CN104026150B - 一种预防和杀灭禽流感病毒的复合液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能长期预防和杀灭禽流感病毒H5N1和H1N1的复合液制备方法及应用。该复合液的配方：为1L纯水中,卡波姆凝胶940含量为1000～2000mg/L，三乙醇胺含量为1000～2000mg/L,苦参、黄柏、含量为1000～2000mg/L，桉油含量为4～6g/L,纳米银含量为1600～2500mg/L。所述纳米银为高纯度（9999）球形，粒径为1～5nm的单质纳米银粉末颗粒。本发明还公开了所述溶液的制备方法和应用，本发明的产品可用一般喷雾器稀释后银含量不超过1.17mg/L的低浓度喷洒应用。

Description

一种预防和杀灭禽流感病毒的复合液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种预防和杀灭禽流感病毒H5N1和H1N1的复合液及其制备方法和应用。

背景技术

H5N1是禽流感的一种亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H1、H5、H7、H9可以传染给人，其中H1、H5为高致病性，H5N1和H1N1为卫生部新传染病防治法中规定报告的法定传染病，又称人感染高致病性禽流感，1997年，首次从中国香港一3岁儿童的流感死亡病例标本中分离鉴定出。直到，它总共仅感染了大约600人，但它杀死了其中超过50％的人。而根据2012年5月于美国自然杂志上发表的一篇论文，禽流感病毒H5N1和H1N1是有可能在人际之间传播的。但由于流感病毒的高度变异性，故目前并没有高度有效的H5N1和H1N1病毒疫苗及其相应的治疗药物。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种能够长期预防和杀灭禽流感病毒H5N1和H1N1的复合液及其制备方法，以杀灭室外环境中特别是养殖场等高感染风险的地方的禽流感病毒H5N1和H1N1，预防疾病的发生；该复合液可用于制备预防和杀灭禽流感病毒的药物。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

每1L所述预防和杀灭禽流感病毒的复合液中含有如下重量的成份：

纳米银粉末 1600—2400 mg；

卡波姆940  1000—2000mg；

三乙醇胺  1000—2000 mg；

桉油      4—6g；

苦参      1000—2000 mg；

黄粉      1000—2000 mg；

其余为水；

所述纳米银粉末中银的纯度≥99.99%，银颗粒粒径为1—5nm，银颗粒形状为球形。所述禽流感病毒为H5N1和H1N1。

制备上述复合液的方法，包括如下步骤：

（1）按上述含量要求准备好纳米银粉末、卡波姆940、三乙醇胺、桉油、苦参、黄粉和水；

（2）将卡波姆940加入水中，分散15—25min，然后加入三乙醇胺，再加入纳米银粉末，混合后于超声波分散器中分散，得混合液；

（3）向混合液中加入苦参、黄柏和桉油，并用水调节各组分含量，使各组分达到上述含量范围；然后放入搅拌均质机中混合搅匀，得复合液前体；

（4）将复合液前体静置1—3 d，取上层液体，即为预防和杀灭禽流感病毒的复合液。

步骤（2）所述超声波分散器的频率为54～150 KHZ；步骤（3）搅拌均质机的搅拌功率为60—300W，转速为1000—3000 r/min，搅拌时间为3—5 h。

本发明还提供了上述复合液的使用方法，所述方法是将复合液稀释256倍以内（用一般喷雾器稀释即可），使银含量≤1.15mg/L，即可达到长期预防和杀灭禽流感病毒H5N1和H1N1的效果。

下面结合原理对本发明作进一步说明：

纳米银粉末是本发明复合液的主要成分，其发明杀灭禽流感H5N1和H1N1病毒的主要作用物质便是高纯度、小粒径（1～5nm）球形物理特性纳米银粉末，其材料物理特性的作用为：高强度：高纯度银具有高强度的抗菌能力，且安全性高；高效能：银粒径越小，其表面活性效能越高，抗菌效能越高；高稳定：由于球形粒子是同体积粒子最稳定的形状，因此，采用球形纳米银粒子，能最大限度克服小尺寸粒子趋稳定性引起的团聚效应，从而使纳米银在溶液获得最高的稳定性。由于上述三高（高强度、高效能、高稳定）的综合作用，使得纳米银在复合液效能成几何级数增加，从而可极大的减少其用量，使银这一重金属含量达到1.15mg/L以内，实现极低浓度的、安全、有效应用。

