CN104046638A - 一种拟南芥aap1基因的克隆及植物表达载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法，用TRIzol法提取拟南芥幼苗的总RNA，测定OD260/OD280比值，为2.014；将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD-18T载体进行连接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，经过质粒PCR验证，获得了1600bp的DNA条带；测序后发现该基因ORF1458bp，编码485个氨基酸的多肽，用限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的基因和pCAMBIA3300载体分别酶切后，将目的基因定向连接到植物表达载体上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR及酶切验证；质粒PCR验证，获得了一条为1600bp的DNA条带；经过酶切验证，分别获得了8300bp的pCAMBIA3300载体与为1600bp的目的片段；说明载体构建成功，重新命名为p3300-AAP1。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法。
背景技术
植物种子贮藏蛋白的合成受多重因素的调节，蛋白积累很大程度上取决于氨基酸的供应。若氨基酸供应充足，即可极大地提高植物体内蛋白质的含量。氨基酸透性酶(AAP)基因是拟南芥中重要的氨基酸转运蛋白，在主根、侧根、根毛及根表皮细胞中发挥重要作用，Yong等研究表明，过表达AAP1基因可以显著提高了拟南芥中中性氨基酸、谷氨酸盐和组氨酸的吸收能力，使得根部组氨基酸含量明显上升，继而使蛋白含量升高。AAP是由完整的膜蛋白与H+耦合催化氨基酸摄取。AAPs由多基因家族编码，拟南芥中由八个成员组成，利用基因工程过表达AAP1基因，能够显著改善植物根系氨基酸的利用效率，使得根部组氨酸含量明显上升；AAP1基因在种子中过量表达，可增加种子库的氮含量，提高植物氮等营养元素，并且可以调节贮藏蛋白的合成；在酵母中表达AAP时，对氨基酸侧链具有低选择性。在不同细胞类型的差异表达，表明AAPs在韧皮部对氮的吸收和运输具有特异性。
目前人们已从分子水平上研究氨基酸载体或转运蛋白。拟南芥、蓖麻等植物的氨基酸转运蛋白基因已被分离和鉴定。Chen和Bush将拟南芥ESTcDNAs克隆至缺失氨基酸转运蛋白的酵母中表达，发现拟南芥细胞质膜存在转运赖氨酸和组氨酸的专一性转运蛋白(LHT1)，拟南芥大约有8个氨基酸转运载体AAP1-8。AAP1主要运输带负电荷和中性的氨基酸，AAP2和AAP4主要运输苯丙氨酸、缬氨酸以及脯氨酸，AAP3与AAP5主要运输赖氨酸和精氨酸。Boorer和Fisher将在根中表达量多的拟南芥氨基酸转运子AAP5克隆到爪蟾(Xenopus)卵母细胞内表达，发现AAP5能转运中性、酸性和碱性等多种氨基酸，但转运氨基酸以固定的H+∶氨基酸＝1∶1进行。由于AAP1基因具有转运氨基酸的作用，能使得植物中氨基酸含量增加，我们设想可以将AAP1基因转入普通玉米种，培育出高蛋白玉米，高蛋白玉米具有必需氨基酸含量高、营养富集等特点，是畜牧业养殖的优质饲料；普通玉米的饲用价值高于其它谷物，高蛋白玉米的饲料价值更优于普通玉米，并且AAP1在玉米中的应用和关键技术创新工作，国外未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法，进一步研究拟南芥AAP1基因的功能，本研究从拟南芥中克隆了AAP1基因，构建了拟南芥AAP1基因的植物表达载p3300-AAP1，以及今后利用AAP1基因进行氨基酸、高蛋白植物的遗传转化提供理论及实验基础。
其具体技术方案为：
一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)用TRIzol法提取到拟南芥幼苗的总RNA，反转录成cDNA后，根据Primer5.0设计引物进行RT-PCR，上游引物带有EcoR I酶切位点，下游引物带有Xba I酶切位点：
上游引物：5’CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’
下游引物：5’GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’
2)将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD-18T载体进行连接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，经过质粒PCR验证，获得了大约1600bp的DNA条带；经过双酶切验证，分别获得了2692bp的载体与大约1600bp的目的片段，可初步证明，已经成功克隆出拟南芥AAP1基因；
