隔室中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，这样两个或更多个所述(N)隔室的至少部分包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品，其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述(N)隔室的索引号，并且其中(v_i)表示体积，(d_i)表示隔室(i)中的预定体积的样品的稀释因数；

任选的单元c)，用于用一种或多种合适的试剂和任选的一种或多种稀释剂扩增隔室的粒子以获得指示隔室中预定临界数目的粒子的存在的可测量信号，

单元d)，用于测量所述(N)隔室的每一个中的所述信号并对至少部分隔室指定值(k_i)，其中(i)表示由整数0至N-1表示的隔室的索引号并且如果隔室(i)包含预定临界数目的粒子或更多粒子，就对隔室(i)指定第一值(k_i)，如果隔室(i)包含少于指示第一值的临界数目的粒子，就对隔室(i)指定第二值(k_i)，以及

单元e)，用于确定粒子的估计浓度E(C)，其中粒子的估计浓度E(C)通过以下函数确定：

i.第一和/或第二值(k_i)的加和K，和/或

ii.加权的第一和/或第二值(w_ik_i)的加和K，其中所述值(k_i)的至少一部分用权重值(w_i)进行调制，其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述隔室的索引号，和/或

iii.微态μ的编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它清楚的表示，其中所述编号、矢量、矩阵、任意阶张量或任何其它表示包含表示微态μ的反映步骤e)中测量的值(k_i)的至少一部分的信息。

42.根据权利要求1至40的任一项所述的方法或根据权利要求41所述装置对于以下的应用

a)减少包含预定样品体积的隔室的总数目(N)和/或

b)减少全部(N)隔室中的包含样品、适合于扩增至少部分粒子至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂的混合物的总体积和/或

c)预先确定每个(N)隔室中的包含样品、适合于扩增至少部分粒子至可测量信号的一种或多种试剂和任选的一种或多种稀释剂或由其组成的混合物的体积，和/或

d)预先确定将预先确定的样品体积分配至所述(N)隔室的调整因数(z_i)。

43.根据权利要求42所述的应用，其中所述混合物的体积是最小或最大体积。

44.根据权利要求42所述的应用，其中所述调整因数(z_i)是最小或最大适合的调制因数。

45.样品架在根据权利要求1至40的任一项确定粒子浓度的方法中的应用，其特征在于，所述样品架被配置为

a)包含预定数目(N)的隔室或由组成，其中所述数目(N)小于或等于函数的值

其中(A)表示为整数6的实数，其中(C⁺)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定上限，其中(C^-)表示要以所述方法估计的浓度(C)区间的预定下限，其中(σ_MAX)表示粒子浓度估值(C)的预定的最大可允许的相对标准偏差，其中C^-<C<C⁺，以及

b)其中所述(N)隔室被配置为包含具有预定的调整因数(z_i)的预定的样品体积，其中(z_i)为至少部分所述(N)隔室中的样品的体积(v_i)和稀释因数(d_i)的函数，这样两个或更多所述(N)隔室的至少部分包含不同样品体积(v_i)和/或不同稀释因数(d_i)的样品或由组成，其中(i)表示由整数0至N-1表示的所述(N)隔室的索引号，并且其中(v_i)表示体积，(d_i)表示隔室(i)中的样品的稀释因数。