本发明中纳米银粉末的杀菌机理为：

损伤遗传物质复制酶：纳米银通过对细菌以及病毒的遗传物质DNA以及RNA的复制酶进行损伤破坏，令其降解，细菌及病毒遗传物质受到破坏便不能顺利复制下一代；

损伤遗传物质：由于纳米银的粒径小，可直接进入胞质破坏脱壳后的RNA碱基序列，令病毒的复制不能进行；

损伤病毒表面糖蛋白：活性的Ag+能与H5N1和H1N5病毒外膜上的致病因子红细胞凝聚素和神经氨酸苷酶结合导致其失去活性，以上两种致病因子都是糖蛋白，而病毒能令人体生病的主要因素便是外膜上糖蛋白的作用，故损伤了病毒外膜上的糖蛋白即是破坏了病毒的致病性。而纳米级的银，特别是粒径5nm以下的纳米银，有更良好的杀灭作用，因为病毒外膜上的糖蛋白相距一般大于22nm，5nm以下的纳米银能穿过并附在糖蛋白上起到长期损伤的作用。

本发明中, 卡波姆凝胶940作为分散剂，是以季戊四醇等与丙烯酸交联得到的丙烯酸交联树脂,在本发明复合液中作为一种载体，由于卡波姆凝胶940具有短流变性、高粘度、高清晰度，故本纳米银复合液使用卡波姆940，这能令产出的溶液拥有更高的清晰度，高粘度也能够更快更好地包裹上需要保护的纳米银粉体颗粒，之后使用100L气动升降均质机令其充分扩散到溶液的每一部分，使在纳米银粉末添加之后能迅速地对其进行包裹，对纳米银粉末颗粒形成一层保护层，防止其凝聚或氧化。

三乙醇胺在本发明复合液中起到一个分散和中和剂的作用，其最主要作用是与卡波姆940发生反应，产生一个增稠和保湿的作用，由于纳米银粉体在一个湿润的环境中能更好地发挥杀毒作用，故三乙醇胺的添加主要是保证纳米银粉末的一个良好地杀毒环境。于卡波姆充分分散之后再加入三乙醇胺，能够充分地与卡波姆反应，令整个液体都被增稠，这有助于添加纳米银之后能够令纳米银粉末颗粒沉降速度下降，悬浮在液体中的时间大大增长，卡波姆凝胶能够更为轻易地对纳米银粉末颗粒进行包裹。

当纳米银被添加进卡波姆及三乙醇胺的混合溶液中，会被初步包裹并悬浮于溶液中，然后使用超声波分散设备进行分散，因为超声波分散设备会发出高频的声波振动，这种声波振动会带动溶液中的每个分子剧烈的振动起来，每个分子之间互相摩擦、碰撞，产生高温、高压以及强冲击，高温会引起强烈的对流，高压令分子间变得不稳定，强冲击冲散分子，于是纳米银粉末便会被冲散，在分子间的撞击及对流的带引下，均匀的分布到溶液的每一个角落，更容易再次被卡波姆凝胶包裹，实现每个纳米银粉末颗粒都被单独包裹起来。

当纳米银粉末均匀地分散到溶液并被完全包裹起来之后，再添加纯水以及桉油、苦参和黄柏以令溶液达到指定的浓度，以减少其粘稠度，便于储藏和喷洒。其中桉油、苦参以及黄柏皆有清热去燥之效用，且桉油还含有温和的香味，并有一定的抗菌杀菌作用，对禽类健康有益，对纳米银杀菌、杀毒可起到辅助作用。

之后，普通搅拌3小时令溶液与纯水充分混合，使被包裹的纳米银粉末颗粒充分扩散至溶液中。

之后，再通过搅拌均质机对混合液以1000～3000转/分钟，进行复合搅拌，通过高强度的搅拌，利用动能将卡波姆与纯水分子结合起来，从而使密度不同的卡波姆和包裹在其中纳米银粉末与纯水分子之间复合成团，互相联系起来，溶液充分混合，令其中的纳米银粉末不容易沉淀凝聚成块。