3)获得1600bp左右的目的条带，测序后发现该基因ORF1458bp，编码485个氨基酸的多肽，根据氨基酸序列推出，该基因编码一个氨基酸透性酶；在线对蛋白氨基酸序列进行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle(K-D)法计算氨基酸的亲水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸处具有疏水性较强的特性，大约在第37个氨基酸和360-370氨基酸左右区域具有较强的亲水性；
4)用限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的基因和pCAMBIA3300载体分别酶切后，将目的基因定向连接到植物表达载体上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR及酶切验证；质粒PCR验证，获得了一条约为1600bp的DNA条带；经过酶切验证，分别获得了约8300bp的pCAMBIA3300载体与约为1600bp的目的片段；说明载体构建成功，重新命名为p3300-AAP1。
本发明的有益效果：
由于AAP1基因具有转运氨基酸的作用，能使得植物中氨基酸含量增加，我们设想可以将AAP1基因转入普通玉米品种，培育出高氨基酸、高蛋白玉米新材料，高氨基酸、高蛋白玉米具有必需氨基酸含量高、营养富集等特点，是畜牧业养殖的优质饲料；普通玉米的饲用价值高于其它谷物，氨基酸、高蛋白高蛋白玉米的饲料价值更优于普通玉米，并且AAP1在玉米中的应用和关键技术创新工作，国外未见相关报道。本实验成功克隆拟南芥AAP1基因并构建p3300-AAP1植物表达载体，为进一步研究拟南芥AAP1在氨基酸代谢过程中的功能奠定了基础，而且还为高氨基酸、高蛋白玉米新材料创制提供了载体。
附图说明
图1为从拟南芥中提取的RNA；
图2为拟南芥AAP1PCR结果的电泳图，M，DL2000Marker；1.PCR产物；
图3为拟南芥AAP1基因克隆质粒PCR及酶切验证，1、2质粒PCR验证，3、4质粒酶切验证；
图4为pCAMBIA3300-AAP1植物表达载体构建流程；
图5为拟南芥AAP1基因重组质粒PCR及酶切验证，1、2、3、4、5重组质粒PCR验证，1’、2’、3’、4’、5’重组质粒酶切验证。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明遗传资源拟南芥采集于中国吉林省长春市。
1材料与方法
1.1实验材料
实验材料：野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)，pCAMBIA3300菌种(吉林农业大学生化研究室保藏)，反转录试剂盒(GeneCopoeia公司)，Trizol、限制性内切酶EcoR I、Xba I、T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒等均购自TaKaRa公司。
1.2方法
1.2.1拟南芥总RNA提取
取新鲜的拟南芥幼苗1g，于液氮环境中迅速研磨成粉，用TRIzol试剂盒，按照说明书提取拟南芥总RNA，-80℃冰箱中保存总RNA。
1.2.2第一链cDNA的合成
用试剂盒“ALL-in-One First-strand cDNA Synthesis Kit”合成第一链cDNA。步骤如下：取1μg的总RNA，加入OligdT1.0μl，ddH2O补充至13μl，65℃10min后迅速置于冰上；再依次加入下列各种成分：5×RT Reaction Buffer5.0μl，25mM dNTP1.0μl，25U/μl RNaseInhibitor1.0μl，200U/μl M-MLV RTase1μl，ddH2O4.0μl，42℃60min，85℃5min，之后置于-20℃冰箱保存反转录后的cDNA。
1.2.3AAP1基因的克隆
根据Primer5.0设计引物进行RT-PCR，上游引物带有EcoR I酶切位点，下游引物带有Xba I酶切位点：
上游引物：5’CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’
下游引物：5’GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’
以反转录后的cDNA为模板进行PCR扩增。25μl扩增体系，含10×Ex Taq buffer2.5μl；2.5mM dNTP mix2.5μl；10μmol·L-1正、反向引物各1μl；cDNA1μl；Ex Taq0.5μl；ddH2O17.5μl。扩增程序为：94℃3min；94℃30s；58℃30s；72℃1m30s；72℃10min；4℃保温，35个循环。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的片段并与pMD-18T载体连接，然后转化大肠杆菌E.coli DH5α，提取质粒，经质粒PCR和双酶切鉴定后，选择阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序。
1.2.4p3300-AAP1植物表达载体构建
