CN104031831A - 一种血细胞分离管和单个核细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血细胞分离管以及分离单个核细胞的方法。所述的血细胞分离管由分离管管体、旋盖以及置于管体内的细胞分离隔膜和加样滑板(辅助加样装置)组成。本发明还公开了使用该血细胞分离管分离单个核细胞的方法，该方法基于细胞密度梯度离心分离细胞的原理，通过改变加样和取样方式使传统的、复杂的加样模式变成易于操作的方式。本发明提供的血细胞分离管及方法可以使临床医学检验和细胞生物学研究中的细胞分离过程更简化、操作更容易。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域的细胞分离技术。本发明提供的血细胞分离管以及分离单个核细胞的方法基于细胞密度梯度离心分离细胞的原理，通过改变加样和取样方式使传统的、复杂的加样模式变成易于操作的方式。
背景技术
在临床医学检验中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查常常涉及到细胞的分离技术，从外周血液和各种体液(胸水、腹水、心包积液等)中分离单个核细胞是体外进行淋巴细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后续实验可靠性的重要环节。
外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是参与机体免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMCs主要包含淋巴细胞和单核细胞，PBMCs中大部分(80％～90％)为淋巴细胞，其余成分是单核细胞，淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞两大类，这两种免疫细胞按其细胞表面标志和细胞功能又分为不同的细胞亚群，按照淋巴细胞表面标志T淋巴细胞有CD3+、CD4+、CD8+、CD28+、CD38+、CD45+细胞等等，按照功能分还有辅助T细胞(helper T cell，Th)、效应T细胞(Effector T cells，Te)、迟发性变态反应T细胞(Delayed type hypersensitivity T cells，Td)和细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells，Tc)等等；B淋巴细胞有B1、B2两种亚型，对不同淋巴细胞亚群的分离、鉴别以及功能的研究对疾病的诊断乃至治疗都有十分重要的临床意义。
任何疾病的发生、发展都有相应淋巴细胞的数量、形态或者功能的改变，从细菌、病毒等一些病源微生物对人类的感染到肿瘤的发生以及一些免疫缺陷病、自身免疫性疾病和遗传性疾病等许多疾病都有淋巴细胞参与的应激性免疫反应，表现为某些细胞亚群数量的改变、淋巴细胞膜表面标志物的变化或者引起细胞功能的变化(细胞因子的分泌或抗体的产生)，例如结核分枝杆菌侵入人体后会迅速被体内的淋巴细胞所识别，从而引起相应的细胞免疫反应，导致初始淋巴细胞在结核抗原刺激下转化成效应T淋巴细胞，这些效应T淋巴细胞再次受到结核杆菌特异性抗原刺激后会产生相应的细胞因子γ-干扰素，体外检测这些分泌γ-干扰素的效应T淋巴细胞对于诊断结核分枝杆菌感染具有重要的临床意义。
淋巴细胞的分离方法有多种，这些分离方法的原理是根据各种细胞间的密度差异、细胞的粘附特性或者细胞膜表面标志的不同等物理的和生物学性能而设计的，主要方法包括粘附分离法、密度梯度离心法、免疫磁珠法和流式细胞仪法等。
粘附分离法是根据细胞对玻璃、尼龙棉等不同材质接触表面的粘附差异分离细胞的，被分离的混合细胞流经吸附物体表面时粘附性高的细胞附着在吸附物表面，粘附性低的随液流被冲走。中国专利CN87102643A公布一种基于细胞粘附性质设计的细胞分离器，该专利对细胞吸附材料的制作进行优化，目的是提高分离细胞的纯度和比例。粘附分离法分离目的细胞的回收率除了与选择的吸附材料有关外，还与分离时控制输入细胞的流速有关，为此中国专利CN200520134012公布了一项微流体细胞分离装置的制作方法，该装置在控制被分离的混合细胞流速方面做了一些尝试。粘附分离法需要控制被分离混合细胞的输入速度，操作比较麻烦，这种方法细胞分离纯度不高、回收率也低。