由于纳米银被卡波姆所包裹且被高强度搅拌过后，与纯水分子充分复合，故绝大部分纳米银粉末于上层清液中悬浮，静置两天，当疏漏的少许没有复合或者包裹的卡波姆及纳米银沉淀后，所得上层淡黄色清液便是我们所需要的复合液成品。因此，本发明复合液外观为淡黄色透明溶液。

使用本发明复合液时，按如下步骤操作：

1）稀释：使用1700倍体积水（极安全的低浓度）兑入1L的2000PPM本发明复合液。

2）装瓶：将上述步骤产生的稀释液装入喷洒器中。

3）喷洒：对应消毒地方喷洒稀释液，保证每个地方都应该喷洒到。

4）清洗：喷洒完毕后清洗喷洒器具。

应每个月进行一次喷洒消毒工作以确保养殖场无病毒。

实验表明，本发明的复合液具有良好的预防和杀灭禽流感病毒的效果。银可以不断地放出能够杀菌抑菌的银离子，而当金属银制备到纳米级后，由于表面面积的大幅增加，杀菌性能更强，从而能够长期地杀灭禽流感病毒。由于纳米银的杀菌机理是其与细菌氧代谢酶的-SH巯基结合令细菌失去活性，是使菌体窒息而死的独特作用机制，而纳米银又由于表面活性的大幅提高及极微的颗径，可直接穿越包裹着H5N1和H1N1病毒的表面糖蛋白、脂膜及基质蛋白层形成的蛋白层，并同时与H5N1和H1N1病毒上的HA蛋白和N蛋白两种致病因子结合破坏其活性，令整个病毒结构和形态被破坏，从而失去致病性。纳米银还能干扰H5N1和H1N1 HA基因的扩增，令其不能顺利遗传复制，从而实现阻止其变异，从根本上消灭H5N1和H1N1病毒。

本发明公开了一种供养殖场使用，能高效杀灭禽流感病毒H5N1和H1N1的复合液，能遏制、防止禽流感病毒的变异，从而预防禽类的发病及抑制H5N1和H1N1病毒的传播。

附图说明

图1为实施例1至3所述复合液对H1N1的抑制能力图；

图2为实施例1至3所述复合液对H5N1的抑制能力图。

具体实施方式

实施例中所用纳米银粉末为纳米银5号（300PPm），批号：2012.07.26-5，由光谷纳米科技有限公司提供。

实施例1

1L预防和杀灭禽流感病毒的复合液中含有如下重量的成份：

纳米银粉末   2000 mg；

卡波姆940   1500mg；

三乙醇胺     1500 mg；

桉油         5g；

苦参         15000 mg；

黄粉         1500 mg；

其余为水；

所述纳米银粉末中银的纯度≥99.99%，银颗粒粒径为1—5nm，银颗粒形状为球形。

实施例2

1L预防和杀灭禽流感病毒的复合液中含有如下重量的成份：

纳米银粉末  2400 mg；

卡波姆940  1000mg；

三乙醇胺    2000 mg；

桉油        4g；

苦参        1000 mg；

黄粉        2000 mg；

其余为水；

所述纳米银粉末中银的纯度≥99.99%，银颗粒粒径为1—5nm，银颗粒形状为球形。

实施例3

1L预防和杀灭禽流感病毒的复合液中含有如下重量的成份：

纳米银粉末  1600mg；

卡波姆940   2000mg；

三乙醇胺     1000 mg；

桉油         6g；

苦参         2000 mg；

黄粉         1000 mg；

其余为水；

所述纳米银粉末中银的纯度≥99.99%，银颗粒粒径为1—5nm，银颗粒形状为球形。

实施例4

制备实施例1至3所述复合液的方法，包括如下步骤：

（1）将卡波姆940加入水中，用100L气动升降均质机进行分散分散15—25min，然后加入三乙醇胺，再加入纳米银粉末，混合后于超声波分散器中分散，得混合液；

（2）向混合液中加入苦参、黄柏和桉油，并用水调节各组分含量，使各组分达到所要求的含量；然后放入洗液搅拌均质机中混合搅匀，得复合液前体；

（3）将复合液前体静置1—3 d，取上层液体，即为预防和杀灭禽流感病毒的复合液。

其中，步骤（1）所述超声波分散器的频率为54～150 KHZ；步骤（2）洗液搅拌均质机的搅拌功率为60—300W，转速为1000—3000 r/min，搅拌时间为3—5 h。