对AAP1基因和植物表达载体PCAMBIA3300分别用EcoR I和Xba I进行双酶切。20μl酶切体系中，质粒10μl，EcoR I和Xba I各1μl，10×M Buffer2μl，ddH2O6μl，37℃反应4h，电泳回收目的条带。将拟南芥AAP1基因与pCAM BIA3300植物表达载体用T4连接酶16℃过夜连接。转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选阳性重组表达质粒并进行PCR及酶切验证。
2结果与分析：
2.1拟南芥总RNA的提取
用TRIzol法提取到拟南芥幼苗的总RNA，并用NANO DROP2000测定总RNA含量，OD260/OD280为2.014。用1％的琼脂糖变性胶电泳，三条带清晰，证明总RNA完整性较好，纯度较高，可用于后续反转录和RT-PCR实验(图1)。
2.2拟南芥AAP1基因的克隆及序列分析
将提取的总RNA逆转录合成cDNA做模板，对拟南芥AAP1基因特异性引物进行PCR扩增，获得一条约为1615bp的DNA条带，与预测的目的片段大小一致。
将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD-18T载体进行连接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证(图2)，经过质粒PCR验证，我们获得了大约1615bp的DNA条带。经过双酶切验证，我们分别获得了2692bp的载体与1615bp的目的片段，可初步证明，我们已经成功克隆出拟南芥AAP1基因。
将克隆后的基因送与测序公司进行测序，测序结果与Genebank(NM_104616.4)中公布的已知序列进行比对，由比对结果可知，从拟南芥中克隆的AAP1基因序列与GenBank中发表的序列比对，只有817bp处有一个碱基的差别，同源性达到了99.93％，进一步证明成功克隆出拟南芥AAP1基因。
测序成功后将测序所得的序列进行生物信息学分析，通过在线软件ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)对AAP1目的基因进行分析，对所预测的氨基酸序列理化性质进行细致的分析，由图中我们可知：拟南芥AAP1基因编码的氨基酸序列氨基酸数(number of amino acids)是485个，分子质量(molecular weight)为52865.4Da，理论等电点(theoretical pI)8.99，正、负电荷残基总数(total number of positively/negatively chargedresidues)分别是：37和27，氨基酸成分(atomic composition)由C、H、N、O、S元素组成，分子式(formula)C2434H3736N606O667S22，在组成拟南芥AAP1蛋白的20种氨基酸中丙氨酸(Ala)所占比例最高，达到9.9％，而色氨酸(Trp)所占比例最低，仅为1.6％。原子总数(total number of atoms)为7465，不稳定系数(instability index)为32.56，表明是一种比较稳定的蛋白。脂肪系数(aliphatic index)为95.15。总平均亲水性(grand average ofhydropathicity，GRAVY)为0.423。
ProtParam分析拟南芥AAP1蛋白氨基酸序列。
本研究根据SignalP4.1server对所预测的氨基酸序列进行分析，验证其是否具有信号肽及其位置，C score表示剪切位点分值(C值)，S score表示信号肽分值(S值)，Y score表示综合剪切点分值(Y值)。经过分析得知，分析值中的mean S-score＝0.5，所以无信号肽。
拟南芥AAP1蛋白氨基酸序列SignalP4.1server分析。
利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对拟南芥AAP1氨基酸序列进行跨膜区分析，结果发现在拟南芥AAP1的氨基酸序列中除3个的跨膜区域外，但对于整个拟南芥AAP1氨基酸序列来说均不在跨膜区。
拟南芥AAP1蛋白氨基酸序列TMHMM分析。
采用PortScale(http//www.expasy.org/cgi-bin/portscale.pl)程序对预测的拟南芥AAP1蛋白氨基酸序列进行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle(K-D)法计算氨基酸的亲水性或疏水性。程序中分析得知，第460氨基酸处具有疏水性较强的特性，大约在第37个氨基酸和360-370氨基酸左右区域具有较强的亲水性。
2.3拟南芥AAP1植物表达载体的构建
为了能将AAP1转入到拟南芥中，我们需要将AAP1基因构建到植物表达载体上，用限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的基因和pCAMBIA3300载体分别酶切后，将目的基因定向连接到植物表达载体上，将改造后的载体命名为p3300-AAP1。