免疫磁珠法是应用抗原抗体特异性结合的原理分离细胞的，在各类淋巴细胞亚群的细胞膜上有不同的分化抗原，利用标记不同单克隆抗体的免疫磁珠与具有相同抗原表位的淋巴细胞特异性结合，然后在磁力场或者离心力的作用下将不同的淋巴细胞分离，这种分离细胞的方法如同用鱼饵钓鱼，免疫磁珠相当于鱼饵，由于具有特异性结合的特性，所以免疫磁珠法具有分离纯度较高的特点，通常分离纯度能达到90％～99％，细胞的收获率也相对较高，但是，免疫磁珠分离的淋巴细胞的效果和活力受磁珠的种类和标记抗体的影响，而且成本高。
流式细胞分离法是20世纪70年代发展起来的细胞鉴定和分选技术，它将激光技术、计算机技术、电子物理技术、光电测量技术、荧光化学技术以及单克隆抗体技术融合，使流式细胞仪得以诞生。流式细胞仪将细胞的分离和鉴别合二为一，其分离细胞的原理是：细胞液流在高频超声振荡波的作用下分成均匀的含单个细胞的微小液滴，液滴在交变电场的作用下极化成带有不同电荷微粒，不同种类的细胞极化后带的电荷密度不一样，这些带电微粒在电场力的作用下发生偏离，由此实现对带有不同表面抗原的淋巴细胞分离。如果将液流中的某些细胞预先用荧光染色抗体或者DNA染料标记，标记的细胞会被流式细胞仪中的光电检测系统识别，从而实现对细胞的自动分析。目前，流式细胞分离技术已经比较成熟，流式细胞术在分选细胞的同时还可以同时检测细胞的DNA含量、细胞体积、细胞膜受体和表面抗原以及细胞所处周期等许多生物信息，但是，用流式细胞术分选细胞成本较高，分离过程可能对细胞有损伤，从而影响细胞的活性。另外，该方法不能进行无菌操作，这使得分选的细胞不宜再做培养方面的研究。
免疫磁珠法和流式细胞分离法分离的淋巴细胞对分离样本有选择，通常这两种方法使用的样本是经过密度梯度离心方法分离获得的混合淋巴细胞，这也是上述两种方法能获得较高纯度的重要原因。
在多种细胞分离方法当中，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法是分离淋巴细胞最传统和经典的方法，这种方法是利用密度接近单个核细胞的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)细胞分离液分离目的细胞的，原理是利用人类血液中各种血细胞之间存在密度差异，例如红细胞密度为1.090～1.093，粒细胞密度为1.090～1.092，单个核细胞的密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。Ficoll-Hypaque是一种密度为1.077±0.001g/L与血浆等渗的低粘度混合溶液，如果将全血叠加在Ficoll-Hypaque分离液上面在离心力场的作用下，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集，红细胞与粒细胞由于密度较大，离心后沉降在分离液的底部，血浆和血小板密度较低，离心后悬浮在分离液的上面，单个核细胞密度接近于分离液，由于分离液对单个核细胞的浮力作用大于离心力的作用，所以使单个核细胞不会下沉，离心后依然位于分离液界面上，这样就可以分离获得单个核细胞。密度梯度离心分离单个核细胞的主要优点是：
(1)操作步骤比较简单，适合大量样本的分离；
(2)能够实现无菌操作，分离的单个核细胞适宜临床应用；
(3)对分离的单个核细胞的损伤较小。
正是由于密度梯度离心法具有的上述这些优点，才使得它作为最经典的细胞分离方法占有重要的地位，虽然新的细胞分离方法不断出现，但是，密度梯度离心法具备的这些优势是其他方法难以替代的。尽管如此，密度梯度分离法也受一些因素影响，其主要影响因素包括：
(1)分离液的化学组成成分及性质；
(2)将样本叠加在分离液液面上的操作技巧；
(3)离心力和离心时间；
(4)样本抗凝和被稀释比例；