实施例5

按实施例4制备出的复合液抗禽流感检测实验，实施例1至3所述复合液分别命名为纳米银1#、纳米银2#和纳米银3#。

1.      病毒

甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009(H1N1)

H5N1禽流感病毒（A/chicken/Henan/12/2004）

2.      复合液对MDCK细胞生长的安全浓度测定

用细胞维持液将复合液倍比稀释，然后将不同稀释度复合液加入MDCK细胞（犬肾细胞），37℃+5%CO2条件下培养MDCK细胞72小时，观察复合液对细胞的影响。另设不加任何药物的正常MDCK细胞为对照。最终以能维持细胞正常生长的最高稀释浓度作为复合液对细胞的安全浓度。

测试结果表明纳米银1#、2#和3#稀释256倍后，少量细胞脱落，未发现细胞生长异常，因此此稀释度为细胞安全浓度。

3.      复合液对病毒增殖的影响

待96孔细胞培养板中的MDCK细胞基本长成单层后，用PBS平衡盐溶液洗2次，将100ul 10^-1—10^-8倍稀释的H1N1或H5N1接种于MDCK细胞中，每个稀释度各4孔，然后等量加入安全浓度的复合液，每个稀释度的第8孔只加病毒，不加复合液，作为产生细胞病变的阳性对照；另选8个孔只加复合液，不加病毒，观察药物对细胞的影响；最后8孔为细胞正常对照，培养72小时后，检测每一孔的HA效价，按Reed-Muench法计算病毒的组织细胞半数感染量( TCID50)。

测试结果表明纳米银1#、2#和3#在细胞中有较强的抑制流感病毒增殖能力，纳米银1#使H1N1病毒滴度降低了10000倍，纳米银2#使H1N1病毒滴度降低了464倍，纳米银3#降低了3200倍（见图1），纳米银对H5N1病毒增殖的抑制能力与H1N1相当（见图2）。

Claims (7)

1.一种预防和杀灭禽流感病毒的复合液，其特征在于，每1L所述复合液中含有如下重量的成份：

纳米银粉末 1600—2400 mg；

卡波姆940  1000—2000mg；

三乙醇胺  1000—2000 mg；

桉油      4—6g；

苦参      1000—2000 mg；

黄粉      1000—2000 mg；

其余为纯水；

所述纳米银粉末中银的纯度≥99.99%，银颗粒粒径为1—5nm，银颗粒形状为球形。

2.如权利要求1所述的复合液，其特征在于，所述禽流感病毒为H5N1和H1N1。

3.一种制备如权利要求1所述复合液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）按权利要求1所述的含量要求准备好纳米银粉末、卡波姆940、三乙醇胺、桉油、苦参、黄粉和纯水；

（2）将卡波姆940加入水中，分散15—25min，然后加入三乙醇胺，再加入纳米银粉末，混合后于超声波分散器中分散，得混合液；

（3）向混合液中加入苦参、黄柏和桉油，并用纯水调节各组分含量，使各组分达到权利要求1所述的含量范围；然后放入搅拌均质机中混合搅匀，得复合液前体；

（4）将复合液前体静置1—3 d，取上层液体，即为预防和杀灭禽流感病毒的复合液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述超声波分散器的频率为54～150 KHZ。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）搅拌均质机的搅拌功率为60—300W，转速为1000—3000 r/min，搅拌时间为3—5 h。

6.如权利要求1或2所述复合液在制备预防和杀灭禽流感病毒H5N1和H1N1药物中的应用。

7.如权利要求1或2所述复合液的使用方法，其特征在于，所述方法是将复合液稀释后，使银含量≤1.17mg/L。