将目的片段连接到pCAMBIA3300上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR及酶切验证，经过质粒PCR验证，我们获得了一条约为1600bp的DNA条带。经过酶切验证，
我们分别获得了约8300bp的pCAMBIA3300载体与约为1600bp的目的片段。用特异引物对重组质粒进行测序验证，结果与拟南芥AAP1测序结果完全相同。证明，我们已经成功构建p3300-AAP1载体。
Claims (1)
1.一种拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用TRIzol法提取到拟南芥幼苗的总RNA，反转录成cDNA后，根据Primer5.0设计引物进行RT-PCR，上游引物带有EcoR I酶切位点，下游引物带有Xba I酶切位点：
上游引物：5’CGGAATTCATGAAGAGTTTCAACACAG3’
下游引物：5’GCTCTAGATTGGAAGAGCTCATATGTAT3’
2)将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD-18T载体进行连接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，经过质粒PCR验证，获得了1600bp的DNA条带；经过双酶切验证，分别获得了2692bp的载体与1600bp的目的片段，可初步证明，已经成功克隆出拟南芥AAP1基因；
3)获得1600bp左右的目的条带，测序后发现该基因ORF1458bp，编码485个氨基酸的多肽，根据氨基酸序列推出，该基因编码一个氨基酸透性酶；在线对蛋白氨基酸序列进行疏水性分析，此程序采用的是Kyte&Doolittle(K-D)法计算氨基酸的亲水性或疏水性；程序中分析得知，第460氨基酸处具有疏水性较强的特性，在第37个氨基酸和360-370氨基酸左右区域具有较强的亲水性；
4)用限制性内切酶EcoR I和Xba I将目的基因和pCAMBIA3300载体分别酶切后，将目的基因定向连接到植物表达载体上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR及酶切验证；质粒PCR验证，获得了一条为1600bp的DNA条带；经过酶切验证，分别获得了8300bp的pCAMBIA3300载体与为1600bp的目的片段；重新命名为p3300-AAP1。
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Cited By (2)
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| CN108220305A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-06-29 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟草氨基酸透性酶NtAAP2基因及其应用 |
| CN113373166A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-09-10 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟草NtAAP3基因在烟草中应用 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| GENBANK: "Arabidopsis thaliana amino acid permease 1 mRNA,complete cds", 《NCBI》 * |
| LEE YH,ET AL: "AAP1 transports uncharged amino acids into roots of Arabidopsis", 《PLANT J》 * |
| SANDERS A,ET AL: "AAP1 regulates import of amino acids into developing Arabidopsis embryos", 《PLANT J》 * |
| 崔喜艳等: "玉米MAPK5基因片段的克隆及RNA干扰载体的构建", 《吉林农业大学学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108220305A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-06-29 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟草氨基酸透性酶NtAAP2基因及其应用 |
| CN113373166A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-09-10 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 烟草NtAAP3基因在烟草中应用 |
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