(5)离心过程的温度控制。
分离液的化学组成和性质是决定分离效果的重要的因素，为此一些研究人员通过改变分离液的组成成分借此提高单个核细胞的分离效果，目前除了由聚蔗糖-泛影葡胺制备的分离液，人们也开发了由不同化合物组成的密度梯度分离液，比如由Percoll硅胶颗粒制备的连续或不连续的密度梯度分离液，这种分离液能选择性地分离某种类型的免疫细胞，并且可以提高分离的目的细胞的纯度。邹常春等(实验与检验医学，2009，27(4)：337-344)报道了一种改良的从全血中分离中性粒细胞的方法。2012年中国专利CN201110456878公布了一种复方淋巴细胞分离介质，配方中的全部原料均符合静脉注射级原料药的标准，原料的安全性高，分离的淋巴细胞纯度及淋巴细胞回收率与常规分离液比无显著差异。另外一项中国专利CN20121011408公布了由羟乙基淀粉替代右旋糖酐的细胞分离液的制备方法，这种组合方法进一步提高了分离液的生物安全性，使得分离的淋巴细胞状态更好，活力更高。
密度梯度离心法是根据各种血细胞之间的密度差异分离单个核细胞的，由于分离液的密度最接近目的细胞，因此，离心后这些细胞被富集在分离液的上面，形成一层浓集的目的细胞层。一般情况下通过优化离心力、离心时间等条件密度梯度离心法分离的目的细胞混有其他杂细胞的数量是可以控制的(郭继强，刘爱兵，沈丹等.中国组织工程研究与康复.2011，15(45)：8447-8450；樊卫平，宋玉靖，郝颜琴等，山西医科大学学报，2010，41(3)：274-284)。但是，任何改变分离液密度的因素都会影响密度梯度离心法的分离效果，分离液密度的变化不仅会影响分离的目的细胞的数量，还可能导致富集的目的细胞层中混入其他的杂细胞。为了不影响分离液的密度，除了离心时应控制适当的温度外，再有就是在加入样本时操作必需非常小心，不能让样本冲散分离液液面，如果有部分样本与分离液混合，势必会改变分离液的密度，影响分离效果。
密度梯度离心法的操作过程有以下几个步骤：(1)将样本(如外周血液)用细胞培养液或生理盐水1∶1～1∶2稀释，使各类细胞充分分散；(2)将1/2样本量的分离液加入离心管中；(3)用巴氏吸管将稀释样本沿离心管管壁缓慢加到分离液的上面，尽量保持加入样本与分离液液面清晰；(4)以500～1000g的离心速度离心20～30min；(5)用巴氏吸管吸取目的细胞层。上述第(3)、第(5)步骤是密度梯度离心法操作最繁琐的步骤，操作生疏者不容易掌握，对于操作熟练者也是一个繁琐、费力的事。
发明内容
为解决密度梯度离心法加样、取样操作繁琐问题，本发明的目的是：
(1)提供一种血细胞分离管；
(2)提供一种密度梯度离心法分离目的细胞新的操作方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方法：
提供一种血细胞分离管，所述的血细胞分离管由管体、旋盖、置于管体内的细胞分离隔膜和加样滑板组成。
所述的血细胞分离管管体是一个底部为半圆形或圆锥形的离心管，管口处有用于固定旋盖的外螺纹，其特征在于：分离管分离隔膜以上的一段长度3～5厘米管壁或分离隔膜至管口这部分管壁为相同内径的圆柱形结构。
分离管内接近分离管管底处固定一个分离隔膜。其特征是分离隔膜上有1个或1个以上等间距的小孔，各个孔的直径相同并且其孔径大小通过严格计算确定，其中所选的孔径为1～10mm。
小孔依轴心对称分布，使流体通过分离隔膜后流速均匀分布同时增加其流通系数。分离隔膜以下预留的容积为3～5ml。
分离管内有一个加样滑板，所述的加样滑板是根据流体力学的缝隙流动特性设计的辅助加样装置，它由一个圆盘和与圆盘边缘连接的∩型推杆组成，推杆的另一端设有一个椭圆形的推杆柄。
圆盘边缘与分离管内壁有一个狭窄的环形间隙，其特征是：环形间隙宽度经严格计算获得，其中所选的宽度为0.01～5mm。所选定的间隙宽度应确保在圆盘以上加入一定量的血液样本时，该液体在自身重力作用下不会通过环形间隙向下泄漏，并且，当改变圆盘的上下位置时，液体可以通过环形间隙自由流动。
为了满足上述要求，除了应考虑样本溶液(如血液)的表面张力性质外，制作加样滑板和分离管的材料也应该有所选择，本发明选择非极性或弱极性的高分子聚合材料，这些材料包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS以及SEBS其中的任意一种，这类材料的表面能低，润湿性差，所形成的缝隙能够利用液体的表面张力特性呈现自封闭性。
本发明还提供了一种使用上述血细胞分离管分离单个核细胞的方法，所述的方法包括：
(1)预充淋巴细胞分离液
将3～5ml淋巴细胞分离液注入上述血细胞分离管中。以1500～2000pmr的速度离心2～5min，使分离隔膜以下充满淋巴细胞分离液，注入的淋巴细胞分离液其液面应高于分离隔膜1～2cm，将加样滑板通过反向折叠的推杆臂悬挂在分离管的侧壁上，使圆盘底面恰好与注入的淋巴细胞分离液的液面在同一水平面高度。
(2)稀释样本
将待分离血液预先用1640培养液或生理盐水按照血液与稀释液1∶1或1∶2的比例稀释。
(3)加入样本
将稀释后的血液直接倒入分离管中。由于在分离液液面之上有加样滑板的阻挡，因此倒入的血液样本不会冲击滑板以下的分离液。
(3)样本与分离液叠加
将加样滑板缓慢移出分离管，样本则被叠加在分离液上面。向上推动椭圆形的推杆丙，分离管内的加样滑板在∩型推杆带动下向上移动，滑板上面的血液样本受到压力作用，滑板下形成连续的低压空隙，使滑板上下产生附加压力差，于是血液样本通过滑板边缘与分离管内壁形成的环形间隙流到滑板下面，加样滑板持续向上移动，血液样本则被缓慢叠加在分离液上面。
(5)离心
以500～1000g的离心速度离心20～30min。
(6)取样
将离心后的样本直接倒入另外一支试管中。在离心力场的作用下，分离管内的液体分成清晰的4层，分离隔膜以上依次是少部分分离液、单个核细胞层和血浆层，红细胞离心后沉积在分离隔膜以下分离管底。将分离隔膜以上的液体直接倒入另外一支清洁的试管中则完成取样操作。当分离管被倒置时，由于分离隔膜内的液体施加在每个小孔上的静压力远远低于大气压，加上液体的表面张力作用，分离隔膜内的液体不会通过小孔流出。
转移到新试管中的液体包含所有要分离的目的细胞、血浆及分布在血浆中的少量血小板，上述混合液通过洗涤、纯化最终可获得需要分离的单个核细胞。
本发明优点和积极效果在于：所提供的血细胞分离管与应用普通离心管分离单个核细胞的方法相比，简化了后者复杂的操作过程，其特征是使常规的必需应用巴氏吸管加样、取样操作简化了。
本发明所提出的加样滑板改变了传统的加样方式，使血液样本与分离液的叠加界面更清晰，并减少了不必要的失误。
在以下本发明实施方案中，为了提高目的细胞的收率，采用在分离隔膜上增加分离液的方式。因为有了加样滑板，加样时才可以直接倒入样本，这样不仅可以提高分离细胞的收获率，又仍然保持简化的加样操作的特点。
本发明所提供的血细胞分离管适用所有密度梯度分离介质，如将上述预充的Ficoll-Hypaque分离液用Percoll分离液代替，在应用Percoll连续的密度梯度分离方式时，加入分离液的方法与加入Ficoll-Hypaque分离液相同。本发明所提供的血细胞分离管更适用于Percoll不连续密度梯度法分离细胞，在利用Percoll不连续密度梯度法分离目的细胞时，可将密度较高的Percoll分离液加在分离隔膜以下，然后直接将密度较低的Percoll分离液倒入分离管的适当的高度即可，由于有分离隔膜的阻挡，不必担心高密度与低密度的Percoll分离液相互混合。
附图说明
图1是血细胞分离管的完整结构图。
图中1旋盖，2分离管管体，3推杆，4推杆柄，5加样滑板，6圆盘7分离隔膜
图2是实例1的操作示意图。
图中：(1)血浆层 (2)单个核细胞层 (3)分离隔膜 (4)红细胞层
图3是实例2的操作示意图。
图4是实例3的操作示意图。
具体实施方式
实例1本发明的一个应用方式是，不用加样滑板的情况下也可以按照简化的操作方法分离目的细胞。图2是本方案的示意图，在这项实施方案中可以将预分离血液样本直接倒入分离管中，在血液样本倒入分离管过程中，分离隔膜将阻止样本与分离液混合，选择2000转/分的离心速度离心20分钟，离心后红细胞通过分离隔膜沉积在分离管底，单个核细胞则被富集在分离隔膜以上的细胞分离液和血浆层之间，取样时将分离隔膜以上的液体直接倒入新的试管中即可。
表1 两种方法分离的淋巴细胞浓度、纯度和活力
表1是根据本方案分离得到的单个核细胞浓度、细胞纯度和细胞活力的统计结果，表中显示分离管组的细胞浓度比普通离心管组的数值低，这是少量目的细胞随红细胞一起在离心过程中被带入到分离隔膜以下的缘故，因而导致分离的目的细胞收率偏低。
实例2本发明另一种应用方式是：将加样滑板与普通离心管组合，可以简化加样过程。图3是本方案的示意图，在本实施方案中，在加入样本时同样将血液样本直接倒入离心管中，然后借助加样滑板将血液叠加在分离液面上，选择2000转/分的离心速度离心25分钟，离心后红细胞沉积在离心管底，用巴氏吸管吸取目的细胞层完成单个核细胞的分离。
表2 两种常规分离方法的淋巴细胞浓度、纯度和活力比较
表2是根据本方案分离得到的单个核细胞浓度、细胞纯度和细胞活力的统计结果，表中显示借助加样滑板一组分离的目的细胞浓度稍高于普通离心管方法。
实例3由于分离隔膜的限流作用，在离心力作用下，液体通过分离隔膜的流速会改变，为了减小流速的变化对分离效果的影响，本发明通过增加分离隔膜上小孔数量稳定流通系数，同时适当地增加分离液量，使加入的分离液高出分离隔膜1～2cm，分离隔膜以上的分离液起到稳定流速的作用，依此达到最佳的分离效果。图4是本方案的示意图，在本实施方法中借助加样滑板将样本叠加在分离液上面，然后向上移出加样滑板，选择2000转/分的离心速度离心25分钟，离心后红细胞通过分离隔膜沉积在分离管底，单个核细胞则被富集在分离隔膜以上的细胞分离液和血浆层之间，取样时亦将分离隔膜以上的液体直接倒入新的试管中即可。
表3 两种方法分离的淋巴细胞浓度、纯度和活力比较
表3是根据本方案分离得到的单个核细胞浓度、细胞纯度和细胞活力的统计结果，在这项实施方法中，分离隔膜上增加的分离液起到了稳定样本中血细胞的沉降速度的作用，从而提高了目的细胞的收率。
Claims (10)
1.一种血细胞分离管，该分离管由管体、旋盖、置于管体内的细胞分离隔膜和加样滑板组成。
2.根据权利要求1所述的血细胞分离管，其特征在于：分离管分离隔膜以上的一段长度3～5厘米管壁或分离隔膜至管口这部分管壁为相同内径的圆柱形结构。
3.根据权利要求1所述的血细胞分离管，其特征是分离管内接近分离管管底处固定一个分离隔膜。
4.根据权利要求1和3所述的血细胞分离管，其特征是分离隔膜上有1个或1个以上等间距的小孔，各个孔的直径相同并且其孔径大小通过严格计算确定，其中所选的孔径为1～10mm。
5.根据权利要求1和3所述的血细胞分离管，其特征是小孔依轴心对称分布。
6.根据权利要求1所述的血细胞分离管，其特征是分离管内有一个加样滑板，所述的加样滑板由一个圆盘和与圆盘边缘连接的∩型推杆组成，推杆的另一端设有一个椭圆形的推杆柄。
7.根据权利要求1和6所述的血细胞分离管，其特征是：圆盘边缘与分离管内壁有一个狭窄的环形间隙，环形间隙宽度经严格计算获得，其中所选的宽度为0.01～5mm。
8.根据权利要求1-7所述的血细胞分离管，其特征在于制作加样滑板和分离管的材料选择非极性或弱极性的高分子聚合材料，这些材料包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS以及SEBS其中的任意一种。
9.根据权利要求1-7的一种单个核细胞的分离方法，所述的方法包括：
(1)预充淋巴细胞分离液：
将3～5ml淋巴细胞分离液注入上述血细胞分离管中；
(2)稀释样本：
将待分离血液预先用1640培养液或生理盐水按照血液与稀释液1∶1或1∶2的比例稀释；
(3)加入样本：
将稀释后的血液直接倒入分离管中；
(4)样本与分离液叠加：
将加样滑板缓慢移出分离管，样本则被叠加在分离液上面；
(5)离心：
以500～1000g的离心速度离心20～30min；
(6)取样：
将离心后的样本直接倒入另外一支试管中。
10.根据权利要求1-8的方法和原理制作的其他产品。
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